Meta-analizler, Böbrek Fonksiyonu ve Hasarıyla İlişkili DNA Metilasyonunu Tanımlar

edmund.chen@wecistanche.com

Kronikböbrek hastalığıönemli bir halk sağlığı yüküdür. Artmış idrar albümin-kreatinin oranı, aşağıdakilerin bir ölçüsüdür:böbrek hasarı,ve kronik teşhis ve evreleme için kullanılırböbrek hastalığı. ile ilgili düzenleyici mekanizmalar hakkındaki bilgileri genişletmekBöbrek fonksiyonuve hastalıkta, tahmini glomerüler filtrasyon hızı (n=33,605) ve idrar albümin-kreatinin oranı (n=15,068) için kan bazlı bir epigenom çapında ilişkilendirme çalışması yaptık ve tespit ettik 69 ve DNA metilasyonunun ilgili özellik ile ilişkili olduğu yedi CpG bölgesi. Bu bulguların çoğu, kronik hastalıkların ilgili klinik sonuçları ile yönsel olarak tutarlı ilişkiler göstermiştir.böbrek hastalığıve orta derecede artmış albüminüri. ile DNA metilasyonunun ilişkileriBöbrek fonksiyonuJAZF1, PELI1 ve CHD2'deki CpG'ler gibiböbrek dokusu. PHRF1, LDB2, CSRNP1 ve IRF5'te metilasyon,Böbrek fonksiyonu. Zenginleştirme analizleri, tahmini glomerüler filtrasyon hızı için hemostaz ve kan hücresi göçü ve immün hücre aktivasyonu ve idrar albümin-kreatinin oranı ile ilişkili CpG'ler için tepki ile ilgili yolları ortaya çıkardı.

Anahtar Kelimeler:böbrek hastalığı; böbrek hasarı; Böbrek fonksiyonu; böbrek dokusu; böbrek yapısı

kronikböbrek hastalığı(CKD) önemli bir halk sağlığı yüküdür. Dünya çapında yetişkinlerin yüzde 10'undan fazlasını ve 70 yaş ve üstü kişilerin yüzde 40'ından fazlasını etkiler1,2. KBH dünya çapında önde gelen bir ölüm nedenidir3 ve kardiyovasküler morbidite ve mortaliteye önemli bir katkıda bulunur2,4,5. CKD, anormalliklerin sürekli varlığı olarak tanımlanır.böbrekyapı veya işlev. buBöbrek fonksiyonuEn sık kullanılan ölçümler, genellikle serum kreatinin konsantrasyonlarından (eGFR) tahmin edilen glomerüler filtrasyon hızı ve idrar albümin-kreatinin oranıdır (UACR)6. Yükseltilmiş UACR,böbrek hasarı, CKD7'yi teşhis etmek ve evrelemek için kullanılır ve diyabetik ve hipertansif ile ilişkilidirböbrek hastalığı8. Orta derecede yüksek UACR bile, diğer hastalıklardan bağımsız olarak kardiyovasküler hastalıklar için bir risk faktörüdür.Böbrek fonksiyonu markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >ile ilişkili 400 genetik lokusBöbrek fonksiyonu10,12,13. Bilinen eGFR ile ilişkili lokuslardaki indeks varyantları, eGFR varyansının tahmini yüzde 8,9'unu açıklar12.Küçük tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler) 10 ile eGFR entegre açık kromatin bölgelerinin yakın tarihli bir GWAS meta-analizi. Bu çalışmanın sonuçları, CKD'ye katkıda bulunan bir mekanizma olarak değiştirilmiş transkripsiyonel düzenlemenin önemini desteklemektedir. DNA metilasyonunu araştırmak için,Böbrek fonksiyonueGFR ve CKD'nin epigenom çapında ilişkilendirme çalışmaları (EWAS) gerçekleştirilmiştir. Düşük maliyetli ve yüksek verimli bir şekilde değerlendirilebilen bir transkripsiyon düzenleyicisi olarak, DNA metilasyonu, tek bazlı çözünürlükle CpG bölgelerinde (CpG'ler) çalışılmıştır. Daha önce iki popülasyona dayalı çalışmadan 4859 yetişkin içeren bir EWAS yürüttük ve tam kanda eGFR14 ile ilişkili 18 doğrulanmış, farklı şekilde metillenmiş bölge belirledik. Bu çalışma, gen düzenleyici mekanizmaların içgörülerini ortaya çıkarmasına rağmen,böbrekfonksiyonu, ilişkili CpG'ler eGFR varyansının yalnızca yüzde 1,2'sini açıkladı. Diğer önceki çalışmalar, KBH hastalarına ve/veya diyabetli hastalara veya İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü enfeksiyonu olan hastalara odaklanmıştı veya küçük örneklem büyüklüğü, replikasyon eksikliği, potansiyel karıştırıcılar için eksik ayarlama veya bunların bir kombinasyonu ile sınırlıydı14-19. Diyabetik hastaların DNA metilasyon paternlerine odaklanan diğer çalışmalarböbrek hastalığı(DKD) hastalar20–22.

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK HASTALIĞINI İYİLEŞTİRECEK

Burada, bir EWAS gerçekleştirdik.Böbrek fonksiyonuCKD için potansiyel önemi olan gen düzenleyici mekanizmalarla ilgili ek CpG'leri tanımlamaya yönelik özellikler. Örnek boyutunu 33.605 kişiye önemli ölçüde artırarak eGFR ve CKD için eski EWAS'ı genişlettik. Ayrıca, UACR ve orta derecede artmış albüminüri (mikroalbüminüri) ek özellikler olarak dahil ettik. EWAS, cinsiyet, yaş, diyabet, hipertansiyon, vücut kitle indeksi (BMI), sigara içme durumu ve en bol beyaz kan hücresi oranlarına göre ayarlanan ağırlıklı olarak popülasyona dayalı çalışmalarda yürütülmüştür. EWAS sonuçlarımızı ayrı örneklerde çoğalttık, CpG bölgelerini farklı dokulardaki gen ekspresyon seviyeleriyle ilişkilendirdik, bulguları klinik sonuçlara uyguladık ve DNA metilasyonu ile DNA metilasyonu arasındaki nedenselliği değerlendirdik.Böbrek fonksiyonu(Ek Şekil 1).

Sonuçlar

Çalışma örneği özellikleri. Bu araştırmada, toplam 33.605 katılımcıyla yapılan 36 çalışma, eGFR'nin EWAS'ına ve UACR'nin EWAS'ına 15.068 katılımcı katkıda bulunmuştur. Havuzlanmış özellikleri Tablo 1'de gösterilmiştir ve bireysel çalışma açıklamaları Ek Veri 1 ve 2'de verilmiştir.

eGFR ve UACR'nin EWAS'ı.birlikteliğini araştırdık.böbrek441.870 CpG'ye kadar kanda DNA metilasyonu olan özellikler, bir çalışma dışında tümü tarafından ölçüm için kullanılan Illumina MethylationnEPIC BeadChip ve Illumina HumanMethylation450 BeadChip dizisi tarafından kapsanan CpG'lerin örtüşmesi (Ek Veri 3). Tüm çalışmalar, dizi veri temizliği gerçekleştirdi ve dizinin hazırlanması için merkezi olarak geliştirilen betikler uyguladı.böbrekönceden belirlenmiş çalışma protokollerini takiben bağımlı değişken olarak metilasyon değerleri ile birlikte değişken-ayarlanmış lineer regresyon modelleri kullanılarak daha sonra DNA metilasyonu ile ilgili olan özellik değerleri (bkz. Yöntemler). Çalışmaya özel EWAS'ta enflasyonun hiç olmadığını veya çok az olduğunu gözlemledik (eGFR ortalama enflasyon=1.00, UACR ortalama enflasyon=1.00, Ek Veri 1 ve 2). Çok değişkenli-ayarlanmış bir trans-etnik EWAS'ta, 69 CpG, eGFR ile önemli ölçüde ilişkilendirildi ve daha önce bildirilenler de dahil olmak üzere çoğaltıldı (Şekil 1A, Ek Veri 4, Yöntemlere bakınız). Kopyalanan siteler, net bir düşük metilasyon modeli gösterdi (60 CpGs, Pbinom=2.2E-10; Şekil 1A).

Şekil 1 eGFR ve UACR'nin EWAS sonuçları. Birleşik keşif ve replikasyon numunesi kullanılarak tahmini glomerüler filtrasyon hızı (eGFR) (A) ve idrar albümin-kreatinin oranı (UACR) (B) için epigenom çapında ilişkilendirme çalışmasının (EWAS) Chicago çizimleri. Bölgeler, y ekseninde sağlanan Wald-testinin –log10 P-değeri ile x ekseni üzerindeki kromozomal konumlarına göre sıralanır. Özellik ile pozitif korelasyonlu CpG'ler üst kısımda, negatif korelasyonlu siteler ise alt kısımda çizilir. Noktalı yatay çizgiler, önem düzeyini temsil eder (P-değeri < 1.1e-7).="" yeni="" kopyalanan="" alanlar="" turuncu="" renkte,="" bilinen="" kopyalanan="" alanlar="" turkuaz="" renkli="" ve="" ek="" olarak="" ilgili="" ikili="" özellik="" (kronik)="" ile="" ilişkilendirilen="">böbrek hastalığı[CKD]/ mikroalbüminüri [MA]) çarpı işaretiyle işaretlenmiştir.

Meta-analizde, cg17944885 (ZNF788,=−1.75E−04, P-value=8.7E−41), cg23597162 (JAZF1) dahil olmak üzere bilinen eGFR ilişkileri için en düşük P değerleri gözlemlendi. ,=−1.48E−04, P-değeri=3.2E−24) ve cg06158227 (ZSCAN29,=−1.08E−04, P-değeri=8 .7E−20)14, ardından cg20777437'de yeni bir bulgu (CDCP2,=-8.28E−05, P değeri=1.1E-17). 69 kopyalanmış eGFR ile ilişkili CpG'ler tek başına 1888 katılımcıdan oluşan ayrı bir çalışma örneğinde eGFR varyasyonunun yüzde 15.7'sini açıkladı (bkz. Yöntemler). İlişkilendirme modeline tüm ortak değişkenler (cinsiyet, yaş, diyabet, hipertansiyon, BMI, sigara ve beyaz kan hücresi oranları) eklendiğinde, eGFR'de açıklanan varyansın toplam oranı, 69 CpG'ye atfedilen yüzde 2,4 varyasyonla yüzde 36,3'e yükseldi. diğer değişkenlerden bağımsızdır.

UACR'nin trans-etnik analizinde, yedi CpG önemli ölçüde ilişkilendirildi ve kopyalandı (Şekil 1B, Ek Veri 5, bkz. Yöntemler). Bulgulardan cg18181703 (SOCS3,=−2.58E−03, P-değeri=2.6E−13) ve cg02711608 (SLC1A5,=-1.63) E−03, P-değeri=9.9E−13) en küçük meta-analiz ilişkisi P-değerlerine sahipti. Yedi CpG'nin altısında, daha düşük metilasyon, daha yüksek UACR ile ilişkilendirildi. Kopyalanan sitelerin sayısı nedeniyle, binom testinin gücü sınırlıydı (6 CpGs, pbinom=0.13; Şekil 1B). Çoğaltılan CpG'ler, UACR seviyelerindeki varyasyonun yüzde 3,9'unu ve tam modelin yüzde 14,6'sını açıkladı ve yüzde 0,07'si diğer ortak değişkenlerden bağımsız olarak CpG'lere atfedildi.

Hem eGFR (69 üzerinden=10 örtüşmesi; Ek Veri 4) hem de UACR (7 üzerinden=1 örtüşmesi; Ek Veri 5) için çoğaltılan EWAS ile daha önce bildirilen GWAS lokusları arasında düşük bir örtüşme vardı. eGFR ve UACR arasında, kandaki özelliğe özgü DNA metilasyon profillerini gösteren, kopyalanmış CpG'lerin örtüşmesi yoktu. Sırasıyla eGFR ve UACR için birleşik bir keşif ve replikasyon örneği meta analizinin 967 ve 270 anlamlı ilişkileri (P-değeri < 1e−05)="" arasında="" bile,="" her="" iki="" özellik="" arasında="" sadece="" 10="" bölge="" örtüşmüştür.="" tüm="" düşündürücü="" dernekler="" için="" bu="" meta-analizlerden="" elde="" edilen="" ayrıntılı="" sonuçlar,="" ek="" veri="" 6="" (egfr)="" ve="" 7'de="" (uacr)="">Ataların heterojenliği ve bulguların sağlamlığı. eGFR ve UACR üzerindeki ilişki sonuçlarının belirli bir ata tarafından yönlendirilip yönlendirilmediğini değerlendirmek için, bu ikisine katkıda bulunan çok sayıda çalışmanın sonuçlarıyla Avrupa soy (EA) ve Afrikalı Amerikalı soy (AA) örneklerinin soy-katmanlı EWAS meta analizini gerçekleştirdik. etnikler. EA (Negar=23,671; nUACR=9806) örneklerinde çoğaltılan CpG'lerin ilişkilendirme sonuçlarının AA örnekleri (neGFR =) ile karşılaştırılması

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05), SNP'lerin varlığının prob bağlanmasını etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için 69 kopyalanmış CpG'nin 50 bp'si içinde veya içinde değerlendirildi. Dört prob, ortak bir SNP'nin (Ek Veri 4; cg10960375-rs113564504; cg11544657-rs2083577; cg01817897-rs142643977; cg06930757-rs112223111) yakınına yerleştirildi, ancak, PhenoScanner V2 kaynağına göre herhangi bir GWAS özelliği ile ilişkili değildi (erişim 02/12/2021, pGWAS < 5e-8,="" eur="" r²=""> 0.8 olan proxy SNP'ler dahil)23. Bu, EWAS sonuçlarının, ilgili olduğu bilinen ortak bir özellik tarafından karıştırılma olasılığının düşük olduğunu gösterir.Böbrek fonksiyonuyakındaki DNA dizi varyasyonu ile. Sondanın 3′-ucundan itibaren beş bazdan daha fazla olan sonda-dahili SNP'lerin genellikle ihmal edilebilir sonuçlara sahip olduğu bulundu24.

CKD ve mikroalbüminüri ile ilişkisi.eGFR ile ilişkili 69 CpG'den 53'ü, tutarlı bir etki yönüne sahip 2376 vaka dahil olmak üzere 25,609 kişiden oluşan bir meta-analizde yaygın CKD ile de ilişkilendirilmiştir (P-değeri < 0).="" 05/69;="" ek="" veri="" 4,="" ek="" şekil="" 3a).="" egfr="" ve="" ckd="" etkileri="" arasındaki="" korelasyon="" yüksekti="" (r="-0.93;" şekil="" 3a).="" 551="" ckd="" hastasından="" oluşan="" bağımsız="" bir="" kohortta,="" 65="" cpg,="" egfr="" meta-analizi="" ile="" yönsel="" olarak="" tutarlıydı="" ve="" beş="" kopyalandı="" (p="" değeri="">< 0.05/69,="" r="0.77;" ek="" şekil="" 4,="" ek="" veri="" 4,="" bkz.="" yöntemler).="" aynı="" kohortta,="" egfr="" ile="" ilişkili="" cpg'ler="" cg18194850="" (p-değeri="1.6E−5)" ve="" cg07242931="" (p-değeri="2.3E−5)" de="" zaman="" ile="">böbrek yetmezliğiveya akutböbrek hasarı(Ek Veri 8, bkz. Yöntemler). UACR ile ilişkili yedi CpG'nin tümü, UACR ile aynı etki yönüne sahip 1186 vaka dahil 7279 kişiden oluşan bir örnekte mikroalbüminüri ile de önemli ölçüde ilişkiliydi (P-değeri < 0.05/7,="" r="" {{7})="" }.98;="" şekil="" 3b,="" ek="" veri="" 5,="" ek="" şekil="">

Gen ifadesi ile korelasyon. eGFR ve UACR ile ilişkili CpG'lerin olası işlevsel mekanizmaları hakkında bilgi edinmek için, DNA metilasyon seviyelerinin, kan monositlerinin yanı sıra tam kanda cis olarak kodlanan genlerin mRNA seviyeleri ile korelasyonunu test ettik (bkz. ). ZNF788 yakınında kromozom 19 üzerinde bilinen eGFR ile ilişkili cg17944885, 240 kb uzak çinko parmak proteini 439 (ZNF439, Tablo 2) tarafından kodlanan transkript ile ilişkilendirildi. Ek olarak, interferon düzenleyici faktör 5'te (IRF5) cg04864179'un metilasyonu, hem IRF5 tarafından kodlanan mRNA transkriptleri hem de yakındaki transportin 3 (TNPO3) ile ilişkilendirildi (Ek Şekil 5A). UACR ilişkilendirmelerinden, çözünen taşıyıcı aile 1 üye 5'teki (SLC1A5) iki kopyalanmış CpG'ler cg02711608 ve cg22304262, SLC1A5 mRNA seviyeleri ve cg23570810 ile interferon kaynaklı transmembran protein 1'de (IFITM1) transkriptleri ile cis (Tablo) ile önemli ilişkiler ortaya çıkardı (Tablo 2). Gen ekspresyonu analizinin tüm sonuçları Ek Veri 9'da verilmiştir.

Böbrek dokusundaki etkiler.Kanda gözlenen metilasyon etkilerininböbrek dokusu,eGFR veböbreksırasıyla 506 mikrodissected fibrozisböbrek dokusuörnekler. Bu örneklerde,böbrek- JAZF1'de cg23597162 cg23597162'nin PELI1 yakınında cg26099045 ve CHD2'de cg12644285'in doku bazlı DNA metilasyonu, kandaki ile aynı etki yönüne sahip eGFR ile önemli ölçüde ilişkiliydi (Ek Şekil 6A, Tablo 2, Ek Veri 10) . Ayrıca, PELI1'de aynı CpG ve altı ek

siteleri (LRRC8D'de cg20146909, FAM46C yakınında cg25767870, ZBTB7B'de cg16618493, RPEL yakınında cg10632966, NOD2'de cg01068906 ve GDPD3'te cg03297731)böbrektutarlı (yani, ters) etki yönlerine sahip doku örnekleri (Ek Şekil 6B, Tablo 2). Çoğaltılan UACR bölgelerinden, DNA metilasyon seviyeleriböbrekPTBP3'te cg00008629 ve IER3'e yakın cg24859433 dokusu fibroz ile ilişkilendirildi ve aynı etki yönünü gösterdi (Ek Şekil 6D, Tablo 2). EWAS bulgularıyla uyumlu olarak, böbrek numunesi donörlerinde UACra ile İlişkili CpG'lerin eGFR ile anlamlı bir ilişkisi bulunmadı (Ek Şekil 6C, Ek Veri 10).

DNA metilasyonu ile DNA metilasyonu arasındaki nedensel etkilerBöbrek fonksiyonuözellikler. olup olmadığını değerlendirmek içinBöbrek fonksiyonuözellikler DNA metilasyonunu nedensel olarak etkiler veya tam tersi, önemli ölçüde ilişkili CpG'lerin çift yönlü iki örnekli Mendel rastgeleleştirme (MR) analizini gerçekleştirdik. İleri yönde MR analizi, CpG'lerin cg02304370 (PHRF1), cg04460609 olduğunu önerdi. (LDB2), cg00501876 (CSRNP1) ve cg04864179 (IRF5) eGFR seviyelerini nedensel olarak etkiler (Tablo 3). Bu dört CpG'nin kalıtım derecesi tahminleri, Avrupa kökenli popülasyonlardan elde edilen üç veri seti arasında farklılık gösteriyordu, ancak üç çalışmanın her birinde değerlendirilen tüm CpG'ler genelinde ortalama kalıtsallıktan tutarlı bir şekilde daha yüksekti: 0,34 (nedensel eGFR CpG'ler) ve 0,16 (HM450K dizisi) Hannon ve ark.25, Dongen ve ark.26 için 0,55'e karşı 0,19 ve McRae ve ark.27 için 0,51'e karşı 0,19'a dayalıdır. UACR ile ilişkili CpG'ler için hiçbir önemli nedensel ilişki tanımlanmadı. Ters MR için tek önemli etki, birincil ters varyans yöntemini kullanırken cg23597162 (JAZF1) üzerindeki eGFR'ninkiydi. Bununla birlikte, çoklu ters MR duyarlılık analizlerinde hiçbir önemli etki tanımlanmadı/gözlenmedi. Birini dışarıda bırakma analizleri, MR sonuçlarının tek bir SNP tarafından yönlendirilebileceğine dair herhangi bir gösterge göstermedi. Ayrıca, tip 2 diabetes mellitus ile ilişkili SNP'lerin, diyabet için majör bir risk faktörü olduğu hariç tutulmuştur.böbrek hastalığıfarklı bulgulara yol açmamıştır. Tüm birincil ve duyarlılık MR analizlerinin sonuçları Ek Veri 11 ve 12 ve Ek Şekil 7'de gösterilmektedir. Duyarlılık analizleri, önemli ileri MR sonuçlarının (FDR < 0.05,="" yöntemlere="" bakınız)="" birincil="" bulgularını="" destekler.="" dna="" metilasyonundan="" egfr'ye="" kadar="" potansiyel="" olarak="" nedensel="" ilişkileri="" gösteren="" yön="" tutarlı="" etki="" tahminleri,="" ancak="" bunun="" tersi="">

Transkripsiyon faktörü bağlama, histon işareti ve yol zenginleştirme analizleri. eGFR (Pdeğeri < 1e−05;="" ek="" veri="" 6)="" ile="" anlamlı="" ilişki="" gösteren="" 967="" cpg'ye="" ve="" uacr="" ile="" anlamlı="" ilişkiler="" gösteren="" 270="" cpg'ye="" (p="" değeri="">< 1e−5;="" ek="" veri="" 7)="" zenginleştirme="" analizlerinin="" istatistiksel="" gücünü="" en="" üst="" düzeye="" çıkarmak="" için="" meta-analizde="" (bkz.="" yöntemler)="" 14="" ilk="" olarak,="" egfr="" ile="" ilişkili="" cpg'lerin="" tercihen="" kromatine="" dayalı="" 169="" transkripsiyon="" faktörünün="" (tf'ler)="" bağlanma="" bölgeleriyle="" eşlenip="" eşlenmediğini="" değerlendirdik.="" encode="" projesinden="" elde="" edilen="" ve="" 91="" insan="" hücre="" tipinde="" (161="" tf="" izi)="" bir="" konsensüs="" çağrısıyla="" toplanan="" ve="">böbrekdoku tabanlı izler (bkz. Yöntemler). 169 TF için çoklu test düzeltmesinden sonra, sekiz TF, eGFR ile ilişkili CpG'ler (FDR < 0.05;="" şekil="" 4a,="" ek="" veri="" 13),="" cebpb="" (p-değeri="1)" ​​için="" önemli="" ölçüde="" zenginleşti.="" 75e−06,="" çapraz="" doku="" izi)="" ve="" ep300="" (p-değeri="7.49E−09," çapraz="" doku="" izi).="" bu,="" chu="" ve="" ark.14'ün="" burada="" analiz="" edilen="" 33.605="" katılımcıdan="" 4859="" katılımcıdan="" oluşan="" daha="" küçük="" bir="" alt="" kümedeki="" bulgusu="" ile="" tutarlıdır.="" uacr="" ile="" ilişkili="" cpg'ler,="" polr2a="" (p-değeri="6.93E−19)," fos="" (p-değeri="" {{32)="" için="" en="" güçlü="" ilişki="" ile="" 56="" tf'nin="" (şekil="" 4b,="" ek="" veri="" 14)="" bağlanma="" bölgelerinde="" zenginleştirildi.="" }}.28e−12)="" ve="" ep300="" (p-değeri="">

Böbrek-fonksiyonla ilişkili CpG'ler, birkaç histon işareti için geniş ölçüde zenginleştirildi, eGFR için 82'si 195 histon işareti hücre tipi kombinasyonu önemli (FDR q < 0.05)="" (şekil="" 4c,="" ek="" veri="" 15)="" ve="" 79="" 195="" uacr="" için="" (şekil="" 4d,="" ek="" veri="" 16).="" aktif="" ve="" hazırlanmış="" geliştiricilerde="" yoğunlaşan="" bir="" işaret="" olan="" histon="" modifikasyonu="" h3k4me1,="" uacr="" ile="" ilişkili="" cpg'ler="" için="" tüm="" hücre="" tipleri="" ve="" egfr="" ile="" ilişkili="" cpg'ler="" için="" hemen="" hemen="" tüm="" hücre="" tipleri="" için="" zenginleştirildi.="" uacr="" ile="" ilişkili="" cpg'ler,="" 34="" hücre="" tipinde="" promotör="" işareti="" h3k4me3="" için="" zenginleştirme="" gösterirken,="" sadece="" dört="">

türleri, eGFR ile ilişkili siteler için zenginleştirme gösterdi. Tersine, gen gövdesiyle ilişkili işareti H3K36me3, eGFR ile ilişkili CpG'ler (30 hücre tipi) için UACR ile ilişkili CpG'lerden (beş hücre tipi) çok daha geniş bir zenginleştirme gösterdi. Hepsi aktif genlere (arttırıcılar, aktif promotörler, aktif transkripsiyon) bağlı olan H3K3me1/3 ve H3K36me3'ün aksine, genellikle yapısal ve fakültatif heterokromatin28-31 ile ilişkili olan H3K9me3 ve H3K27me3, UACR- için önemli ölçüde zenginleştirilmemiştir. test edilen herhangi bir hücre tipinde ilişkili CpG'ler (Şekil 4D, Ek Veri 16). ile ilgili genlerin zenginleştirilmesiBöbrek fonksiyonu-ilişkili CpG'ler, Gen Ontology (GO), Kyoto Genler ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) ve Reactome veritabanlarında (bkz. Yöntemler)32-35 değerlendirildi. eGFR için 27 terim (25 GO, bir KEGG, bir Reactome; Ek Veri 17, Şekil 5A) ve UACR için 91 terim (87 GO, dört Reactome; Ek Veri 18, Şekil 5B) için önemli zenginleştirme gözlemlendi (Şekil 5B). 5B). Beyaz kan hücresi tipine özgü göç, mRNA translasyonu, hemostaz ve pıhtılaşma ve ayrıca insülin yanıtı ile ilgili yollar, eGFRa ile ilişkili CpG'ler için önemli bir zenginleşme gösterdi (FDR < 0.05;="" şekil="" 5a).="" uacr="" ile="" ilişkili="" siteler="" için="" en="" düşük="" zenginleştirme="" p="" değerlerine="" sahip="" yolaklara,="" immün="" hücre="" aktivasyonu="" ve="" yanıtı="" ve="" interferon="" ile="" ilgili="" yollar="" hakim="" olmuştur="" (şekil="" 5b).="" zenginleştirilmiş="" ek="" yollar,="" egfr="" sonuçlarında="" olduğu="" gibi="" beyaz="" kan="" hücresi="" göçünü="" içeriyordu="" (ek="" veri="">

Diğer özelliklerle bilinen EWAS ilişkileriyle ilişkisi. Bağışıklık tepkisi ile ilgili yolların gözlemlenen zenginleşmesi, interferon yolunun genlerine yakın CpG'leri içeren DNA metilasyon sonuçları ve DNA metilasyon durumunun ağırlıklı olarak lökositlerde değerlendirildiği gerçeği göz önüne alındığında, bulgularımızın kafa karıştırıcı etkilerinden kaynaklanıp kaynaklanmadığını değerlendirdik. bağışıklık tepkisi veya inflamasyon durumu. Bu nedenle, yüksek duyarlı serum C-reaktif protein (CRP) seviyelerinde büyük bir EWAS'ta çoğaltılan CpG'lerin bir aramasını gerçekleştirdik36. DNA metilasyonu ve eGFR ile de ilişkili olan sadece iki CpGböbrek dokusu,BDH1'de cg09610644 ve CHD2'de cg12644285, CRP ile ilişkili siteler arasındaydı. Bu nedenle, CRP tarafından tahmin edildiği gibi inflamatuar durum yoluyla sonuçlarımızın genel olarak karıştırılması olası görünmemektedir.

BazılarıBöbrek fonksiyonuBu çalışmada tanımlanan -ilişkili CpG'ler, yayınlanmış EWAS'a dayalı diğer bazı özelliklerle ilişkilidir. Yirmi bir eGFR bölgesi kan basıncı, alkol tüketimi, BMI, cinsiyet, çözünür tümör nekroz faktör reseptörü 2 ve/veya sigara içme durumu ile ilişkilendirildi ve beş UACR bölgesi daha önce alkol tüketimi, sigara içme durumu, BMI, eğitim düzeyi, -glutamil transferaz, çözünür tümör nekroz faktör reseptörü 2, tip 2 diabetes mellitus ve/veya birkaç serum metaboliti (Tablo 2, Ek Veri 19). Bu CpG'lerden üçü (tüm UACR siteleri), ikiden fazla özellikle ilişkilendirilmiştir, yani SLC1A5'te cg02711608 (-glutamil transferaz, -glutamiltreonin, BMI, alkol tüketimi ile), SOCS3'te cg18181703 (tip 2 diabetes mellitus, sigara içme durumu, BMI ile) , çözünür tümör nekroz faktör reseptörü 2) ve IER3'e yakın cg24859433 (sigara içme durumu, eğitim düzeyi, 4-vinilfenol_sülfat ile). Ek Şekil 5B, eGFR ve fibrozis ile ilişkili olan bir CpG, cg26099045'i örneklemektedir.böbrek dokusubizim analizimizde ve ayrıca önceki EWAS'ta seks ve sigarayla ilişkili. Son olarak, ZNF788'deki cg17944885, bir DKD hastaları örneğinde de eGFR ile ilişkilendirilmiştir22.

Tartışma

Bu EWAS'taBöbrek fonksiyonueGFR ile ilişkili 69 CpG'nin kan DNA metilasyon seviyelerini belirledik ve çoğalttık. Bunlardan 60 site, UACR ile ilişkili olarak tanımlanan yedi CpG'nin tümü gibi daha önce bildirilmemiştir. eGFR ve UACR ile ilişkili CpG'lerin çoğu, klinik sonuçlarıyla, yani, CKD ve mikroalbüminüri ile de önemli ölçüde ilişkiliydi ve bu nedenle, risk altındaki bireylerin sınıflandırılması için potansiyele sahip olabilir. Bu 69 CpG'lere atfedilen eGFR'nin varyansı yüzde 2,4 idi - önceki bir EWAS14'ün iki katı ve GWAS tarafından keşfedilen ve lokus keşfi için üç kat daha yüksek örnek boyutu içeren 29 SNP tarafından açıklanan varyansla karşılaştırılabilir 37,38. Bu, kandan ölçülen bireysel CpG'lerdeki diferansiyel DNA metilasyonunun, verilen numune boyutunda bireysel ortak SNP'lerden daha fazla eGFR varyansını açıkladığını göstermektedir. UACR için, benzer sayıda özellikle ilişkili CpG'leri ortaya çıkarmak için eGFR'ye kıyasla daha büyük örnek boyutlarının gerekli olduğu görülmektedir. UACR hesaplaması için albümin ve kreatinin, GFR tahmini için serumdan kreatinin miktarının belirlenmesine karşıt olarak idrarda ölçüldüğü için, bu fark beklenmedik değildir ve bu özelliklerin GWAS gözlemleriyle uyumludur10,13. Ayrıca, genetik varyasyonun etkilendiği görülmektedir.Böbrek fonksiyonuDNA metilasyonundaki değişikliklerden farklı yollar yoluyla özellikler. Bu, hem eGFR hem de UACR için çoğaltılan EWAS ve GWAS siteleri arasındaki düşük örtüşme ile desteklenir.

Bu EWAS meta-analizi, farklı popülasyonlardan ve etnik kökenlerden örnekler içeriyordu. EA bireylerinin büyük alt örneğinden elde edilen etki tahminleri ile AA bireylerinde tahmin edilen etkiler arasında yüksek bir korelasyon gözlemledik (Şekil 2). EA dışı soydan gelen önemli sayıda bireyden elde edilen verilerin dahil edilmesine rağmen, etnikler arası EWAS'ın genel sonuçları, yüzde 70 (eGFR) / yüzde 65'i (UACR) temsil eden EA soyundan gelen bireylerden alınan veriler tarafından yönlendirilebilir. çalışmamızın (Ek Veri 3 ve 4). Bu sınırlamayı ele almak için, soy heterojenliğinin güvenilir ve ayrıntılı bir değerlendirmesi için artan oranda EA dışı numunelerle gelecekteki analizlere ihtiyaç vardır. Çoğunlukla popülasyona dayalı çalışmalarda kantitatif özelliklerin EWAS'ından elde edilen bilgileri hastalığa sahip kişilere çevirme potansiyeli, 551 CKD hastasından oluşan bir kohortta 69 eGFR ile ilişkili CpG'nin 65'inde etki tahminlerinin aynı yönde gözlemlenmesi gerçeğiyle gösterilmektedir. geniş bir eGFR seviyeleri aralığında uygulanabilir mekanizmalara işaret ediyor (Şekil 3). Dahası,

MAN1C1'deki cg07242931 ve SUCLG2'deki cg18194850, yalnızca eGFR ile ilişkili değildi, aynı zamandaböbrek yetmezliğiveya akutböbrek hasarı(Ek Veri 8). Süksinil-CoA sentetazın -alt birimini kodlayan SUCLG2'nin böbrek hastalığına dahil olduğuna dair daha fazla kanıt, diyabetik bir GWAS tarafından önerildi.böbrek hastalığıAmerikan Kızılderililerinde (SNP=rs4453858, P-değeri=2E−6)39. Bu gendeki genetik çeşitlilik aynı zamanda idrardaki süksinil-karnitin seviyeleri ile de ilişkilendirilmiştir (C4DC, SNP=rs115560420, P-değeri=7E-15)40. C4DC, süksinil-CoA sentetazın katılımı altında katalize edilen trikarboksilik asit döngüsünden ve daha düşük bir eGFR41 ile ilişkili kandaki daha yüksek C4DC seviyelerinin metabolik bir ürünüdür. Bununla birlikte, GoDMC'nin (http://www.godmc.org.uk)42 metilasyon nicel özellik lokusları (meQTL) sonuçlarında bir arama, bu iki SNP'nin cg18194850 ile önemli bir ilişkisini ortaya koymadı, bu SNP'ler arasında doğrudan bir bağlantı olmadığını gösterdi. ve CpG sitesi.

DNA metilasyonu, gen ekspresyonunun ana düzenleyicisi olduğundan, özellikle ilişkili DNA metilasyon bölgelerinin cis'deki mRNA gen seviyeleri ile korelasyonunu değerlendirdik. mRNA seviyeleri önemli ölçüde ilişkili olan genlerBöbrek fonksiyonuilişkili DNA metilasyon bölgeleri, interferon yollarıyla ilişkiliydi (hem eGFR hem de UACR için). Bu bulgular UACR için yol zenginleştirme sonuçlarıyla aynı fikirde olsa da (Şekil 5B, Ek Veri 18), UACRa ile ilişkili CpG'ler ve transkript seviyeleri arasındaki anlamlı korelasyonların sayısı oldukça düşüktür. Bu analiz için mevcut olan 1915 kişiden oluşan nispeten küçük örneklem büyüklüğü ve transkriptomik kaynağın sınırlı kapsamı göz önüne alındığında, bu şaşırtıcı değildir. İlginç bir şekilde, UACR için önemli bulgular arasında, çözünen taşıyıcı aile 1 üye 5'teki (SLC1A5) iki CpG, diferansiyel gen ekspresyonu ve ayrıca kan basıncı ile ilişkilendirildi. Sodyum bağımlı bir nötr amino asit taşıyıcısını kodlayan SLC1A5'teki DNA metilasyonu, bu nedenle UACR ve kan basıncı arasındaki bilinen korelasyona katkıda bulunan ek bir unsur olabilir.

Önemli diferansiyel olarak eksprese edilen transkriptler her zaman en yakın gen tarafından kodlanmadı (ZNF788'e yakın cg17944885) veya bir CpG bölgesi cis'deki çoklu genlerle korele edildi (IRF5'te cg04864179). Özellikle, cg04864179'daki DNA metilasyonunun IRF5 transkript seviyeleri ile korelasyonu dikkate değerdir. Bu CpG'nin eGFR ile önemli MR sonucu göz önüne alındığında, IRF5'teki DNA metilasyonu, gen ekspresyonunun aracılık ettiği eGFR'yi nedensel olarak etkileyebilir. Altta yatan genetik ilişkilerin özellik dönüşümünü hesaba katarak (bkz. Yöntemler), DNA metilasyonundaki on standart sapma artışının yüzde 3,2 daha yüksek eGFR ile sonuçlandığını gözlemledik. Bu tahmini etki çok küçük olmasına rağmen, kan hücrelerindeki metilasyon paternlerinin CKD üzerindeki nedensel etkisi, yakın tarihli bir çalışmada farklı bir meQTL veri seti ile özet tabanlı MR tarafından da desteklenmiştir; burada nedensel etki, sonuçlarımızla yönsel olarak tutarlıdır22. Çok özellikli kollokalizasyon uygulayarak, bu lokusun eGFR üzerindeki genetik etkilerine IRF5 metilasyonu ve kandaki gen ekspresyonu aracılık ettiğini de gösterdiler. Ayrıca, IRF5 gen ekspresyonunun eGFR ile kolokalizasyonu, hem tübüler hem de glomerüler kompartmanlarda gösterilmiştir.böbrekdoku43. Ancak çalışmamızda gözlemlenen nedensel etkiyi yorumlarken, CpG cg04864179 için MR analizlerinin araçlar arasında önemli heterojenlik (p < 0.05)="" gösterdiği="" unutulmamalıdır="" (ek="" veri="" 11="" ve="" ek="" şekil="" 7).="">

IRF5, interferon düzenleyici faktör (IRF) ailesinin bir üyesini kodlar. IRF ailesi üyeleri grubu, bağışıklık sistemi aktivitesinin modülasyonu, büyüme ve farklılaşmanın yanı sıra viral enfeksiyonlara interferon yanıtı için gen ekspresyonunun kontrolü gibi farklı rollere sahip transkripsiyon faktörlerini içerir. IRF5, bağışıklık hücresi tepkisini etkileyebilir. Birden fazla çalışma, IRF5 metilasyonundaki değişikliklerin etkileyebileceğini desteklemektedir.Böbrek fonksiyonubağışıklık yolları aracılığıyla: IRF5'teki SNP'ler, kan monositlerinde IRF5 ekspresyonundaki değişiklikler yoluyla SLE ile ilişkilidir44-46. SLE, IFN yolunun aktivasyonu ile karakterize edilen otoimmün bir hastalıktır.böbreklerlupus nefriti 47. Lupus nefritinin başlangıcından ve şiddetinden korunan bir SLE fare modelinde IRF5 hiperaktivasyonunun inhibisyonu ve geliştirilmişBöbrek fonksiyonuve patoloji48,49. EWAS'ımız SLE hastalarının çalışmasına odaklanmasa da, IRF5 metilasyonunun böbrek ile ilgili sonuçlar üzerindeki, en azından kısmen ekspresyonu ve müteakip IFN yolaklarının aracılık ettiği küçük etkileri, genel popülasyonda eGFR üzerindeki etkiler olarak saptanabilir.

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK AĞRILARINI İYİLEŞTİRECEK

DNA metilasyonunun kan hücrelerinden ölçüldüğü eGFR ile ilişkili CpG'lerin birçoğu da eGFR ile ilişkilendirildi veböbrekDNA metilasyonu nicelleştirildiğinde fibrozböbrekdoku, ancak örnek boyutu EWAS veri kümesine kıyasla önemli ölçüde daha küçüktü. Bu, kandan elde edilen bulguların en azından bir kısmının, ek bir özelliğe özgü hedef dokuya çevrilebileceğini düşündürmektedir. Burada kan veböbrekiki ana özelliğe özgü hedef dokudur, çünküişlevarasındaböbrekatıkları uzaklaştırmak için kanın süzülmesidir. zenginleştirme analizleriBöbrek fonksiyonuilişkili CpG'ler, transkripsiyonel düzenlemede merkezi bir rol gösterdi. H3K4me1/3 ve H3K36me3'ün yaygın şekilde zenginleştiğini bulduk. H3K4me1/3, aktif promotörlerin yanı sıra prime edilmiş ve aktif geliştiricilerle bağlantılıdır ve H3K36me3, genomun 50 kopyalanmış bölgeleriyle sıkı bir şekilde ilişkilidir. Transkripsiyonel düzenlemenin rolü, ökaryotlarda ana enzim sentezleyen mRNA'nın en büyük alt birimi olan POLR2A olan UACR ile ilişkili CpG'lerin en güçlü transkripsiyon faktörü zenginleştirme sinyali tarafından da desteklenir.

MR analizleriyle ilgili potansiyel sınırlamalar, ileri MR için tüm CpG'ler için geçerli araçların mevcut olmamasını içerir. Bir CpG'nin tüm aletlerinin cis bölgelerinden, yani aynı genetik bölgeden seçildiği göz önüne alındığında, bir CpG'nin tüm aletlerinin geçerli veya geçersiz olması muhtemeldir, bu nedenle, testi test etmek için uygulanabilecek farklı MR yöntemlerinin sayısını sınırlar. sonuçların sağlamlığı51. SNP-DNA metilasyon ilişkilerinin tahmini için mevcut olan küçük örnek boyutu nedeniyle ters MR'nin gücü sınırlıydı. GoDMC gibi daha büyük meQTL çalışmaları, teknik nedenlerden dolayı tüm SNP'ler için ilişkilendirme sonuçlarını depolayamadı (yani, belirli bir ilişkilendirme P-değeri kesmesinin üzerinde) ve bu nedenle iki örnekli ters MR için kullanılamadı. Bu nedenle, anlamlı olmayan bulgular dikkatle yorumlanmalıdır. Ek olarak, altta yatan genetik ilişkiler DNA metilasyon seviyelerinin standart sapma ölçeğinde hesaplandığından, nedensel etki boyutunun yorumlanması zordur. Çalışmanın bir başka potansiyel sınırlaması, eGFR, CKD ve UACR'nin farklı temel parametrelerden tahmin edilen fenotipler olması ve çok faktörlü etkilere sahip olmasıdır. Bu nedenle, EWAS sonuçlarımızın, DNAm ile DNAm veBöbrek fonksiyonu. İlk olarak, her bir kohorttaki EWAS ilişkileri, kafa karıştırıcıların bir kohort içindeki etkilerini ortadan kaldırmaları için ayarlandı. İkincisi, EWAS her kohortta ayrı ayrı gerçekleştirildi ve ardından meta-analiz edildi, bu da örneğin kohortlar arasında diyabet prevalansı için bir düzenlemeye karşılık gelir. Son olarak, yayınlanmış diyabet EWAS çalışmalarında çoğaltılmış CpG'lerimizin ilişkilerini kontrol ettik. Tüm çoğaltılmış CpG ilişkilerimizden yalnızca SOCS3'teki UACR ile ilişkili CpG cg18181703, tip 2 diyabet ile bir ilişki gösterdi. Bu CpG ayrıca sigara içme durumu, BMI ve çözünür tümör nekroz faktör reseptörü 2'nin kan seviyeleri ile de ilişkiliydi. tip 2 diyabet, BMI ve sigara içme durumundan en azından kısmen bağımsız. Bu bilinen faktörlerin birçoğunu kontrol etmemize rağmen, ölçülmeyen ortak değişkenler gibi diğer faktörler analizlerde açıkça ayarlanamadı ve bulguları etkileyebilir.

Artan numune boyutları ve ilave dokulardan ölçülen DNA metilasyonu ile daha fazla EWAS çalışmasına ve ayrıca fonksiyonel analizlere ihtiyaç duyulmaktadır.Böbrek fonksiyonuve nihayetinde tahmin ve tedaviyi iyileştirmek içinböbrekhastalık. Bu, gözlemlenen anlamlı CpG ilişkilerinin daha düşük sayısı göz önüne alındığında, özellikle UACR için geçerlidir. Özetle, bu büyük ölçekli EWAS meta-analizi, eGFR ve CKD ile tekrarlanabilir şekilde ilişkili CpG'lerin sayısını önemli ölçüde genişletti ve UACR ve mikroalbüminüri için yedi ilişki ortaya çıkardı. Bu bölgelerdeki DNA metilasyonu, eGFR varyansının büyük bir bölümünü açıkladı ve dört CpG'deki diferansiyel metilasyon, eGFR ile potansiyel bir nedensel ilişki için kanıt gösterdi. KBH'li hastalarda replike edilmiş CpG'lerin kapsamlı karakterizasyonu,böbrek dokusu,diferansiyel gen ekspresyonu için ve zenginleştirilmiş yollar ve epigenetik işaretler için içgörü sağlarBöbrek fonksiyonu-ilişkili transkripsiyonel düzenleme.

yöntemler

genel bakışDağıtıcı bir veri modeline ve kalite kontrol prosedürlerine dayanan ortak bir meta-analiz oluşturduk. Çalışmalar arasında fenotip standardizasyonunu en üst düzeye çıkarmak için, bir analiz planı ve bir komut satırı komut dosyası (https://github.com/general-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno) oluşturuldu ve katılan tüm çalışmalara sağlandı ( ağırlıklı olarak nüfusa dayalı çalışmalar; Ek Veri 1 ve 2). Otomatik olarak oluşturulan özet dosyaları merkezi olarak kontrol edildi. Fenotip onayının ardından, çalışmalar EWAS'larını çalıştırdı ve sonuçları ve toplu DNA metilasyon bilgilerini merkezi bir sunucuya yükledi. EWAS kalite kontrolü, enflasyonu, pozitif kontrolleri, CpG problarının dağılımını değerlendirmek ve çalışmalar arasında etki büyüklüklerinin, standart hataların ve P-değerlerinin genel dağılımlarını karşılaştırmak için özel komut dosyalarıyla gerçekleştirilmiştir. Tüm çalışma protokolleri ilgili yerel etik kurullar tarafından onaylandı. Tüm çalışmalarda tüm katılımcılar yazılı bilgilendirilmiş onam verdi.

CISTANCHE BÖBREK/BÖBREK DİYALİZİNİ İYİLEŞTİRECEK

Fenotip tanımı.2009'dan önce Jaffé testiyle elde edilen kreatinin değerleri 0,9552 ile çarpılarak kalibre edildi. Çalışmalar, Kronik ile GFR'yi tahmin ettiBöbrek hastalığıEpidemiyoloji İşbirliği (CKD-EPI) denklemi53. eGFR, 1.73 m2 başına 15 ve 200 ml dk-1'de kazanıldı. CKD, 1.73 m2'de 60 ml dk-1'in altında bir eGFR olarak tanımlandı. mg/g cinsinden ölçülen UACR değerleri, tüm analizlerden önce doğal log-dönüştürüldü. Mikroalbüminüri, UACR > 30 mg/g için 1, UACR değerleri < 10="" mg/g="" için="" 0="" olarak="">

DNA metilasyon miktar tayini ve kalite kontrolü.DNA metilasyonunun miktar tayini için, periferik kandan genomik DNA ekstrakte edildi. DNA metilasyon seviyeleri, Infinium MethylationEPIC BeadChip dizisi (EPIC), Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip dizisi (HM450K) veya Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip dizisi (HM27K) kullanılarak ölçüldü. DNA metilasyon verilerinin ön işlemesi, arka plan düzeltme, nicelik normalleştirme, prob filtreleme, numune filtreleme, SNP kontrol prob konumlarına SNP eşleştirme, aykırı değer filtreleme ve tahlil tipi düzeltme (Ek Veri 3) dahil olmak üzere bireysel çalışma protokollerine göre yapıldı. Her sitedeki metilasyon seviyesi, -değer olarak temsil edildi ve analiz edildi. SNP'lerle örtüşen CpG problarına açıklama eklendi. Her çalışma, her bir CpG bölgesinin ortalamasını ve standart sapmasını hesapladı ve bu özet istatistikler, CpG'ler arasındaki sistematik farklılıklar için çalışmalar arasında karşılaştırıldı ve bireysel çalışma analistleri ile takip edildi.

Ortak değişken değerlendirmesi.DNA metilasyonu ve ortak değişkenler aynı ziyaret/zaman noktasında ölçüldü. Prevalan diyabet, açlık plazma glukozu 126 mg/dl'den büyük veya buna eşit, açlık olmayan plazma glukozu 200 mg/dl'den büyük veya buna eşit, diyabet tedavisi veya diyabet teşhisinin kendi kendine bildirimi olarak tanımlandı. Yaygın hipertansiyon, sistolik kan basıncının 140 mm Hg'ye eşit veya daha büyük olması, diyastolik kan basıncının 90 mm Hg'ye eşit veya daha büyük olması veya hipertansiyon tedavisi olarak tanımlandı. Ölçülen kan basıncı mevcut değilse, hipertansiyon kendi kendine raporlama ile tanımlandı. Mevcut sigara içme durumu, kişinin bildirdiği bilgiler kullanılarak tanımlandı. BMI (kg/m2), her çalışmada değerlendirildiği gibi ağırlık ve boy ölçümleri kullanılarak hesaplandı. İlişkilendirme modellerinde yaş sürekli değer olarak dahil edilmiştir. Aile dışı çalışmalarda popülasyon yapısı, genetik temel bileşenler (PC) ile ayarlanmıştır. Beyaz kan hücresi tipi oranları, DNA metilasyonuna dayalı olarak tahmin edilmiştir54. Ek teknik ortak değişkenler arasında kontrol probu PC'leri55, çalışma merkezi, işlem grubu, dizi sentrix kimliği ve sentrix konumu bulunur.

İstatistiksel yöntemler ve meta-analiz. Analiz edilen siteler arasında karşılaştırılabilir gücü sağlamak için, analizlere yalnızca hem EPIC hem de HM450K tarafından ölçülen otozomal CpG'ler dahil edildi. Her çalışma, soy gruplarıyla ayrılmış lineer regresyon analizleri gerçekleştirdi. EWAS sonuçlarının sağlamlığını değerlendirmek için, analizler Avrupa kökenli bireylerin çalışmaları ve alt örnekleriyle sınırlıydı. DNA metilasyon değerleri, özelliğin sürekli eGFR veya UACR değerleri veya ikili CKD veya mikroalbüminüri değişkenleri olduğu bağımlı değişkenler olarak modellendi: DNA metilasyonu ~ özellik artı cinsiyet artı yaş artı genetik PC'ler artı beyaz kan hücresi oranları artı teknik değişkenler artı diyabet artı hipertansiyon artı BMI artı mevcut sigara İçme Katılımcıların tüm değişkenler ve çalışma özeti istatistikleri için eksiksiz bilgiye ihtiyacı vardı ve yalnızca sırasıyla eGFR/UACR için minimum 50 katılımcı ve CKD/mikroalbüminüri için 50 vaka/kontrol mevcutsa dahil edildi. Her çalışmaya özgü EWAS, enflasyon tahmini bire eşit veya daha büyükse, BACON yaklaşımıyla meta-analizden önce enflasyona göre ayarlandı (Ek Şekil 8)56. Çalışmalar, CKDGen Konsorsiyumu meta-analizine katkının kronolojik sırasına göre keşif ve çoğaltmaya bölünmüştür (Ek Veri 1 ve 2). R paketi 'metafor'da (sürüm 2.1-0) uygulanan sabit etki ters-varyans ağırlıklı bir meta-analiz, keşif çalışmaları, çoğaltma çalışmaları ve sonuçta ortaya çıkan keşif ve çoğaltma etki tahminleri için gerçekleştirilmiştir. Keşif veya replikasyonda ilgili numune boyutunun yarısından azı mevcutsa veya I2 heterojenlik tahmini yüzde 95'ten büyükse CpG'ler hariç tutulmuştur. İlişkili bir CpG'nin başarılı replikasyonu, keşif (neGFR disk=22,347, nUACR disk=11,458) ve replikasyon (neGFR repl=11,258) arasındaki etki tahminlerinin tutarlı yönü olarak tanımlandı. , nUACR repl=3610) meta-analizi, keşif P-değerinin (pdisc) bir Bonferroni tarafından düzeltilmiş önemi<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Gen ifadesi analizleri.etkileriBöbrek fonksiyonuözellikle ilişkili CpG'ler, iki veri seti kullanılarak kandaki gen ekspresyonu ile ilişkiler açısından test edildi: (1) MESA çalışmasının 1202 katılımcısından alınan monositlerin mRNA seviyeleri ve (2) KORA F4 çalışması 57,58. İlk adım olarak, MESA çalışmasından elde edilen ilişkilendirme sonuçlarında mevcut olan mRNA seviyeleri ile CpG metilasyon seviyelerinin bir araması yapıldı. Bu arama için, P-değeri < 1e{{10}}="" olan="" ilişkilendirme="" sonuçları="" mevcuttu.="" analiz,="" kennedy="" ve="" ark.59'da="" ayrıntılı="" olarak="" açıklanmıştır.="" kısaca,="" gen="" ifadesi="" illumina="" humanht-12="" v3.0="" ve="" v4.0="" ekspresyon="" beadchips="" ve="" dna="" metilasyonu="" illumina="" hm450k="" dizisi="" kullanılarak="" değerlendirildi.="" ifade="" değerleri,="" varyans="" stabilize="" edici="" dönüşüm="" kullanılarak="" normalleştirildi.="" v3.0="" ve="" v4.0="" dizilerinden="" 13.933="" transkript,="" deneklerin="" en="" az="" yüzde="" 5'inde="" arka="" plan="" seviyelerinin="" üzerinde="" (tespit="" p-değeri="">< 0.01)="" önemli="" ölçüde="" ifade="" edildi.="" mesa'daki="" ilişki="" analizleri,="" bağımlı="" değişken="" olarak="" log-dönüştürülmüş="" gen="" ekspresyon="" değerleri,="" bağımsız="" değişken="" olarak="" dna="" metilasyon="" beta="" değerleri="" ve="" modele="" ortak="" değişkenler="" olarak="" eklenen="" yaş,="" cinsiyet,="" etnik="" köken="" ve="" çalışma="" merkezi="" kullanılarak="" doğrusal="" bir="" karma="" model="" olarak="" yapıldı.="" kora="" f4="" veri="" setinde="" ikinci="" bir="" ilişkilendirme="" testi="" yapıldı.="" ±500="" kb="" civarında="" genlerin="" gen="" ekspresyon="" seviyeleri="" ile="" replike="" edilmiş="" cpg'lerdeki="" metilasyon="" seviyesinin="" ilişkisi,="" illumina="" human="" ht-12v3="" gen="" ekspresyon="" dizisinden="" elde="" edilen="" log2-dönüştürülmüş="" mrna="" seviyeleri="" kullanılarak="" hesaplandı.="" gen="" ekspresyon="" değerleri,="" cinsiyet="" ve="" yaşa="" göre="" ayarlanan="" dna="" metilasyon="" beta="" değerleri="" üzerinde="" geriledi.="" analizden="" önce,="" kan="" hücresi="" tipi="" oranlarının="" yanı="" sıra="" teknik="" faktörler,="" mrna="" ve="" dna="" metilasyon="" seviyelerinden="" geri="" çekildi="" ve="" artıkları="" son="" birleşme="" modeline="" dahil="" edildi.="" gen="" ekspresyonu="" problarının="" açıklama="" ve="" kalite="" kontrol="" kontrolleri,="" schurmann="" ve="" ark.60'da="" sağlanan="" tabloya="" dayanmaktadır.="" mesa="" sonuçlarında="" mevcut="" olan="" ve="" bir="" p-değerine="" sahip="" olan="" kandaki="" cpg-gen="" ekspresyonu=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

Böbrek dokusunda DNA metilasyonu.DNA metilasyonu kullanılarak yapılan analizlerböbrek dokusueGFR ve fibroz ile 506 mikrodissected verileri kullanılarak yapıldıböbrek dokusuIllumina EPIC BeadChip kullanarak örnekler. Böbrek dokusu örnekleri ayrı olarak toplanmıştır ve EWAS meta-analizinde analiz edilen kan örneklerinden farklıdır. Bu örnekler, tümör nefrektomilerinin etkilenmemiş bölümlerinden toplandı ve 61'den önce açıklandığı gibi hazırlandı. Kısaca, SeSAMe yazılımı62, düşük yoğunluğa dayalı algılama, arka plan çıkarmada kanama düzeltmesi, doğrusal olmayan boya yanlılığı düzeltmesi dahil ön işleme ve kalite kontrolünü gerçekleştirmek için kullanıldı. bisülfit dönüşümü için kontrol, beta değerlerinin hesaplanması ve lökosit fraksiyonunun tahmini. eGFR ve UACR ile ilişkili CpG'lerin beta değerleri ve klinik bilgiler, ilişki analizi için çıkarıldı. Bağımlı değişkenler olarak nihai CpG'lerin DNA metilasyon betalarının cinsiyet, yaş, genetik PC'ler (1-5), diyabet durumu, hipertansiyon durumu için ayarlanmış bağımsız değişkenler olarak sırasıyla eGFR ve fibroz seviyeleri ile ilişkilerini test etmek için bir regresyon modeli uygulandı. , BMI, dizi sentrix kimliği, sentrix konumu ve bisülfit dönüşüm kontrolü ve tahmini lökosit fraksiyonu.

KBH hastalarında eGFR problarının hedefli araştırmaları. Alman Kronikinde genel popülasyondan 69 eGFR ile ilişkili ve doğrulanmış CpG'nin eGFR ile ilişkisiBöbrek hastalığı (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 mg g-1). Hastaların klinik sonlanım noktaları için takipleri halen devam etmektedir. Çalışma bitiş noktaları, hastaneden taburcu mektuplarına ve ölüm sertifikalarına dayalı olarak standart bir şekilde sürekli olarak kaydedilir ve ölüm kadar böbrekle ilgili olayları da içerir. Çalışma tasarımı ve işe alınan çalışma popülasyonu önceki yayınlarda63,64 daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır. GCKD Çalışması yerel etik kurullar tarafından onaylandı ve klinik çalışmalar için ulusal kayıt defterine kaydedildi (DRKS 00003971). Sistemik lupus eritematozus, membranöz nefropati, fokal segmental glomerüloskleroz veya otozomal dominant polikistik ile ilişkilendirilen CKD'li 559 hastadan oluşan bir alt grupböbrek hastalığıDNA metilasyon miktar tayini için seçildi ve Infinium MethylationEPIC BeadChip dizisi (EPIC) kullanılarak ölçüldü. eGFR ile ilişki, hiç-/eski-/mevcut sigara içenler için 0/1/2 kodlu sigara içimi düzeltmesi dışında, ana analize benzer şekilde değerlendirildi (bkz. İstatistiksel yöntemler ve meta-analiz). DNA metilasyonunun zamanla ilişkisini değerlendirmek içinböbrek yetmezliğiçalışma girişinden, Cox regresyon modelleri her CpG için ve benzer şekilde birleşik bir son nokta için takıldı.böbrek yetmezliğive akutböbrek hasarı.DNA metilasyon tahmin edicisinin yanı sıra, modeller yaş, cinsiyet ve CKD alt tipi için ayarlandı. Cox regresyon modeli, rekabet eden olayların varlığında, yani böbrekle ilgili ölüm dışında herhangi bir ölümde, nedene özgü tehlike oranı (HR) için tahminler sağlar. Yarışan olay yoluyla olası dolaylı etkileri değerlendirmek için ayrıca alt dağıtım tehlike analizleri yapılmıştır. Orantılı tehlikeler varsayımı, ölçeklendirilmiş Schoenfeld kalıntılarına dayalı olarak değerlendirildi. İlişkili iki CpG için grafik değerlendirme, büyük ihlallere dair hiçbir kanıt göstermedi (Ek Şekil 9).

Bölgesel ilişkilendirme çizimleri ve açıklama. Ek Şekil 5 için çizimler, 'Gviz' 65 ve 'rtracklayer' 66 R paketleri kullanılarak oluşturulmuştur. İlgili CpG sahasının 50,000 bp yukarısında veya aşağısında maksimum 40 saha arsaya dahil edilmiştir. Aralık 40 siteden fazlasını içeriyorsa, çizilen bölge en uzak sitenin mesafesi artı 10,000 bp'ye düşürüldü. RefSeq Genleri bölümü, 'org.Hs.eg.db' R paketindeki gen sembolleriyle UCSC NCBI RefSeq izini temel alır, CpG Adaları bölümü UCSC CpG Adaları izini temel alır, Yol Haritası chromHMM bölümü, Yol haritaları 15- cenin chromHMM modelini belirtirböbrekepigenom (Yol Haritası Epigenom Kimliği: E086)67 ve Ortak SNP'ler bölümü, UCSC Ortak SNP'leri(151) izini68 temel alır. Son olarak, şeklin altındaki CpG korelasyon grafiği, eksik bölgelerin açık gri renkli olduğu Illumina HumanMethylation450 BeadChip dizisini kullanan KORA F4 çalışması DNA metilasyon örneklerinin verilerine dayanmaktadır.

Varyans, DNA metilasyonu ile açıklanır.eGFR ile ilişkili 69 tekrarlanmış CpG tarafından açıklanan fenotipik varyans yüzdesi, KORA F4 çalışmasının yedi yıllık takibi olan KORA FF4 çalışmasından 1.888 katılımcının verileri kullanılarak tahmin edilmiştir57,58. KORA FF4, EWAS meta analizinin bir parçası değildi. Ancak açıklanan varyans analizine dahil edilen 988 kişi, EWAS'ın KORA F4 katılımcıları ile örtüşmüştür. Bu veri setinde, tüm CpG'ler tarafından ortak değişkenlerden bağımsız olarak açıklanan varyans, CpG'leri içeren ve içermeyen temel modelin R2'sindeki fark olarak tahmin edildi. Temel model şu şekilde tanımlandı:böbreközellik ~cinsiyet artı yaş artı beyaz kan hücresi oranları artı diyabet artı hipertansiyon artı BMI artı şu anda sigaraböbrekeGFR ve UACR'yi temsil eden özellik. İki eGFR ile ilişkili CpG (cg06008406, cg20004659) için KORA FF4 veri setinde hiçbir veri mevcut değildi.

Çift yönlü Mendel rastgeleleştirme analizi.İleri MR'da, 'TwoSampleMR' R paketini69 kullanarak, replike edilmiş CpG'lerde DNA metilasyonunun eGFR ve UACR üzerindeki potansiyel nedensel etkilerini araştırdık. MR, kafa karıştırıcı ve ters nedensellikten kaynaklanan yanlılığı en aza indirmek için genetik araçlar kullanır70. DNA metilasyonu için genetik araçlar (meQTL), eGFR ve UACR için sırasıyla 47 ve beş CpG için mevcuttu, daha önce GoDMC tarafından 27,750 kişiye kadar 42 tanımlandı. eGFR10 ve UACR13 ile ilgili Avrupa soy özeti GWAS verileri, ilgili sonuç verileri olarak kullanılmıştır. MeQTL dahil edilmesi için filtreler uygulandı (± 500kB cis bölgesinde DNA metilasyonu ile pSNP < 1e−5,="" 1mb="" bölgesinde="" bağlantı="" dengesizliği="" r2="">< 0.2,="" steiger="" filtreleme,="" maf=""> 0.05). Ters varyans ağırlıklı MR ve ayrıca MR duyarlılık analizleri (basit mod, ağırlıklı mod, ağırlıklı medyan ve MR Egger) veya CpG bölgesi başına yalnızca tek bir cihazın mevcut olması durumunda Wald oranını tahmin ederek üçgenleme gerçekleştirdik71-73. MR'den elde edilen etki tahminleri, temel alınan veri kümelerinin birimlerine bağlıdır ve bu durumda, doğal log-dönüştürülmüş eGFR üzerindeki metilasyon seviyelerinin bir standart sapmasındaki birim başına bir değişikliğe ve doğal log-dönüştürülmüş UACR'nin standart sapmasına karşılık gelir, sırasıyla. Ters MR'da, olası nedensel etkileri inceledik.Böbrek fonksiyonuSırasıyla eGFR ve UACR için genetik araçlar olarak eGFR10 ve UACR13 üzerindeki trans-etnik GWAS'tan genom çapında önemli SNP'leri kullanarak DNA metilasyonu üzerindeki özellikler. Sonuç verileri üzerindeki gücü en üst düzeye çıkarmak için, KORA F4 (n=1662) ​​ve FHS (n=3868) çalışmalarından SNP-CpG ilişkilerinin bir z-skoru meta analizini gerçekleştirdik. MR'ye dahil edilen meQTL'nin birleşik etki tahminleri ve bunların standart hataları, numune boyutu, alel frekansı ve z-skoru74'ten tahmin edilmiştir. SNP dahil edilmesi için filtreler uygulandı (P-değeri < 5e-8="">böbreközellik, tek taraflı P-değeri < 0.05="" egfr="" cihazları="" için="" kan="" üre="" nitrojeni="" ile,="" soy="" heterojenliği="" p-değeri="" 0'den="" büyük="" veya="" eşit.0="" 1,="" steiger="" filtreleme,="" maf=""> 0.05). Çarpımsal rastgele etkilerle (özellik başına farklı lokuslardan yeterince yüksek sayıda araç mevcut olduğundan)51 ve MR duyarlılık analizleri (basit mod, ağırlıklı mod, ağırlıklı medyan ve MR Egger)71-73 ile ters varyans ağırlıklı MR gerçekleştirdik. Pleiotropik varyantları ele alan ek bir duyarlılık analizi olarak, 898.130 bireyi içeren yakın tarihli bir GWAS75'te tip 2 diabetes mellitus ile ilişkili toplam 35 enstrümanı hariç tuttuk: diyabetle P değeri < 5e-8="" ilişkisi="" olan="" on="" bir="" snp="" ve="" 24="" ek="" diyabetle="" ilişkili="" snp="" ile="" bağlantı="" dengesizliği="" (1="" mb,="" 1000="" g="" eur="" referans="" paneli="" içinde="" r2=""> 0.2) olan cihazlar. Bağlantı dengesizliği LDlink76 aracılığıyla değerlendirildi. Ters MR için, etki tahminleri, DNA metilasyon seviyelerinin standart sapması üzerinde sırasıyla doğal log-dönüştürülmüş eGFR'deki birim başına değişimi ve doğal log-dönüştürülmüş UACR'nin standart sapmasını sağlar. Benjamini-Hochberg FDR < 0.05'e="" göre="" p-değeri="" çoklu="" test="" ayarlaması="" böbrek="" özelliği="" başına="" ve="" ileri="" ve="" geri="" mr="" için="" ayrı="" ayrı="" uygulandı77.="" heterojenlik="" p="" değerleri,="" q-istatistiklerinden="" elde="">

Zenginleştirme analizleri.İlişkili CpG'lerin potansiyel fonksiyonel etkilerini bilgilendirmek için, bu CpG'lerin DNase I veya histon modifikasyonu (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3), KEGG ve Reactome veritabanlarındaki GO terimlerine ve yollarına dayalı gen setlerinde zenginleşmesini değerlendirdik32 -35. TFBS zenginleştirme analizleri, daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi yapıldı14. Kısaca, zenginleştirme testi, örnekleme sırasında gen ve CpG ada bölgesi lokalizasyonu için eşleştirme ile permütasyon kullanılarak eForge78 kullanılarak değerlendirildi. Veriler, Hotspot yöntemi 67,79,80 tarafından oluşturulan ENCODE (125 örnek) veya Roadmap Epigenomics (299 örnek) projelerinden elde edilmiştir. Meta-analizde P değeri < 1e−05'te="" sırasıyla="" egfr="" ve="" uacr="" ile="" ilişkilendirilen="" cpg'ler="" girdi="" olarak="" kullanıldı="" (ek="" veri="" 6="" ve="" 7)="" ve="" 10,000="" yeniden="" örnekleme="" çalışmaları,="" aktif="" bir="" yakınlık="" filtresi="" ve="" fdr=""><0.05 olarak="" kabul="" edildi="" (ek="" veri="" 13="" ve="" 14).="" histon="" işareti="" zenginleştirme="" analizleri="" benzer="" şekilde="" yapıldı="" (ek="" veri="" 15="" ve="" 16).="" gen="" setleri="" veya="" yollarındaki="" zenginleştirme,="" metilgsa="" paketi="" ve="" r="" versiyonu="" 3.6.181="" kullanılarak="" değerlendirildi.="" zenginleştirme="" testi="" yöntemi,="" gen="" başına="" prob="" sayısı="" ve="" 450k="" ve="" epic="" dizileriyle="" örtüşen="" otozomal="" arka="" plan="" için="" ayarlanan="" bir="" lojistik="" regresyon="" uygulayan="" metilglm="" idi.="" 100-500="" gen="" içeren="" gen="" setleri="" veya="" yollar="" test="" edildi="" (varsayılan="" ayar).="" benjamini="" ve="" hochberg="" yöntemini="" kullanarak="" (ek="" veri="" 17="" ve="" 18)="">