Kombine bakteriyel fermantasyon ve bunların biyolojik aktiviteleri sırasında üretilen mikrobiyal enzimler üzerinde çalışma ⅲ

Bölüm 3 Enzimlerin antioksidan aktivitesi üzerine çalışma

 

Birçok insan hastalığının ilişkili olduğu kanıtlanmıştır.aktif oksijen ve serbest radikaller, örneğiniltihaplanma, arterioskleroz,yaşlanma, diyabet, kanser, vesaire.Aşırı serbest radikallerVücutta protein denatürasyonuna, hücre hasarına ve ölüme ve hatta vücuttaki patolojik değişikliklere neden olabilir. Bu nedenle, yurtiçinde ve yurtdışında birçok çalışma, diyet yoluyla serbest radikallerin neden olduğu hastalıkları önlemek ve düzenlemek için doğal antioksidan bileşenler açısından zengin gıdalar arıyor. Bugün, artan yaşam standartlarıyla, insanlar yavaş yavaş kendi bedenlerine kaydırıyorlar, böylece daha fazla sağlık ürünü sonsuz bir akışta ortaya çıkıyor. Ancak, gerçekten yararlı olmak kolay değildir. Enzimler, insanların yaşamlarında kendiniz yapılabilecek bir tür yiyeceklerdir. Maliyet çok yüksek değil ve birçok fayda var.
Mikrobiyal enzimler, antibakteriyel ve antienflamatuar gibi çeşitli sağlık fonksiyonlarına sahiptir, metabolizmayı teşvik eder, bağışıklığı, beyazlatma ve yaşlanma karşıtı, detoksifikasyon ve anti-kanser. Şu anda, yurtiçinde ve yurtdışında mikrobiyal enzimlerin antioksidan özellikleri üzerinde nispeten az çalışma vardır, bu nedenle onlar üzerinde derinlemesine araştırma yapmayı planlıyoruz. Bu makale Apple enzimini araştırma nesnesi olarak alır ve toplam fenol içeriğini kullanır, gücü azaltır, DPPH · serbest radikal, · OH serbest radikal, süperoksit serbest radikal ve ABTS serbest radikal temizleme yeteneğini, 3 ay boyunca fermantasyondan sonra elma enziminin kapsamlı ve sistematik bir şekilde araştırılması için belirleme endeksleri olarak. Antioksidan aktif bileşenlerin bileşimi ve içeriği incelendi ve antioksidan aktivitesi anlaşıldı.

Bakteri fermantasyonundan çok daha fazla anti-oksidasyon gücüne sahip yeni otlar cistanche

Çin'deki en büyük cistanche ihracatçısı Wecistanche'nin destekleyici hizmeti:
E -posta: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/Tel: +86 15292862950

 

 

 

 

3.1 Malzeme ve Yöntemler

3.1.1 Malzemeler

(1) Deneysel malzemeler
Taze elmaları steril koşullar altında steril su ile yıkayın, doğal olarak steril bir ameliyat masasında kurutun, soyun ve daha sonra kullanım için dilimleyin. 1: 1 kütle oranında sterilize bir cam kavanoza beyaz şeker ve elmaları ekleyin. Deney için gereken bakterileri aktive edin ve optimal şemaya (bu çalışma adımı kontrol grubunda atlanır) göre enzime aşılayın, kapatın ve serin ve kuru bir yere yerleştirin. 3 aylık oda sıcaklığı fermantasyonundan sonra, hamuru içeren tüm enzim sıvısını elde etmek için bir numune alın ve filtreleyin. Süpernatant deney numunesi olarak alın ve ilgili verileri belirlemeden önce numuneyi yüksek hızlı bir santrifüjde 15 dakika boyunca 10000 rpm'de santrifüjleyin. Enzim yapma sürecinde, gereksiz kontaminasyondan kaçınmak için tüm operasyonlarımızın steril koşullar altında gerçekleştirildiğini belirtmek gerekir.

(2) Ana aletler
Spektrofotometre: V -1100, Şangay Bilimsel Enstrüman Fabrikası;
Sabit sıcaklık su banyosu: HH -2, Wuhan Litian Technology Instrument Co., Ltd. Diğer enstrümanlar 2.1.3 ile aynıdır.

3.1.2 Yöntemler

(1) Toplam fenol içeriğinin belirlenmesi [53]
① Standart eğrinin hazırlanması:
{{{0}}}. 123 g gallik asit doğru bir şekilde tartın, az miktarda damıtılmış suda çözün ve hacmi oluşturmak için 5 0} 0 ml volumetrik şişeye aktarın. 8 temiz 1 {{1 {{{{{{{}}}} ml hacimsel şişeler alın, sırasıyla 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 ve 1.4 mL gallik asit standart çözeltisi ekleyin, damıtılmış su ile 1 mL su ve 2 ml,% 20 inç ekleyin, 1 mL to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to, Min, serin ve 20 ml'ye kadar seyreltin ve oda sıcaklığına 30 dakika yerleştirin. A absorbansını 650 nm dalga boyunda ölçmek için bir spektrofotometre kullanın ve Absorbans A ile yatay eksen olarak standart bir eğri ve dikey eksen olarak numune konsantrasyonu çizin. ② Tespit
Add distilled water to 100μL, 200μL, 300μL, 400μL, and 500μL sample solutions to 46mL, then add 1mL of Folin-phenol reagent, mix evenly, react for 3min, then add 3mL of 20% NaCO3, shake in a 25 degree constant temperature water bath for 2h, use distilled water as blank control, and measure its absorbance A at a wavelength of 760nm with a spektrofotometre. Toplam fenol içeriği gallik asit eşdeğerleri olarak ifade edilir ve toplam fenol içeriği standart eğri denklemine göre hesaplanır.

(2) Azaltma Tahliyesi [54]
Add 100μL, 200μL, 300μL, 400μL, and 500μL of sample to 2.5mL of phosphate buffer with a concentration of 0.2mol/L and a pH value of 6.6, then add 2.5mL of potassium ferricyanide (w/v) with a mass concentration of 1%, and react at 30 dakika için 50 derece. Daha sonra%10 kütle konsantrasyonu ile 2.5ml trikloroasetik asit (w/h) ekleyin ve yüksek hızlı bir santrifüjde 10 dakika boyunca 3000rpm'de santrifüj. Çıktıktan hemen sonra, 2.5 ml süpernatant bir hacimsel şişeye alın, 2.5 ml damıtılmış su ve 0.5 ml ferrik klorür (w/h)%0.1 kütle konsantrasyonu ile ekleyin. Damıtılmış suyu boş bir kontrol olarak kullanın ve A absorbansını bir spektrofotometre kullanarak 700nm'lik bir dalga boyunda ölçün. Gücü azaltmanın gücü, absorbans değeri ile değerlendirilebilir. Absorbans değeri ne kadar yüksek olursa, azalma gücü o kadar güçlü olur.

 

(3) Süperoksit anyonu serbest radikal temizleme etkisinin belirlenmesi [55]

4.5 ml 0. 0 5 mol/L pH 8.2 Tris-HCl tamponu alın ve 2 0 min için 25 derecelik bir su banyosunda önceden ısıtın. Sırasıyla%10,%20,%30,%40 ve%50 ve 0.4 mL 25 mmol/L pirogallol çözeltisi konsantrasyonları ile 1 mL enzim numune çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve 25 derecelik bir su banyosunda 5 dakika reaksiyona girin. Reaksiyonu sonlandırmak için 1.0 mL 8 mol/L HC1 ekleyin. Referans olarak Tris-HCL tamponu kullanın ve Absorbans A'yı 299 nm dalga boyunda ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Boş kontrol grubu için numune yerine 1 mL çözücü kullanıldı. O 2- temizleme oranı, formül 3.1'e göre hesaplandı: o 2- temizleme oranı (%)=(a 1- a2)/a1 × 100 (3.1); A2, numunenin absorbansıdır.

(4) Hidroksil radikalleri üzerindeki temizleme etkisinin belirlenmesi [56]

1 0 0μL, 200μl, 300μl, 400 μl, 500μl, 500μl, suyla 2ml'ye ilave edildi, daha sonra 6mmol/L molar kütle konsantrasyonu ile hidrojen peroksite ilave edildi, daha sonra 0.6ml sodyum salisilat ile 0.6ml sodyum salisilat ile ilave edildi, daha sonra 20mmol/L ve 2ML, molar kütle konsantrat ile ilave edildi, molar kütle s. 1.5mmol/L ve sabit sıcaklıkta bir su banyosunda 1 saat 37 derecede ısıtıldı. Damıtılmış su ile sıfıra ayarlayın ve A absorbansını bir spektrofotometre kullanarak 562nm'lik bir dalga boyunda ölçün. Her tedavi için 3 kopya gerçekleştirin. Formül 3.2'ye göre hidroksil radikal temizleme oranını hesaplayın: hidroksil radikal temizleme oranı (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.2) burada: A1, boşluğun ortalama emniyetidir; A2, numune çözeltisinin ortalama absorbansıdır. (5) DPPH serbest radikal temizleme etkisinin belirlenmesi [57]

Bakteri fermantasyonundan çok daha fazla anti-oksidasyon gücüne sahip yeni otlar cistanche

 

10 mL hacimsel bir şişeye 1 0%,%20,%30,%40 ve%50 konsantrasyonları ile 2 mL enzim numune çözeltisi doğru bir şekilde pipette, daha sonra hacimsel şişeye 2 mL%80 DPPH etanol sulu çözeltisi ekleyin. Molar kütle konsantrasyonu 2 x 10-4 mol/L'dir. Karıştırıldıktan sonra 30 dakika boyunca oda sıcaklığında durmasına izin verin. Referans olarak% 80 etanol çözeltisi kullanarak, numunenin absorbansını A1 olarak kaydedilen 517 nm dalga boyunda ölçün. 2 mL DPPH çözeltisi ve 2 mL etanol çözeltisini% 80 kütle konsantrasyonu ile karıştırın ve absorbanslarını A0 olarak kaydedilen aynı dalga boyunda ölçün. 2 mL enzim çözeltisi ve 2 mL etanol çözeltisini% 80 kütle konsantrasyonu ile karıştırın ve absorbanslarını A2 olarak kaydedilen aynı dalga boyunda ölçün. Formula 3.3'e göre DPPH serbest radikal temizleme oranını hesaplayın:
DPPH serbest radikal temizleme oranı (%) {{0}}}}}}}}}}}}}}}} × 100 (3.3) burada: A1, A1% 2 ML DPPH 80% etanolik çözelti ve 2 ml -örnek çözeltisinin absorbanıdır. A2, 2 mL enzim çözeltisinin karışık bir çözeltisinin ve kütle konsantrasyonu ile% 2 80 etanolün absorbansıdır; A0, kütle konsantrasyonu ile 2 mL DPPH çözeltisinin ve 2 mL% 80 etanolün karışık bir çözeltisinin absorbansıdır.

(6) ABTS serbest radikal temizleme yeteneği [58]
Karışık çözeltinin nihai konsantrasyonu 2.45 mmol/L olana kadar 7 mmol/L ABTS çözeltisine belirli bir miktarda potasyum sülfat ekleyin. Karışık çözeltiyi serin ve kuru bir yere 12 ila 16 saat boyunca oda sıcaklığında yerleştirin. 1μl, 3μl, 5μl, 7μl ve 9μl numune çözeltisi, 5mmol/L ph7.4 fosfat tamponu ile 10μl'ye eklendi ve daha sonra 10 ml'lik potasyum sülfat ve ABTS karışık çözeltisi ile eşit olarak karıştırıldı ve 30 derece ve 5 minli bir reaksiyon süresinde reaksiyona girmesine izin verildi. Damıtılmış su ile sıfır ve A absorbansını bir spektrofotometre kullanarak 734Nm'lik bir dalga boyunda ölçün. Formula 3.4'e göre ABTS serbest radikal temizleme oranını hesaplayın:
ABTS serbest radikal temizleme oranı (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.4) burada: A1 boş kontrol grubunun absorbansıdır; A2, deney grubunun absorbansıdır

 

3.2 Sonuçlar ve Analiz

3.2.1 Toplam fenol içeriği

(1) Standart eğri
Toplam fenol içeriğinin standart eğrisi, Şekil 3.1'de gösterildiği gibi, yatay eksen olarak gallik asit konsantrasyonu ve absorbans değeri dikey eksen olarak çizilmiştir.

 

Şekil 3.1 Toplam fenol içeriğinin standart eğrisi

Şekil 3.1'den, standart eğri denkleminin y =11 olduğunu görebiliriz.

(2) Örneklerin belirlenmesi

Kontrol grubundaki Apple enzimlerinin ve farklı konsantrasyonlarda deney grubunun toplam fenol içeriği belirlemesinin sonuçları Şekil 3.2'de gösterilmiştir.

 

 

 

Şekil 3.2 Toplam fenolik içeriğin eğrisi

Şekil 3.2'de gösterildiği gibi, hem kontrol grubundaki hem de deney grubundaki elma enzimleri yüksek toplam fenolik içeriğe sahiptir ve her ikisi de eklenen örnek çözeltisi miktarının artmasıyla artar. Aynı konsantrasyon gradyanında, kontrol grubundaki elma enziminin toplam fenolik içeriği 0. Deney grubunun toplam fenolik içeriği kontrol grubundan çok daha yüksektir ve yükseliş eğilimi daha açıktır. Toplam fenolik içeriğe göre, deney grubunun genel antioksidan aktivitesi kontrol grubundan daha büyüktür.

 

3.2.2 Gücü azaltma

Kontrol grubundaki ve farklı konsantrasyonlarda deney grubundaki elma enzimlerinin güç belirlemesinin azaltılmasının sonuçları Şekil 3.3'te gösterilmektedir.

 

Şekil 3.3'te gösterildiği gibi, elma enzimlerinin gücünü azaltma eğilimi, toplam fenol içeriğinin değişen eğilimine benzer. Deney grubunun azaltma gücü kontrol grubundan daha yüksektir ve deneyde sunulan konsantrasyon aralığı içinde deney grubu veya kontrol grubu olsun, azalma gücü, örnek çözeltisi miktarının artmasıyla artan bir eğilim göstermektedir. Deneysel veriler ayrıca gücü azaltma açısından, deney grubunun antioksidan aktivitesinin kontrol grubundan daha büyük olduğunu doğruladı.

 

 

3.2.3 Süperoksit anyonu serbest radikal temizleme yeteneği

Kontrol grubundaki elma enzimlerinin ve farklı konsantrasyonlarda deney grubundaki süperoksit anyonu serbest radikal temizleme kabiliyetinin sonuçları Şekil 3.4'te gösterilmektedir.

Şekil 3.4'te gösterildiği gibi, deney grubu ve kontrol grubu arasındaki süperoksit anyonu serbest radikal temizleme kabiliyetinde büyük bir fark vardır. Deneyde sunulan konsantrasyon aralığı içinde, deney grubunun süperoksit anyonu serbest radikal temizleme kabiliyeti, numune konsantrasyonu%10 ila%20 olduğunda en önemli şekilde değişir ve konsantrasyon%20'den fazla olduğunda değişiklik açık değildir; Konsantrasyon%50 olduğunda, süperoksit anyon serbest radikal temizleme yeteneği%85.4'e kadar yüksektir. Kontrol grubu tarafından gösterilen süperoksit serbest radikal temizleme kabiliyeti trend grafiğinden açıkça görülebilir. Enzim konsantrasyonu arttıkça, bu serbest radikal temizleme yeteneği de artar, yavaş değişir ve kademeli olarak istikrarlı bir duruma eğilim gösterir. Çöpçü yeteneği en fazla%42.6'ya ulaşır. Deney grubu, kontrol grubunun neredeyse iki katıdır.

 

 

3.2.4 Hidroksil içermeyen radikal temizleme yeteneği

Kontrol grubundaki elma enzimlerinin ve farklı konsantrasyonlardaki deney grubundaki hidroksil serbest radikal temizleme kabiliyetindeki değişiklikler Şekil 3.5'te gösterilmektedir.

 

 

Şekil 3.5 Hidroksilsiz radikalin temizleme eğrisi

 

Şekil 3.5'ten, deneyde sunulan konsantrasyon aralığı içinde, deney grubundaki enzimlerin hidroksil serbest radikal temizleme kabiliyetinin ve kontrol grubunun ilave miktarın artmasıyla arttığı görülebilir. Deney grubunun hidroksil içermeyen radikal temizleme kabiliyeti kontrol grubundan daha düşüktü ve düşük konsantrasyonlarda çok kötü performans gösterdi. Yüksek konsantrasyonlarda, hidroksil serbest radikal temizleme kabiliyeti önemli ölçüde artmıştır. Bunun nedeni, fermantasyon işlemi sırasında, deney grubundaki ve kontrol grubundaki elma enzimlerindeki mikroorganizmaların türlerinin ve içeriğinin farklı olması ve fermantasyon ile üretilen her bir ürünün ikincil metabolitlerinin ve bileşenlerinin farklı olması olabilir, bu nedenle gösterilen antioksidan kapasite farklıdır.

 

3.2.5 DPPH · Serbest radikal temizleme yeteneği

Diğer tespit yöntemleriyle karşılaştırıldığında, DPPH · Serbest radikal temizleme yeteneği, kısa sürede antioksidan aktiviteyi değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır [59]. Farklı konsantrasyonlardaki DPPH · serbest radikal temizleme kabiliyeti, Şekil 3.6'da gösterildiği gibi kontrol grubunun ve deney grubu Apple enzimlerinin sonuçlarına göre çizilmiştir.

Şekil 3.6'da gösterildiği gibi, kontrol grubu elma enziminin konsantrasyonu%30'dan düşük olduğunda, DPPH · serbest radikal temizleme yeteneği%50'den azdı, ancak deney grubu elma enzimi, düşük konsantrasyonlarda daha yüksek bir DPPH · serbest radikal temizleme kabiliyeti gösterdi. Deneysel sonuçlar, Aspergillus oryzae, maya, termofilik streptococcus ve Bulgar Lactobacillus eklenmesinin, enzimin DPPH · serbest radikal temizleme kabiliyeti için faydalı olduğunu göstermektedir. Enzim konsantrasyonu%50 olduğunda, bu yetenek%91.4'e kadar yüksektir, bu da aynı konsantrasyonda kontrol grubunun%69.8'inden çok daha yüksektir.

 

3.2.6 ABTS radikal temizleme kapasitesi

Kontrol grubundaki elma enzimlerinin ve farklı konsantrasyonlarda deney grubunun ABTS radikal temizleme kapasitesinin sonuçları Şekil 3.7'de gösterilmiştir.

Şekil 3.7 ABTS Radikal Çöpçü Kapasitesi Eğrisi
Şekil 3.7'den, enzim ilavesi miktarı 5μl'den fazla olduğunda, deney grubundaki elma enzimlerinin temizleme oranının daha yüksek olduğu görülebilir. Erel ve ark. ABTS radikallerinin temizleme kapasitesinin büyük ölçüde daha yüksek fenolik maddelerin konsantrasyonuna bağlı olduğunu göstermiştir [60]. Toplam fenol içeriği belirlemesinin sonuçları, deney grubunun toplam fenol içeriğinin kontrol grubundan daha yüksek olduğunu göstermiştir. Şekil 3.7'deki deneysel sonuçlar, ABTS radikallerinin temizleme kapasitesinin kontrol grubununkinden daha büyük olduğunu doğrulamıştır.

 

3.3 Bu bölümün özeti

Bu bölümde, seçilen dört elma suşu ile fermantasyon tarafından üretilen elma enzimlerinin antioksidan aktivitesi, enzim örneklerinin konsantrasyonu ve antioksidan aktif bileşenlerin karşılaştırılması ile deney grubu ile kontrol grubu arasındaki serbest radikal temizleme kabiliyeti arasındaki ilişkiyi inceler. Deneysel sonuçlar, kontrol grubundaki elma enziminin toplam fenol içeriğinin deney grubundakinden daha düşük olduğunu ve bunun azalma gücü, süperoksitsiz radikal, DPPH serbest radikal ve abts serbest radikal temizleme kabiliyetinin kontrol grubundakilerden daha iyi olduğunu göstermektedir; Kontrol grubundaki enzim, hidroksil içermeyen radikaller için özellikle iyi bir temizleme yeteneğine sahiptir.
Genel olarak, deney grubu, mikrobiyal enzimler yapmak için yapay olarak ekleme suşlarının fizibilitesini daha da doğrulayan daha yüksek antioksidan aktivite gösterdi. Bu şekilde, mikrobiyal enzim gıdaları, orijinal doğal fermantasyon temelinde insan sağlığı için daha fazla maddeye sahiptir ve insanların beklediği yönde daha iyi gelişebilir.