Metformin, Doğal Yaşlanmış Bir Fare Modelinde Lens Epitel Hücrelerini Yaşlanmaya Karşı Korur

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

GİRİİŞ

Lens epitel hücreleri (LEC'ler), lensin ön kapsülünü kaplayan tek bir hücre tabakası oluşturur ve ekvator lens yayına kadar uzanır [1, 2]. LEC'lerin normal yapısı ve işlevi, tüm lensin şeffaflığının ve metabolik homeostazının korunması için gereklidir[3]. Artan kanıtlar, LEC'lerin yaşlanmasının enzimler ve kristalinler dahil lens proteinlerinin modifikasyonuna, denatürasyonuna ve agregasyonuna neden olabileceğini ve böylece sonuçta lens opaklaşmasına ve hatta kataraktlara yol açabileceğini göstermektedir [3-5]. Yaşa bağlı katarakt (ARC), yaşlı bireylerin yaşam kalitesini ciddi şekilde etkileyen görme bozukluğu ve körlüğün önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir [6]. Şu anda, ARC'nin ilerlemesinin önlenmesi için etkili stratejiler bulunmamaktadır. Bu nedenle, lensin şeffaflığını artırabilecek ve ARC ilerlemesini geciktirebilecek bir farmakolojik müdahale geliştirmek gereklidir.

Son birkaç on yılda bilim adamları, çeşitli genetik, diyet ve farmakolojik müdahaleleri kullanarak sağlığı iyileştirme ve yaşam süresini uzatma konusunda kayda değer ilerleme kaydettiler [7]. Metformin(MET), kapsamlı olarak incelenen yaşlanma karşıtı ajanlardan biridir. Önemli çalışmalar, MET'nin çeşitli hayvan modeli sistemlerinde yaşlanmayı hafifletebileceğini ve sağlıklı bir yaşam süresini uzatabileceğini göstermektedir. MET sadece Caenorhabditis elegans'ın ömrünü uzatmakla kalmaz, aynı zamanda sağlığını ve canlılığını da arttırır [8]. MET, ömürlerini uzatmak için Drosophila midgut kök hücrelerinde yaşa bağlı ve oksidatif strese bağlı DNA hasarı birikimini azaltabilir [9]. Önceki çalışmalar ayrıca kronik düşük doz MET uygulamasının farelerin sağlığını ve ömrünü iyileştirdiğini göstermektedir [10]. Ayrıca, ortaya çıkan kanıtlar, diyabetli hastalar MET ile tedavi edildiğinde, diyabeti olmayan kontrollerle karşılaştırıldığında bile sağkalım yararları sergilediklerini göstermektedir [11].

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

Çeşitli model organizmalarda MET'in yaşam süresini arttırıcı aktivitesine ek olarak, MET, yaşa bağlı hastalıkları iyileştirmek için çoklu hücresel sinyalleşme yollarını hedefler. MET'in esas olarak adenozin monofosfat (AMP) ile aktive olan protein kinaz (AMPK) aktivasyonu yoluyla otofajiyi modüle ettiği ve Parkinson hastalığında nörodejenerasyon ve nöroinflamasyonun nöroprotektif bir rol oynamasını önlediği gösterilmiştir [12]. Benzer şekilde, MET, AMPK ve endotelyal nitrik oksit yolakları yoluyla karaciğer sinüzoidal endotel hücresindeki yaşa bağlı değişiklikleri iyileştirir [13].cistanche dozajı redditAyrıca, MET tarafından kronik AMPK aktivasyonu, diyabetli OVE26 farelerinde otofajiyi yukarı regüle ederek kardiyomiyopatiyi önler [14]. Ek olarak, MET, otofajiyi ve kalori kısıtlamasını artırarak yaşa bağlı kardiyovasküler bozulmayı hafifletir [15]. Ayrıca, MET tedavisi, yüksek yağlı bir diyetle indüklenen ApoE-7-farelerde ve tavşanlarda yaşa bağlı aterosklerozu önleyebilir, aterosklerotik plak kalsifikasyonunu önemli ölçüde önleyebilir, yüksek hassasiyetli C-reaktif protein seviyelerini azaltabilir ve aktivasyonunu baskılayabilir. kan damarlarında nükleer faktör kappa B(NF-kB) yolu [16-18].

Bu gözlemlere dayanarak, bu çalışma MET'in ARC yaşlanmasını ve altta yatan moleküler mekanizmayı geciktirip geciktiremeyeceğini araştırmaya çalıştı. Bulgularımız aşağıdaki gibidir:(i) kronik düşük doz MET tedavisi, doğal olarak yaşlı farelerde LEC'lerin yaşlanmasını geciktirdi, böylece lens opaklığını inhibe etti;(i) AMPK yolu inaktive edildi ve yaşlanan LEC'lerde otofajik akış bozuldu;(i ) kronik düşük doz MET tedavisi, AMPK yolunu aktive ederek ve otofajiyi artırarak doğal olarak yaşlı farelerde LEC'lerin yaşlanmasını geciktirdi. Bulgularımız, MET'in varsayılan yaşlanma karşıtı rolünü doğrular ve MET'in ARC için olası bir terapötik seçenek olabileceğini kanıtlayabileceğine dair yeterli kanıt sağlar.

SONUÇLAR

LEC'lerin yaşlanması, doğal olarak yaşlı farelerde ARC ile ilişkilendirildi

Yaşlanmanın etkisi de dahil olmak üzere ARC'nin çoklu potansiyel mekanizmaları kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır.cistanche özü faydaları,Bununla birlikte, LEC'lerin ve ARC'nin in vivo yaşlanması arasındaki ilişki belirsizliğini koruyor. LEC'lerin yaşlanmasının in vivo olarak ARC ile sonuçlanabileceğini varsaydık. Bu nedenle, ARC'nin bir fare modelini oluşturduk. Sonuçlarımız, doğal olarak yaşlı farelerde (yaşlı fareler) lensin şeffaflığının, kontrol grubuna (genç fareler) kıyasla önemli ölçüde azaldığını ortaya koydu (Şekil 1a). Şekil 1b'de gösterildiği gibi, doğal yaş grubundaki katarakt insidansı yüzde 95.23 idi. H&E boyama deneyi, kontrol grubundaki LEC'lerin yuvarlak şekilli olduğunu ve düzenli olarak düzenlendiğini ve normal LEC'lerin yoğunluğunun nispeten yüksek olduğunu, buna karşın doğal olarak yaşlanmış farelerin LEC'lerinin düz ve düzensiz düzenlendiğini ve yoğunluğunun olduğunu gösterdi. yaşlanan LEC'ler belirgin şekilde azaldı (Şekil 1c). Ek olarak SA- -Gal boyaması, doğal olarak yaşlanmış farelerde yaşlanmış LEC'lerin oranının yükseldiğini gösterdi (Şekil 1d). Ayrıca, yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin protein ekspresyonunu IHC boyama ve western blot analizi yoluyla analiz ettik. IHC boyaması, genç farelere kıyasla doğal olarak yaşlı farelerin LEC'lerinde p21 ve p53 ekspresyonunun arttığını ortaya çıkardı (Şekil 1e, f). Benzer şekilde, p21 ve p53'ün protein ekspresyonunun, doğal olarak yaşlanmış farelerin lens kapsüllerinde genç farelerin lens kapsüllerinden daha yüksek olduğunu keşfettik (Şekil 1g). Bu sonuçlar, LEC'lerin yaşlanmasının, doğal olarak yaşlı farelerde ARC ile ilişkili olduğunu gösterdi.

Cistanche yaşlanmayı geciktirebilir

Kronik düşük doz MET uygulaması, lensin şeffaflığını iyileştirdi ve LEC'lerin yaşlanmasını hafifletti Metforminin ARC üzerindeki etkisini test etmeden önce, kronik düşük doz MET uygulamasının fareler için güvenli olup olmadığını belirledik. 10 aylık MET tedavisinden sonra, 28 fare (doğal olarak yaşlı grupta 18 ve MET grubunda 10) doğal nedenlerle öldü. Her iki grupta da canlı farelerin sağlıklı olduğunu ve her iki grup arasında vücut ağırlıkları ve organ ağırlıkları açısından anlamlı bir fark olmadığını bulduk (Tablo 1). Bu nedenle, bu sonuçlar, çalışmada kullanılan metformin dozajının hayvanlar için güvenli olduğunu ve sonraki deneyler için kullanılabileceğini göstermiştir.

Daha sonra, MET'in lens opaklığını önleyip önleyemediğini ve doğal olarak yaşlı farelerde LEC'lerin yaşa bağlı yaşlanmasını hafifletip hafifletemeyeceğini değerlendirmek için kronik düşük doz MET uygulandı. Beklendiği gibi, MET grubundaki merceğin şeffaflığı, doğal yaş grubundaki merceğin şeffaflığına kıyasla büyük ölçüde iyileştirildi (Şekil 2a). Ek olarak, morfolojik gözlemler, MET grubunun lensinin opaklıkta bir azalma gösterdiğini doğruladı. Doğal olarak yaşlı grupta katarakt insidansı yüzde 95.23 iken, MET grubundaki bu yüzde 19.00 idi (Şekil 2b).H&E boyama testi, MET grubundaki LEC yoğunluğunun belirgin şekilde daha yüksek olduğunu ortaya koydu. doğal olarak yaşlı farelerde olduğundan daha fazla (Şekil 2c). Ayrıca, MET grubunun LEC'leri, doğal olarak yaşlı grubunkilerle karşılaştırıldığında nispeten yuvarlak bir şekle sahipti (Şekil 2c). SA- -Gal boyaması, doğal yaşlı gruba kıyasla MET grubunda yaşlanan LEC'lerin oranının önemli ölçüde azaldığını gösterdi (Şekil 2d). IHC analizi, MET grubunun LEC'lerinde p21 ve p53 ekspresyonunun doğal olarak yaşlı gruba göre daha fazla azaldığını ortaya koydu (Şekil 2e, f). Benzer şekilde, western blot analizi, MET grubunun lens kapsüllerinde p21 ve p53'ün protein ekspresyonunun, doğal olarak yaşlanmış grubunkilerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaldığını ortaya koydu (Şekil 2g). Bu sonuçlar, kronik düşük doz MET uygulamasının lensin şeffaflığını artırabileceğini ve LEC'lerin yaşlanmasını hafifletebileceğini gösterdi.

Kronik düşük doz MET uygulaması, AMPK aktivasyonu yoluyla doğal olarak yaşlı farelerde LEC'lerin yaşlanmasını hafifletti Çok büyük miktarda veri, AMPK'yi aktive etmenin, model organizmalarda ömrünü uzatmak için yeterli olduğu ve uzun ömür hedefi olarak çekiciliğini artırdığı sonucunu desteklemektedir [19,20] . Bu teoriyi göz önünde bulundurarak, farelerin LEC'lerinde AMPK yolunun ifadesini değerlendirdik. Göreceli FAS mRNA seviyesi, doğal olarak yaşlı grupta azaldı ve MET grubunda arttı (Şekil 3a). Şekil 3b,c'de gösterildiği gibi, fosforile edilmiş AMPKa (Thr172) ve fosforile edilmiş ACC (Ser79) ekspresyonu, genç farelerinkiyle karşılaştırıldığında doğal olarak yaşlı farelerin LEC'lerinde azalmıştır. Bununla birlikte, fosforile edilmiş AMPKa (Thr172) ve fosforile edilmiş ACC (Ser79) ifadesi, doğal olarak yaşlı grubunkilerle karşılaştırıldığında MET grubunun LEC'lerinde yükselmiştir. Ek olarak, western blot analizi, fosforile edilmiş AMPKa(Thr172) ve fosforile edilmiş ACC'nin (Ser79) protein ifadesinin, doğal olarak yaşlanmış lens kapsüllerinde önemli ölçüde aşağı regüle edildiğini ve fosforile edilmiş AMPKa (Thr172) ve fosforile edilmiş ACC'nin protein ifade seviyelerinin ( Ser79) MET Grubunun lens kapsüllerinde arttı (Şekil 3d). Bu veriler, AMPK yolunun, doğal olarak yaşlanmış farelerin LEC'lerinde etkisiz hale getirildiğini ortaya koydu. Ayrıca, kronik düşük doz MET uygulaması, AMPK aktivasyonu yoluyla doğal olarak yaşlı farelerde LEC'lerin yaşlanmasını hafifletti.

Kronik düşük doz MET uygulaması, doğal olarak yaşlı farelerde LEC'lerin yaşlanmasını hafifletmek için otofajik akışı geri yükledi Önceki çalışmalar, otofajinin yaşlanmanın olumsuz etkileriyle mücadelede önemli bir rol oynayabileceğini göstermiştir [21,22]. MET tedavisinden sonra lensteki moleküler ve hücresel değişiklikleri daha fazla analiz etmek için LC3 ve p62'nin ekspresyonunu belirledik çünkü bunlar otofaji seviyelerinin biyobelirteçleri olarak geniş çapta kabul edildi. Şekil 4a'da gösterildiği gibi, nispi p62 mRNA ekspresyon seviyesi, kontrol grubuna kıyasla doğal olarak yaşlı grupta önemli ölçüde arttı; bununla birlikte, p62'nin nispi mRNA ekspresyon seviyesi, doğal olarak yaşlı gruba kıyasla MET grubunda büyük ölçüde aşağı regüle edilmiştir.cistanche cengiz hanEk olarak, IHC boyaması, doğal olarak yaşlanmış farelerin LEC'lerinde mikrotübül ile ilişkili protein 1 hafif zincir 3(LC3-II/l) ve p62 seviyelerinin arttığını ortaya çıkardı. Ayrıca, sonuçlarımız LC3-II/l ve p62 seviyelerinin MET Grubunun LEC'lerinde önemli ölçüde azaldığını göstermiştir (Şekil 4b, c). LC3-ll ve p62'nin protein seviyeleri, doğal olarak yaşlanan grubun lens kapsüllerinde belirgin şekilde arttı (Şekil 4d). Toplamda, doğal olarak yaşlı farelerin LEC'lerinde otofajik akışın bozulduğunu ve doğal olarak yaşlı farelerde LEC'lerin yaşlanmasını hafifletmek için kronik düşük doz MET uygulamasıyla geri yüklenebileceğini tahmin ettik.

TARTIŞMA

Tedavi edilmeyen katarakt, kristal lensin opaklaşması ile karakterize edilen dünya çapında önde gelen körlük nedenidir [23]. Epidemiyolojik çalışmalar, yaşın ARC olarak bilinen katarakt için baskın risk faktörü olduğunu ve tek tedavinin cerrahi olarak çıkarılması olduğunu göstermiştir [24]. Önceki çalışmalar, LEC'lerin yaşlanmasının ARC'nin ana nedeni olduğunu göstermiştir [25]. Bugüne kadar, istenmeyen yan etkiler olmaksızın lensin bulanıklığını önleyecek ve LEC'lerin yaşlanmasını hafifletecek hiçbir etkili terapötik ajan olmamıştır. Bu çalışmanın odak noktası, LEC'lerin yaşlanması için moleküler biyolojik temeli ve normal LEC'leri yaşlanmaya karşı koruma mekanizmasını değerlendirmekti. Sonuçlarımız, AMPK'nin etkisizleştirilmesinin ve otofajinin bozulmasının, LEC'lerin ve ARC'nin yaşlanması ile ilişkili olduğunu ortaya koydu. Ayrıca, MET'nin LEC'leri yaşlanmaya karşı koruyabildiğini ve AMPK'yi aktive ederek ve otofajiyi artırarak lensin bulanıklığını engelleyebileceğini bulduk.

Senesans, doku fonksiyonunda genel bir düşüşün eşlik ettiği temel bir biyolojik süreçtir. Ömür arttıkça, ARC gibi yaşa bağlı işlev bozuklukları ciddi sağlık sorunları haline gelir.

sorunlar [26]. LEC'lerin yaşlanmasının, ARC'nin oluşumunda ve gelişiminde rol oynadığı bildirilmiştir [5]. Sonuçlarımız, doğal olarak yaşlanmış farelerin LEC'lerinin düz şekilli olduğunu ve düzensiz şekilde düzenlendiğini ve LEC'lerin yoğunluğunun belirgin şekilde azaldığını ortaya koydu (Şekil 1c, d). Ek olarak, yaşlanmayla ilişkili genlerin (p21 ve p53) ekspresyonu, doğal olarak yaşlanmış farelerin LEC'lerinde yukarı doğru düzenlenmiştir (Şekil 1e, f, g). Sonuçlarımız, LEC'lerin yaşlanmasının ARC'nin oluşumu ve gelişimi ile ilişkili olduğunu ima etti. Bu nedenle, yeni tedavi stratejileri için bir gerekçe sağlamak için LEC'lerin yaşlanmasının altında yatan moleküler mekanizmaların doğru bir şekilde anlaşılması gerekebilir.

MET, dünya çapında tip 2 diyabet için en yaygın şekilde reçete edilen oral hipoglisemik ilaçtır. Ortaya çıkan kanıtlar, MET'in sağlık üzerinde, glisemide düzelme ile ilişkili olanların ötesinde yararlı etkileri olduğunu göstermektedir [27]. MET mekanizmalarının, AMPK'yi aktive etme, otofajiyi arttırma, inflamasyonu inhibe etme ve anti-oksidatif etkiler uygulama gibi biyolojik yaşlanmadaki temel yolları hedeflemek için önemli olduğu doğrulanmıştır [28]. İnsanlarda MET, klinik uygulamada 60 yıldan uzun süredir kullanılmaktadır; yüksek bir güvenlik profiline sahiptir ve yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıklardan sorumlu birkaç önemli yola müdahale etmek için benzersiz bir konuma sahiptir. Ancak, MET'in ARC üzerindeki etkileri ve bu etkilerin düzenleyici mekanizması hiç bildirilmemiştir. Sonuç olarak, çalışmamızda, doğal olarak yaşlı farelerde kronik düşük doz MET uygulaması, lensin şeffaflığını geliştirdi (Şekil 2a) ve LEC'lerin in vivo yaşlanmasını azalttı (Şekil 2).

MET'in, yaşlanma karşıtı bir etki uygulamak için potansiyel mekanizması olan AMPK yolunu aktive ettiği yaygın olarak kabul edilmektedir [29]. Bir hücresel enerji sensörü olan AMPK, hücresel enerji dengesinin düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar [30]. Birkaç çalışma, AMPK'nin, enerjiyi uzun ömür ile ilişkilendiren çeşitli yol ve süreçlerin entegratörü ve aracısı olarak hizmet ettiğini göstermiştir. Çalışmamızda, AMPK'nin inaktivasyonunun, doğal olarak yaşlı farelerde yaşlanan LEC'lerin bir özelliği olduğunu bulduk (Şekil 3). Daha sonra, MET'nin, LEC'lerin yaşlanmasını önlemek için AMPK yolunu uyardığı gösterildi (Şekil 3). Yerleşik bir AMPK aktivatörü olarak, MET'nin yaşlanmanın önlenmesindeki rolü, genellikle, otofajinin restorasyonu, Sirt1 ve Foxo1'in aktivasyonu ve mTOR'un baskılanması gibi aşağı akış sinyal yollarının modülasyonu üzerindeki etkilerine atfedilir [31,32]. Çalışmamız, ARC oluşumunu önlemede MET tarafından etkinleştirilen AMPK işlevinin önemini vurgulayan yeni bir kanıt dizisi sağladı.

Yukarıda bahsedildiği gibi, AMPK, otofajinin arttırılması da dahil olmak üzere yaşlanma karşıtı bir etki uygulamak için çok sayıda yol ve protein ile iletişim kurar. Uzun ömür güvencesi için temel bir süreç olarak ortaya çıkan otofaji, yaşa bağlı hastalıklar için potansiyel bir terapötik hedef olarak yaygın ilgi görmüştür. Otofaji, akışkan, çok adımlı karmaşık bir biyolojik süreçtir. Otofajinin tam sürecine, otofaji seviyesini yansıtmak için yaygın olarak kullanılan otofajik akı denir. Otofajinin bir göstergesi olarak, LC3-Il, lizozomal enzimler tarafından parçalanan otofagozomal membrana sıkıca bağlıdır.cistanche ömrü uzatmaBenzer şekilde, otofajiye özgü bir substrat olan p62, genellikle otofagolizozomda bozulur ve ifadesi dolaylı olarak otofaji seviyesini yansıtır. Bu çalışmada, bulgularımız, yaşlanan LEC'lerde otofaji seviyesinin belirgin bir şekilde azaldığını (Şekil 4), MET'in ise yaşa bağlı otofaji bozulmasını tersine çevirdiğini ima etti (Şekil 4). MET'in yaşlanma karşıtı moleküler mekanizması, AMPK'nin hücrelerdeki birincil işlevine atfedilir, çünkü genellikle AMPK aktivasyonu yoluyla otofajiyi arttırır [33]. Ayrıca, MET'nin otofajiyi doğrudan arttırdığı ve böylece yaşlanmanın önlenmesine katkıda bulunduğu gösterilmiştir [34]. Bununla birlikte, MET'nin bağımsız veya bağımlı bir AMPK yolu yoluyla otofajiyi artırdığını kanıtlayan altta yatan mekanizmaları aydınlatmak için daha ayrıntılı çalışmalara ihtiyaç vardır.

ARC prevalansının Asya kökenli popülasyonlarda cinsiyetle ilişkili olmadığı gösterilmiştir [35, 36]. Bu nedenle cinsiyeti ARC'yi etkileyebilecek bir faktör olarak görmedik. Çalışmamız yukarıda belirtilen sınırlılıklar göz önünde bulundurularak yorumlanmalıdır.

ÇÖZÜM

Özetle, AMPK yolunun etkisizleştirilmesinin ve yaşa bağlı otofaji bozulmasının LEC'lerin yaşlanmasına ve ARC oluşumuna katkıda bulunabileceğini kanıtladık. Ek olarak, deneylerimizden elde edilen veriler, MET'nin, AMPK yolunun aktivasyonu ve otofajinin arttırılması yoluyla LEC'lerin yaşlanmasını ve ARC oluşumunu etkili bir şekilde geciktirdiğini ortaya koydu. Bulgularımız, ARC'nin yaşlanma sürecinde MET'in rolünde yararlı olan moleküler mekanizmaların daha fazla araştırılması için temel bir çizgidir ve ARC'nin oluşumuna ve gelişimine karşı yeni stratejilerin geliştirilmesine yönelik daha yoğun çalışmalar için bilgilendirici olacaktır.

MATERYALLER VE YÖNTEMLER Reaktifler

MET, Bristol-Myers Squibb Company'den (Çin) satın alındı. p21 (ab188224), p53 (ab131442), fosforile edilmiş AMPKa(p-AMPK)(Thr172)(ab133448), AMPKa1(ab32047), -aktin (ab8226) ve SQSTM1/p62 (3340-1) Abcam(MA, USA) firmasından elde edilmiştir. LC3 (12741) ve fosfo-asetil CoA karboksilaz (p-ACC)(Ser79)(3661)'e karşı antikorlar Cell Signaling Technology'den satın alınmıştır ( MA, ABD).

Hayvanlar ve tedavi

3 ve 8 aylık erkek C57BL6J fareleri Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.'den (Pekin, Çin) satın alındı. Fareler, yiyecek ve suya serbest erişimi olan, 12 saat aydınlık/karanlık döngüsüne sahip, sıcaklık kontrollü (sıcaklık, 20-25 derece ve bağıl nem, yüzde 55±15) koşullarda barındırıldı. Hayvanlar üzerinde yapılan tüm prosedürler ve protokoller Harbin Tıp Üniversitesi etik kurulu tarafından onaylanmıştır.

Fareler aşağıdaki üç gruba ayrıldı: (i) genç farelere (3 aylık, vücut ağırlığı=29.72± 1.66 g, n =40) sahip kontrol grubu standart bir saflaştırılmış fare diyeti ve su aldı ad libitum; Fareler 10 aylıkken, 120 fare rastgele iki gruba ayrıldı: doğal yaş grubu ve MET grubu. (i) doğal olarak yaşlı grup (daha yaşlı fareler, 20 aylık, vücut ağırlığı=32.98±1.93g, n=60) standart saflaştırılmış fare diyeti ve ad libitum su aldı;(ii)MET grubu ( 20 aylık, vücut ağırlığı=31.21±2.81 g,n=60), fareler 10 aylık olana kadar standart saflaştırılmış fare diyeti ve su ile sürdürüldü; ardından tedavilere başlandı. MET grubundaki fareler, yüzde 0.1 MET (Bristol Myers Squibb, Çin) ve su ile desteklenmiş bir diyetle 10 ay boyunca serbestçe beslendi.

lenslerin ve lens kapsüllerinin izolasyonu

Fareler servikal dislokasyon yoluyla ötenazi edildi. Tüm deney hayvanlarından tüm göz hemen çıkarıldı ve steril saline yerleştirildi. Optik sinir yukarı doğru yerleştirildi ve cımbızla tespit edildi. Daha sonra göze giren optik sinir üzerinde bir kesi yapıldı ve lensi ortaya çıkarmak için sklera geri çekildi.cistanche nzDaha sonra, merceğin ekvator düzlemine bağlı siliyer cisim parçalarını nazikçe çıkarmak için cımbız kullandık. Yeni lensin fotoğrafları hemen çekildi ve lens, oda sıcaklığında yüzde 4 paraformaldehit ile hızla sabitlendi. Tüm lens kapsülleri kalan lensten hızla soyuldu, sıvı nitrojen içinde ani donduruldu ve sonraki deneyler için 80°C'de saklandı.

Hematoksilen ve eozin (H&E)

Taze lens, oda sıcaklığında yüzde 4 paraformaldehit ile hemen sabitlendi ve parafine gömüldü. Histolojik inceleme için dokular 4-μm'lik dilimler halinde kesildi. Deparafinizasyon ve rehidrasyondan sonra hazırlanan parafin kesitleri, 8 dakika boyunca hematoksilen (H) çözeltisi ile boyandı, ardından yüzde 1 asit etanol içinde 5 daldırma (yüzde 70 etanol içinde yüzde 1 HCI)

ve distile su ile durulanır. Daha sonra kesitler 3 dakika eozin (E) solüsyonu ile boyandı, ardından dereceli alkol ile dehidrasyon ve ksilen ile temizlendi. Morfolojik değişiklikler mikroskop altında gözlemlendi (Nikon, Eclipse, Japonya).

Yaşlanma ile ilişkili -galaktosidaz (SA- -Gal) tahlili Yaşlanma ile ilişkili -galaktosidaz (SA- -Gal) aktivitesi, bir SA- -Gal boyama kiti (Sigma, CS{) kullanılarak ölçüldü. {12}}030). Üreticinin talimatlarına göre, bir dizi işlemden sonra doku bölümleri 5 dakika (üç kez) fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı ve ardından SA- -gal boyama solüsyonunda (pH 6.0) inkübe edildi. 24 saat boyunca CO2 olmadan 37 derece. Görüntüler ışık mikroskobu (Nikon, Eclipse, Japonya) altında çekildi. SA- -gal-pozitif hücrelerin yüzdesi, ortalama pozitif hücre sayısı/ortalama toplam hücre sayısı olarak tahmin edildi.

Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (gRT-PCR) Farelerin lens kapsüllerinden toplam RNA, TRlzol reaktifi kullanılarak ekstre edildi. ExScript RT Reaktif Kiti (Invitrogen) ile ters transkripsiyon yapıldı. Bir SYBR Green Supermix kullanılarak kantitatif ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) analizi yapıldı

kit (Takara, Tokyo, Japonya), endojen bir kontrol olarak -aktin ile. Transkripsiyonlar, FAS (ileri, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'and reverse,5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (ileri,5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{{{ 10}} ve ters,5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') ve -aktin (ileri, 5 '-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3've geri,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'. her bir gen ekspresyonunun seviyeleri

yöntem. -aktine normalize edildi ve 2-△△ct r İmmünohistokimyasal (IHC) boyama kullanılarak hesaplandı Grup başına seçilen 10 lensin her birinden toplam 5 temsili kesit immünohistokimyasal (IHC) analiz için kullanıldı p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 ve p62'nin ekspresyonunu değerlendirmek için. Hazırlanan örnekler 6{17}} derecede 2 saat inkübe edildikten sonra deparafinizasyon için ksilen ve dereceli alkol serilerinden geçirildi. Daha sonra numuneler 0.1 M sitrik asit (pH 6.1) içinde 30 dakika kaynatıldı ve oda sıcaklığına soğutuldu. PBS ile üç kez yıkandıktan sonra, endojen peroksidaz aktivitesini inhibe etmek için numuneler yüzde 0.3 H202 ile ıslatıldı. Ardından, birincil antikorlar eklendi ve gece boyunca 4°C'de soğutuldu. Karşılık gelen ikincil antikorlar 1 saat süreyle 37 derece C'de inkübe edildi. PBS ile yıkandıktan sonra numuneler, istenen leke yoğunluğu gelişene kadar diaminobenzidin (DAB) içinde inkübe edildi. İmmün boyanmış hücrelerin görüntüleri, Nikon Eclipse mikroskobu (Nikon, Eclipse, Japonya) kullanılarak alındı.

Western blot analizi

Farelerin lens kapsüllerinden toplam protein, proteaz inhibitör kokteyli (Pierce, ABD) ile radyo-immünopresipitasyon deneyi (RIPA) tamponu kullanılarak ekstre edildi ve protein konsantrasyonunu ölçmek için bir bisinkoninik asit (BCA) kiti (Thermo Fisher Scientific, ABD) kullanıldı. . Toplam protein （40 ug）, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanılarak analiz edildi ve poliviniliden diflorür filtre (PVDF) membranlarına (Millipore, Almanya) elektroforetik olarak aktarıldı. Zarlar, 4 derece C'de bir birincil antikor ile gece boyunca inkübe edildi. Ertesi gün, membranlar, karşılık gelen ikincil antikorlarla 37 derece C'de 1 saat süreyle inkübe edildi. İmmünoreaktif bantlar, bir Süper Sinyal Batı Pico ile kemilüminesan substrat yöntemi kullanılarak görselleştirildi. kiti (Pierce Biotechnology, ABD). Üç bağımsız deney gerçekleştirilmiş.

istatistiksel analiz

Veriler ortalama±standart sapma (SD) olarak ifade edildi. İstatistiksel analizler, GraphPad Prism 7.0 yazılımı ve Microsoft Excel kullanılarak yapılmıştır. Protein, Image J yazılımı kullanılarak ölçüldü. Student's t-testi ve varyans analizi (ANOVA) deneysel verilerin istatistiksel önemini hesaplamak için kullanıldı. P-değeri ile farklılıklar<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

VERİ KULLANILABİLİRLİĞİ

Mevcut çalışma sırasında kullanılan ve analiz edilen veri kümeleri, yayınlanan bu makaleye dahil edilmiştir.

Bu makale www.nature.com/cddiscovery adresinden alınmıştır.