Aril Hidrokarbon Reseptörü Sinyal Yolunun Modülasyonu Junín Virüsü Çoğalması Üzerindeki Etkileri Bölüm 1

Soyut:

Arenaviridae familyasının bir üyesi olan Junín virüsü (JUNV), Arjantin'in kırsal bölgesinde spesifik kemoterapinin bulunmadığı endemik bir hastalık olan Arjantin kanamalı ateşinin etiyolojik ajanıdır. Aril hidrokarbon reseptörü (AHR), çeşitli memeli dokularında eksprese edilir ve çeşitli kaynaklardan gelen ligandların bir sensörü ve hücre bağışıklık yanıtının bir modülatörü olarak belirtilmiştir.

Junin virüsü, insan bağışıklık sistemini etkileyen ve ciddi bir bağışıklık tepkisine neden olan nadir bir virüstür. Ancak bağışıklık, Junin virüsüyle savaşmayı başaramayan tek strateji değil.

İlk olarak, yeterince dinlenmek ve uyumak bağışıklık sisteminizi sağlıklı tutmak için önemlidir. Uyku sırasında vücut, bağışıklık sisteminin virüslere ve diğer dış tehditlere daha etkili yanıt vermesine yardımcı olan sitokin adı verilen maddeler salgılar.

İkincisi, sağlıklı beslenme alışkanlıkları da bağışıklığı geliştirmenin anahtarıdır. Narenciye ve mantar gibi C ve D vitaminleri açısından zengin yiyecekler yemek, vücudunuzun bağışıklık tepkisini artırmaya yardımcı olabilir.

Ek olarak, orta düzeyde egzersiz de bağışıklığı artırabilir. Uygun egzersiz vücuttaki beyaz kan hücrelerinin sayısını artırabilir, böylece bağışıklık sisteminin yeteneğini artırabilir.

Son olarak, bağışıklık sisteminin sağlığı için iyi bir zihinsel durum da çok önemlidir. Stres ve kaygı vücudun bağışıklık tepkisini etkileyebilir, bu nedenle rahat ve pozitif kalmak önemlidir.

Kısacası, Junin virüsünün bağışıklık sistemi üzerinde bir etkisi olmasına rağmen, yaşam tarzımızı iyileştirerek ve olumlu bir tutum sürdürerek bağışıklığımızı geliştirebilir ve virüs saldırılarını etkili bir şekilde önleyebilir ve bunlara yanıt verebiliriz. Bu açıdan bağışıklığımızı güçlendirmemiz gerekiyor. Cistanche bağışıklığı önemli ölçüde artırabilir, çünkü et külü polisakkaritler, iki mantar, Huang Li, vb. Gibi çeşitli biyolojik olarak aktif bileşenler içerir. Bu bileşenler bağışıklık sistemini uyarabilir Sistemdeki çeşitli hücre türleri, bağışıklık aktivitelerini artırır.

Cistanche Deserticola takviyesine tıklayın

İlginç bir şekilde, son araştırmalar, AHR sinyal yolunun aktivasyonunun veya depresyonunun, çeşitli insan viral enfeksiyonlarının sonucunda bir rol oynayabileceğini öne sürdü. Mevcut raporda, AHR'nin farmakolojik modülasyonunun JUNV in vitro enfeksiyonu üzerindeki etkisi analiz edilmiştir. İlk mikrodizi taraması, AHR yolunun JUNV ile enfekte olmuş hepatik hücrelerde aşırı eksprese edildiğini gösterdi.

Eşzamanlı olarak, Vero ve Huh-7 hücrelerinin JUNV suşları IV4454 ve Candid#1 ile enfeksiyonu, enfektivite analizleri ile tespit edildiği üzere, spesifik bir AHR antagonisti olan CH223191 ile tedavi yoluyla doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde inhibe edildi, gerçek- zaman RT-PCR ve viral proteinlerin immünofloresan tespiti. Ayrıca, AHR'nin JUNV enfeksiyonundaki pro-viral rolü, IFN-I yolundan bağımsız görünmektedir. Bulgularımız, AHR'nin farmakolojik modülasyonunun AHF'nin kontrolü için potansiyel bir hedef olarak umut verici perspektiflerini desteklemektedir.

anahtar kelimeler:

Aril hidrokarbon reseptörü; Junín virüsü; arena virüsü; Arjantin kanamalı ateşi; terapötik hedefi barındırır.

1. Giriş

Şu anda, aril hidrokarbon reseptörünün (AHR) konak immün yanıtının önemli bir modülatörü olduğunu destekleyen kanıtlar artmaktadır ve bu özellik, bireysel ve popülasyon düzeyinde enfeksiyonların farklı klinik sonuçlarına katkıda bulunmaktadır [1,2]. AHR, kirleticiler, diyet, mikrobiyom ve konakçı metabolizması gibi farklı kökenlere sahip çok çeşitli endojen ve ekzojen ligandların sensörü olarak çalışan, memeli dokularında her yerde eksprese edilen bir sitoplazmik reseptördür [3-5].

Gerçekten de, AHR'nin çevresel faktörler ve viral enfeksiyonlar arasındaki etkileşim üzerinde önemli bir etkisi olduğu kuvvetle öne sürülmüştür [1,2]. AHR bir ligand molekülünü tanıdığında, çekirdeğe taşınır ve burada aril hidrokarbon reseptörü nükleer translokatörü ile heterodimerize olur ve ksenobiyotik metabolizma genlerinin (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1) ekspresyonunu düzenler.

AHR ayrıca, bağışıklık tepkisinde yer alanlar da dahil olmak üzere çok çeşitli sinyal yollarını modüle etmek için NF-kB gibi diğer transkripsiyon faktörleriyle etkileşime girebilir [6-8]. AHR, immün düzenleyici genlerin ekspresyonunu modüle edebilir ve enflamatuar dendritik hücrelerin ve T hücrelerinin farklılaşma yollarını değiştirebilir [9-11].

Araştırma grubumuz tarafından yürütülen son araştırmalar, AHR sinyal yolunun aktivasyonunun Zika (ZIKV), dang humması (DENV), [12] ve şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV{{ 4}}) enfeksiyonlar [13]. Not, AHR inhibisyonunun bu viral modellerde viral replikasyonun azalmasına yol açtığı doğrulandı, bu da AHR'nin umut verici bir antiviral stratejiyi temsil ettiğini gösteriyor.

Junín virüsü (JUNV), Arenaviridae ailesinden zarflı segmentli bir RNA genom virüsüdür [14]. Her RNA segmenti zıt yönlerde iki proteini kodlar. Bir yandan, büyük segment (L RNA), RNA'ya bağımlı RNA polimerazı (L) ve matris proteini (Z) kodlar.

Öte yandan, küçük segment (S RNA), nükleoproteini (NP) ve glikoprotein öncüsünü (GPC) kodlar; glikoprotein kompleksini oluşturmak için bir arada tutulur [14].

JUNV, Arjantin'in nemli Pampa bölgesindeki kırsal işçi popülasyonunu etkileyen endemik bir hastalık olan Arjantin kanamalı ateşinin (AHF) [15] etiyolojik ajanıdır. AHF'nin karakteristik bir özelliğinin, enfekte hastalar tarafından sunulan çok çeşitli klinik semptomlar olduğuna dikkat edin. Grip benzeri semptomları olan asemptomatik veya hafif hastalık, enfeksiyonların yüzde 70-80'inde görülür. Bununla birlikte ciddi vakalar, hastanede yatan hastalarda %20 ila %30 arasında değişen bir mortalite oranı ile hemorajik ve nörolojik komplikasyonları içerir [15].

Daha da önemlisi, Candid#1 adlı canlı zayıflatılmış bir aşının ciddi AHF vakalarını önlemede oldukça etkili olduğu kanıtlanmıştır [15,16]. Bununla birlikte, hastalığa karşı mevcut olan tek tedavi, iyileşen hastalardan alınan bağışıklık plazmasının uygulanmasıdır; sadece ilk semptomların başlamasından sonraki 8 gün içinde uygulandığında ölümcül vakaların sayısını azalttığı gösterilen bir tedavi [17].

Son yıllarda AHR'nin enfeksiyonlar sırasındaki etkisine dair çok sayıda kanıt toplanmış olsa da, arenavirüs enfeksiyonları sırasındaki rolüne dair hala net bir kanıt yoktur [2].

Kırsal nüfus sürekli olarak tarım kimyasalları, böcek ilaçları ve fosil yakıt yanma yan ürünleri gibi tarım endüstrisinden kaynaklanan kirleticiler gibi AHR ligandlarına maruz kaldığından [18], bu çalışmada in vitro AHR farmakolojik modülasyonunun etkisini değerlendirdik. JUNV enfeksiyonuna hücresel yanıt ve AHR'nin AHF hastalığında terapötik müdahale için bir aday hedef olarak potansiyel kullanımı.

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Hücre Hatları

Aşağıdaki hücre dizileri kullanıldı: Huh-7 (JCRB Hücre Bankası #0403) ve HepG-2 ATCC HB8065, iki insan hepatosit türevli karsinoma hücre dizisi; Vero ATCC CCL-81, maymundan türetilen bir böbrek epitel hücre hattı. Her hücre dizisi, yüzde 5 yenidoğan buzağı serumu (NBCS) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ABD) ile tamamlanan ve aşağıdakilerle desteklenen Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ABD) içinde yetiştirildi. 50 µg/mL gentamisin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD), 1 mM sodyum piruvat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD), 2 mM L-glutamin (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ABD) ve HCl/NaHCO3 ile tamponlanmıştır. Hücre çizgileri kültürlendi ve yüzde 5 CO2 atmosferi ile 37°C'de tutuldu.

2.2. Viral Suşlar

Aşağıdaki viral suşlar kullanıldı: hafif bir insan AHF vakasından elde edilen doğal olarak zayıflatılmış IV4454 suşu [19] ve aşı ile zayıflatılmış Candid#1 suşu [20]. Vero hücreleri, hem virüs stoğu üretimi için hem de standart plak tahlili yoluyla virüs titrasyonu için kullanıldı.

Enfeksiyöz ajanlarla yapılan tüm çalışmalar Biyogüvenlik Düzey 2 tesislerinde gerçekleştirildi ve Buenos Aires Üniversitesi Fen Bilimleri Fakültesi Çevre Sağlığı ve Güvenliği Ofisi tarafından onaylandı. Enfeksiyon prosedürleriyle ilgili tüm personel, Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. JI Maiztegui (Pergamino, Buenos Aires, Arjantin) tarafından sağlanan Candid-1 ile aşılanmıştır.

2.3. Mikro Dizi Analizi

Toplam 5 × 105 HepG2 hücresi, 25 cm2'lik kültür şişelerine ekildi ve JUNV IV4454 ile 1 enfeksiyon çokluğunda (MOI) veya sahte enfeksiyonlu olarak enfekte edildi. RNA ekstrakte edildi ve enfeksiyondan 24 ve 48 saat sonra (pi) RNAeasy (Qiagen, Hilden, Almanya) kullanılarak saflaştırıldı. RNA konsantrasyonları Nanodrop kullanılarak ölçüldü. HepG2 hücrelerinin gen ekspresyon profilleri, enfeksiyon tarafından transkripsiyonel olarak düzenlenen konakçı genleri tanımlamak için mikrodizi analizi (Affymetrix Human U133 Plus 2.0 GeneChips) kullanılarak karakterize edildi.

Enfeksiyon tarafından önemli ölçüde düzenlenen konakçı genlerin toplam sayısı, ifadede en az 1.6-kat değişiklik gösteren ve yüzde 95 farklı şekilde ifade edilme olasılığı gösteren genler tanımlanarak her bir zaman noktası için hesaplandı (p 6- 3}}.05).

Wikipathways veri tabanını kullanan WebGestalt yazılımı (http://www.webgestalt.org, 3 Temmuz 2020'de erişildi), Gen Ontolojisi ve yol aşırı temsil analizleri için kullanıldı. Tekrarlanan deneyler farklı günlerde gerçekleştirildi (koşul başına n=3 bağımsız deney).

2.4. Küçük Molekül Bileşikleri

Sentetik AHR'ye özgü rekabetçi antagonist CH223191, 1-Metil-N-[2-metil4-[2-(2-metil fenil)diazenil]fenil]{ {9}}H-pirazol-5-karboksamid (Tocris Bioscience, Bristol, Birleşik Krallık), dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözündürüldü ve 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 ve 80 uM.

Triptofan metaboliti L-kinürenin, (2S)-2-Amino-4-(2-aminofenil)-4-oksobutanoik asit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) DMSO içinde çözündürüldü ve 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 ve 320 uM'lik bir konsantrasyonda kullanıldı.

Bileşiklerin ışığa duyarlılık göstermesi göz önüne alındığında, tüm tedaviler ışık yokluğunda gerçekleştirildi.

2.5. Hücre Canlılığı Testleri

Hücre canlılığının belirlenmesi için Huh-7 ve Vero hücre tek katmanları, 24 saat boyunca MEM yüzde 5 NBCS içinde 96 oyuklu plakalarda büyütüldü. Yüzde 90 birleşmedeki hücre tek tabakaları, 72 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda CH223191 (1.25 uM ila 80 uM) ve kinurenin (5 uM ila 320 uM) ile muamele edildi. Mock, ligand tedavisinin en yüksek dozu ile aynı konsantrasyonda DMSO ile tedavi edildi ve hücre yaşayabilirliğinin yüzde 100'ü olarak kabul edildi.

Tüm tedaviler dört kopya halinde gerçekleştirildi. Hücre canlılığı, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolyum bromür (MTT) (Sigma-Aldrich, St) ile değerlendirildi. . Louis, MO, ABD) tahlili. Absorbans, bir FLUOstar OPTIMA mikroplaka okuyucusunda 570 nm'de ölçülmüştür. Hücre canlılığı yüzdesi, Mock absorbans değerleri kullanılarak muamele absorbans sonuçlarının göreli hale getirilmesiyle belirlendi.

Ek olarak, tedavi edilen hücrelerin büyüme kapasitesi ve morfolojisi bir ışık mikroskobu altında incelenmiştir. Resimler bir Nikon Eclipse TS100 mikroskobu ile 72 saatte çekilmiştir; büyütme: 100×; NA: 0.25.

2.6. Tedaviler ve Viral Enfeksiyonlar

Vero ve Huh{{0}} hücre tek katmanları, 37°C'de sırasıyla 1 saat veya 24 saat MEM yüzde 1.5 NBCS içinde seyreltilmiş CH223191 ve kinurenin ile ön işleme tabi tutuldu. CH223191, 1.25 ile 20 uM arasındaki konsantrasyonlarda kullanılırken, kinurenin, 5 ile 80 uM arasındaki konsantrasyonlarda kullanıldı. Daha sonra, 0.5 MOI'de IV4454 veya Candid#1 suşu ile viral enfeksiyon gerçekleştirildi. 1 saat sonra aşı maddesi çıkarıldı ve hücreler, belirtilen konsantrasyonlarda 48 saat boyunca her iki bileşiğe de maruz bırakıldı. 48 saatte pi süpernatanları plak tahlili için toplandı ve hücre tek tabakaları ya dolaylı immünofloresan ya da RT-qPCR için işlendi.

2.7. Dolaylı İmmünofloresan

CH223191 veya kinurenin ile muamele edilmiş ve yukarıda bahsedildiği gibi JUNV ile enfekte edilmiş Huh{0} tek tabakaları, -20°C'de 10 dakika metanol ile 48 saat pi'de sabitlendi, üç kez PBS ile yıkandı ve 4°C'de taze PBS içinde saklandı işlenene kadar.

Aşağıdaki antikorlar kullanıldı: birincil fare monoklonal anti-NP antikorları (1:200) (NA05-AG12) [21] ve ikincil Alexa Fluor 488 konjuge anti-fare keçi antikorları (1:200) (A{{ 10}}) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ABD). Hücre çekirdekleri 40,6-diamidino-2- fenilindol (DAPI) (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) ile boyandı. Mikroskopi ve fotoğrafçılık verileri, bir QImaging Exi-Aqua kamera takılı (piksel boyutu: 6.45 um; fotodetektör alanı: 1392 x 1040 piksel2) bir Olympus IX71 floresan mikroskobu kullanılarak elde edildi.

Floresans verilerinin miktar tayini, Fiji yazılımı (sürüm 1.53v) (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD, ABD) kullanılarak yapıldı. DAPI lekeli çekirdeğin ve NP-pozitif hücrelerin manuel ölçümü, Fiji yazılımında (sürüm 1.53v) bulunan hücre sayacı eklentisi aracılığıyla manuel olarak gerçekleştirildi. NP viral antijen boyanması saptanabilirse hücreler pozitif kabul edildi. NP-pozitif hücrelerin yüzdesi, her alandaki NP-pozitif hücrelerin toplam hücrelere oranı olarak ifade edildi ve ardından ortalama yüzde belirlenerek sunuldu.

NP-pozitif hücrelerin floresan yoğunluğu, tek tek hücrelerin ortalama gri değerinin ölçülmesi ve arka plan floresansının çıkarılmasıyla elde edildi. Viral odaklar, NP-negatif hücrelerle çevrili NP-pozitif hücre grupları dikkate alınarak sınırlandırılmıştır. Viral odaklar, rastgele seçilen 3 farklı alandan alınan 3 farklı görüntü üzerinde sayıldı ve ortalama odak büyüklüğü, onları oluşturan hücre sayısına göre belirlendi.

2.8. Viral Nükleik Asit Tespiti

Üreticinin talimatlarına göre, Highway ADN/ARN PuriPrep-VIRUS kiti K1501 (Inbio Highway, Buenos Aires, Arjantin) kullanılarak enfekte hücre monotabakalarından nükleik asit ekstraksiyonu gerçekleştirildi. JUNV RNA viral yükü ve hücresel transkript ölçümü, RT-qPCR ile gerçekleştirildi. Ters transkripsiyon, rastgele primerler ve Moloney murin lösemi virüsü ters transkriptaz (M-MLV RT) kullanılarak yapıldı.

Parça amplifikasyonu için aşağıdaki primerler kullanıldı: JUNV-np (İleri: 5 0 -GGC ATC CTT CAG AAC ATC-30, Ters: 50 -CGC ACA GTG GAT CCT AGGC{{4} } ), ahr (İleri: 50 -ATC CTT CCA AGC GGC ATA GAG ACC-30; Geri: 50 -CAA AGA AGC TCT TGG CTC TCA GG-30 ), cyp1a1 ( İleri: 50 -TTCCGACACTCTTCCTTCGT-30; Geri: 50 -ATGGTTAGCCCATAGATGGG-30 ), -actin (İleri: 50 -TTA GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG{{17) }}; Ters: 50 -TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-30 ). PCR döngüsü ayrıntıları aşağıdaki gibidir: ilk denatürizasyon 95 ◦C'de 2 dakika; 95 ◦C'de 30 saniye, 58 ◦C'de 1 dakika ve 72 ◦C'de 1 dakikadan oluşan 45 amplifikasyon döngüsü; 72°C'de 5 dakikalık bir son döngü; son olarak erime eğrileri yapılmıştır. Tespit, MyiQ2 ekipmanı (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ABD) kullanılarak yapıldı. Sonuçlar 2−∆∆Ct (Fold change) olarak bildirildi ve temizlik geni olarak -actin kullanılarak normalleştirildi.

2.9. Plak Tahlili

Viral verimler, standart plak tahlili ile belirlendi. Hücre süpernatanları toplandı ve 37°C'de 1 saat boyunca Vero hücre tek tabakalarını enfekte etmek için seri dilüsyonlar hazırlandı. Viral adsorpsiyondan sonra inokulum çıkarıldı, yüzde 0,7 metilselülozla takviye edilmiş yüzde 5 MEM NBCS ilave edildi ve hücreler, yüzde 5 CO2 inkübatöründe 37°C'de 1 hafta süreyle inkübe edildi. Daha sonra hücre tek tabakaları, yüzde 10 formaldehit ile sabitlendi, yıkandı ve kristal menekşe ile boyandı. Viral titre, plak oluşturan birim (PFU) ölçümünden sonra hesaplandı.

2.10. İstatistiksel analiz

Mikroarray istatistiksel analizi, WebGestalt yazılımı (http://www.webgestalt.org/, 3 Temmuz 2020 tarihinde erişilmiştir) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler, istatistiksel anlamlılığı değerlendirmek için Windows 11 (GraphPad Software, San Diego, CA, ABD) için GraphPad Prism 8 (sürüm 8.0.1) tarafından Dunnett'in post hoc testi ile ortalama ± SD Tek Yönlü ANOVA olarak tanımlanmıştır. p 0.05'e eşit veya küçük olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

For more information:1950477648nn@gmail.com