İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Lütfen Bölüm 2 için buraya tıklayın

I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* ve Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1Nöral Rejeneratif Tıp Yüksek Lisans Enstitüsü, Tıp Bilimi ve Teknolojisi Koleji, Taipei Tıp Üniversitesi, Taipei 11031, Tayvan

2Moleküler Biyoloji Enstitüsü, Academia Sinica, Taipei 11529, Tayvan

3Klinik Tıp Enstitüsü, Tıp Fakültesi, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi, Tainan 70403, Tayvan

4Klinik Tıp Araştırma Merkezi, Ulusal Cheng Kung Üniversite Hastanesi, Tıp Fakültesi, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi, Tainan 70403, Tayvan

5Biyomedikal Bilimler Bölümü ve Lisansüstü Enstitüsü, Tıp Fakültesi, Chang Gung Üniversitesi, Taoyuan 33302, Tayvan

6Nörobilim Araştırma Merkezi, Chang Gung Memorial Hastanesi, Linkou 33302, Tayvan

7Müşteri kontağı

*Yazışma: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche hafızayı geliştirebilir

ÖZET

Fenotipik varyasyon, doğal seçilim yoluyla hücre ve organizma evrimi için temel bir ön koşuldur. Genetik olarak özdeş hücrelerin fenotipik çeşitliliğinde stokastik gen ekspresyonunun rolü iyi çalışılmış olsa da, stokastik gen ekspresyonu ile hayvanlardaki bireysel davranış varyasyonları arasındaki ilişki hakkında pek fazla şey bilinmemektedir. Belirli bir miRNA'nın (miR-466f-3p), bir Morris su labirenti görevi üzerine bireysel kendi içinde yetiştirilmiş farelerin bir bölümünün hipokampüsünde yukarı doğru düzenlendiğini gösterdik. Belirgin bir şekilde, miR- 466f-3p nöron morfolojisini, işlevini ve uzamsal öğrenmeyi pozitif olarak düzenler vehafızafarelerin yeteneği. Mekanik olarak miR-466f-3p, öğrenme/öğrenmenin negatif düzenleyicisi olan MEF2A'nın çevirisini bastırır.hafıza. Son olarak, hipokampal miR-466f-3p'nin çeşitli yukarı regülasyonunun, bireylerde hipokampal siklik AMP (cAMP)-tepki element-bağlanmasının (CREB) rastgele fosforilasyonundan kaynaklandığını gösteriyoruz. Uzamsal öğrenmenin modülasyonunun bu bulgusu vehafızaNöronal stimülasyon üzerine randomize bir hipokampal sinyal ekseni aracılığıyla, doku gen ekspresyonundaki varyasyonun çeşitli hayvan davranışlarına nasıl yol açtığının bir gösterimini temsil eder.

GİRİİŞ

Bireyler arasındaki fenotipik çeşitlilik, doğal seçilimin üzerinde etkili olduğu popülasyon çeşitliliğini sağladığı için evrimsel bir avantaj sağlar (Pavlicev ve diğerleri, 2011). Genetik arka planlar ve çevresel faktörler, bu tür doğal çeşitliliğin oluşmasına katkıda bulunur (Bendesky ve Bargmann, 2011). Deneysel olarak, akrabalı fareler, test edilen bireyler arasındaki genetik farklılıkların etkilerini en aza indirgemek için ortalama fenotiplerin ve davranışların moleküler ve hücresel temelini incelemek için sıklıkla kullanılmıştır (Casellas, 2011). Bununla birlikte, bireysel izogenik fareler arasında doku transkript bolluğunun varyasyonu gösterilmiştir. Oldukça değişken ekspresyon seviyeleri sergileyen genler genellikle bağışıklık fonksiyonu, stres tepkileri ve hormonal düzenleme, yani çevresel ipuçlarına duyarlı süreçler ile ilişkilidir (Vedell ve diğerleri, 2011). Bu çalışmalardan bazıları, annenin yalaması, uteroda besin sağlanması veya strese bağlı esneklik ve duyarlılık gibi çevresel faktörlerin etkisi olsun veya olmasın, gen ekspresyonu veya hücresel sinyalleşmedeki farklılıkların olduğunu göstermiştir (Bale, 2015; Danchin ve ark. ., 2011;

ve diğerleri, 2019; Pedersen ve diğerleri, 2011), fenotiplerde ve davranışlarda farklılıklara yol açabilir (Casellas, 2011; Locke ve diğerleri, 2015; Loos ve diğerleri, 2015; Oey ve diğerleri, 2015).

Mekansal öğrenme vehafızabeyin tarafından kontrol edilen oluşum iki sisteme ayrılabilir: (1) kendi kendine hareket ve iç ipuçlarını kullanan benmerkezci navigasyon ve (2) öncelikle hipokampusu ve organizmaların dışındaki uzak ipuçları tarafından uyarılan yakın beyin yapılarını içeren allosentrik navigasyon (Ekstrom ve diğerleri, 2014). Mekânsal öğrenme yeteneği vehafızaçoğu hayvan türünün, hayatta kalmaları için kritik olan uzamsal ve zamansal olarak değişken ortamlara uyum sağlamak için davranışlarını aşamalı olarak ayarlamasına izin verir. Bu, Morris su labirenti (MWM) gibi davranışsal paradigmalar uygulanarak laboratuvar hayvanlarında değerlendirilebilir (Vorhees ve Williams, 2014). Özellikle, genetik olarak özdeş akraba kemirgenlerin uzamsal öğrenmede fenotipik varyasyon sergiledikleri gösterilmiştir vehafıza(Tsai ve diğerleri, 2002), ancak bu davranışsal varyasyonun altında yatan mekanizmalar bilinmiyordu.

Yeni anıların oluşumu, aktiviteye bağlı genetik transkripsiyon, yeni protein sentezi ve yeni protein sentezi gerektiren karmaşık bir süreçtir.

Şekil 1. Uzamsal öğrenmenin varyasyonu vehafızayetenek ve miR-466f-3p indüksiyonu

(A) Yabani tip kendi içinde yetiştirilmiş C57BL/6J farelerinin MWM görevi. Sol panel: GLN farelerinin (noktalar) ve PLN farelerinin (kareler) MWM performansları. Test edilen toplam 289 fareden 180'i GLNve109olarakPLN olarak kategorize edildi.Sağ panel:MWMgörevinin(n=47ve herbir grubun 30'u) probeti.Dört çeyreğin ve platform bölgesinin herbirindeki ölçümler ve platform bölgesi histogramda karşılaştırıldı. P, eksik platformun yeri; T, P'siz hedef bölge; R, sağ bölge; O, karşı bölge; L, sol bölge. (B) miRNA ifadesinin RT-qPCR analizi. Beyin açısından zenginleştirilmiş bir pozitif kontrol olarak miR-466-669 kümesi ve miR-132-3p içinde yer alan altı miRNA'nın nispi ekspresyon seviyeleri, GLN ve PLN fare hipokampüsünden alınan dahili kontrol U6 snRNA ile analiz edildi ve normalleştirildi. (grup başına n=9–18). ben, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3s.

gibi ince ayarlanmış özel nöronal ağhafızayeni nöronal bağlantılar ve sürekli plastisite yapmak için engramlar (Asok ve diğerleri, 2019). Dentat girustaki (DG) seyrek nöron popülasyonları olan hipokampal engramlar, daha sonra artan aktivite gösteren nöron topluluklarını temsil eder.hafızaoluşum. DG engram nöronları oldukça farklı bir gen ekspresyonu modeli sergilerken (Rao-Ruiz ve diğerleri, 2019), altta yatan engrama özgü moleküler mekanizmalarhafızakonsolidasyon büyük ölçüde bilinmemektedir. Çeşitli faktörlerin ve sinyal yollarının öğrenmeyi olumlu ya da olumsuz olarak düzenlediği bilinmektedir.hafızasüreçler tanımlanmıştır (Abraham ve diğerleri, 2019; Humeau ve Choquet, 2019). Bunlar arasında, aktifleştirilmiş siklik AMP (cAMP)-tepki elemanı bağlayıcı protein (CREB) formu, nöronlarda hücre içi Ca2 artı aktiviteye bağlı artışlarına yanıt olarak gen transkripsiyonunu uyarır (Kandel, 2012). Öte yandan, kamp/PKApathway, yardımcı baskılayıcısı HDAC5'in nükleer ihracatını ve ortak aktivatör NFAT'nin nükleer ithalatını önleyerek myositenhancer faktör 2 (MEF2) transkripsiyonel aktivitesini baskılar (Belfield ve diğerleri, 2006). Ayrıca, CREB'den farklı olarak MEF2A aktivite kısıtlamalarıhafızaoluşumu (Cole ve diğerleri, 2012). Protein faktörlerinin yanı sıra, mikroRNA'lar (miRNA'lar), öğrenme ve hafıza dahil olmak üzere nöronal fonksiyonların düzenlenmesinde de rol oynar (McNeill ve Van Vactor, 2012). miRNA'lar, belirli mRNA'ların 30 çevrilmemiş bölgesindeki (30 UTR) tanıma bölgeleriyle diziye özgü baz eşleşmesi yoluyla öncelikle gen ekspresyonunun transkripsiyon sonrası düzenleyicilerini etkileyen küçük (22 nt) kodlayıcı olmayan RNA'lardır (Daugaard ve Hansen, 2017). miRNA'lar mitotik sonrası nöronlarda bir dizi sinyal yolağına katılır ve dendritik büyüme ve dallanma, sinaps oluşumu ve olgunlaşma dahil olmak üzere aktiviteye bağlı hücresel süreçlere aracılık eder. Gen ekspresyonunu düzenleyerek, uzun süreli sinaptik plastisite formlarında da önemli roller oynarlar.hafızaoluşum, erişim ve konsolidasyon (Chen ve Shen, 2013; Wang ve diğerleri, 2012b).

Aşağıda, hayvanlarda stokastik doku gen ekspresyonu ile bireysel davranışsal varyasyon arasında nedensel bir bağlantı olduğuna dair kanıtlar sunuyoruz. Özellikle, hipokampal CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A ekseninin stokastik aktivasyonunun uzamsal öğrenmenin bireysel varyasyonunu modüle ettiğini vehafızadoğuştan farelerde yetenek.

SONUÇLAR

Mekansal öğrenmenin bireysel varyasyonu vehafızayeteneği, belirli bir miRNA kümesinden miR-466f-3p indüksiyonu ile ilişkilidir

Öğrenmenin düzenlenmesinde yer alan miRNA'ları belirlemek vehafızaoluşumunda, MWM görevini, iyi veya zayıf öğrenme ve hafıza kabiliyetine sahip, doğuştan vahşi tip C57BL/6J fareleri ayırt etmek için kullandık (Şekil 1A). Son (6.) oturumda görevi 30 s içinde tamamlayan fareleri “iyi öğrenenler” (GLN), son oturumda 30 s içinde platformu bulamayan fareleri ise “zayıf öğrenenler” olarak tanımladık. ' (PLN). Şekil 1A'da (sol panel) gösterildiği gibi, farelerin yüzde 62'si GLN grubuna (289 farenin 180'i) aitti ve kaçış gecikmesinde 98.1 s'den (1. seans) 21.8 s'ye (6. seans) belirgin bir azalma sergiliyordu. Buna karşılık, farelerin kalan yüzde 38'inin kaçış gecikmesi, PLN grubu (289 farenin 109'u), birinci ve altıncı seanslar arasında sadece orta derecede azaldı (1. seansta 111.8 sn'den 6. seansta 82,1 sn'ye) . Farelerin altı seans boyunca görevi gerçekten öğrendiğini gösteren araştırma testi, GLN farelerinin platform bölgesinde PLN farelerine göre daha uzun süre kaldığını da gösterdi (Şekil 1A, sağ paneldeki sol çubuk çifti).

Daha sonra, miRNA mikrodizi hibridizasyonu ile GLN ve PLN farelerinin hipokampüsünden RNA'ları analiz ettik (her grup için n=4). Genel olarak, GLN ve PLN farelerinden hipokampal miRNA'ların ekspresyon profillerinde nispeten küçük farklılıklar gözlemledik. Bununla birlikte, GLN farelerinde ekspresyon seviyelerinin PLN farelerinden daha yüksek olduğu ilk 10 miRNA'nın (veriler gösterilmemiştir) hepsinin intron 10'da bulunan aynı kemirgen-spesifik miRNA kümesinden, miR-466-669 türetildiğini kaydettik. mSfmbt2 geni (aşağıya bakınız). Kümedeki seçilen miRNA'ların ekspresyon seviyelerinin ters transkripsiyon-nicel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) analizine dayanarak, daha fazla araştırma için miR-466f-3p'yi seçtik (Şekil 1B). Bu miRNA'nın ortalama ifadesi, PLN farelerine göre GLN farelerinin hipokampüsünde 1.5-kat daha yüksekti. Özellikle, ortalama hipokampal miR-466f-3p seviyeleri, PLN grubu, ev kafesi (HC) kontrol grubu ve yüzme kontrol grubu (Şekil 1C) arasında benzerdi, dolayısıyla egzersizle ilgili etkiler hariç tutuldu. yüzmek ve miR-466f-3p'nin uzamsal öğrenme sırasında indüklendiği fikrini daha da desteklemek vehafızaoluşum.

Şekil 1C'de, veriler, GLN farelerinin yüzde 42'sinden fazlasının hipokampal miR-466f-3p'nin ifade seviyelerinin, farelerin ortalama ifade seviyesinden en az 15-kat daha yüksek olduğunu ortaya koymaktadır. HC kontrol fareleri, oysa PLN farelerinin yüzde 15'indeki seviyeler HC farelerininkinin yarısı kadardı. GLN farelerinin yaklaşık yüzde 25'i ve PLN farelerinin yüzde 55'i benzer miR-466f{{10}p (0.8- ila 1.2- seviyelerine sahipti) HC'ye göre katlayın). Prob testi sırasında platformdaki miR-466f-3p seviyeleri ile yüzde süresi arasında pozitif bir korelasyon gösteren Pearson korelasyon dağılım grafiği Şekil 1D'de sunulmaktadır. Ayrıca hem GLN hem de PLN farelerinde beyin dilimlerinin miR-466f-3p ve U6 küçük nükleer RNA (snRNA) in situ hibridizasyonunu (ISH) gerçekleştirdik (Şekil 1E). ISH yoluyla miR- 466f-3p sinyallerinin istatistiksel analizi, miR-466f- 3p indüksiyonunun gerçekten de GLN farelerinin DG'sinde farelere göre daha büyük olduğunu doğruladı.

PLN fareleri, oysa U6 snRNA sinyalleri karşılaştırıldığında hiçbir fark bulunmadı (sağ histogram, Şekil 1E). DG'deki tek tek granül hücreler arasında miR-466-3p sinyalleri eşit olmamasına rağmen, PLN farelerine kıyasla GLN farelerinin hipokampüsünde hala önemli ölçüde ve her yerde artış gösterdiler. Bu nedenle miR-466f-3p indüksiyonu hücrelerin sadece küçük bir kısmında, örneğin engram nöronlarında gerçekleşmedi. Bu veriler, MWM görevi sırasında miR-466f-3p'nin yukarı regülasyonunun daha iyi uzamsal öğrenme ve daha iyi uzamsal öğrenme ile yakından ilişkili olduğunu göstermektedir.hafızaGLN farelerinin önemli bir oranı arasında yetenek.

RT-qPCR ile birkaç beyne özgü miRNA'nın ortalama ekspresyon seviyelerini de analiz ettik. Bunların arasında, MWM görevinden sonra fare hipokampüsünde miR-132-3p yukarı regüle edildi, ancak GLN ve PLN grupları arasında önemli farklılıklar gözlemlemedik (çubuk çifti VII, Şekil 1B). miR-335-5p ve miR-22 ekspresyon seviyeleri GLN, PLN ve HC grupları arasında benzerdi (Şekil S1A). Bu nedenle, miR-466f-3p'den farklı olarak, MWM eğitimi sırasında bu miRNA'ların hipokampal ifadesi uzamsal öğrenme ile ilişkili değildir vehafızafarelerin yeteneği.

miR-466f-3p yukarı regülasyonu, nörit büyümesini ve dendritik omurga oluşumunu destekler

miR-466f-3p'nin gerçekten nöronlarda ifade edildiğini doğrulamak için, primer hipokampal nöronlarda NeuN ve MAP2'nin immünofloresan (IF) boyaması ile birlikte miRNA ISH yaptık. Sonuçlar, diğer miRNA'lara benzer şekilde (Cohen ve diğerleri, 2011; Thomas ve diğerleri, 2017), miR-466f-3p'nin bazı ek sinyallerle birlikte esas olarak nöronal soma bölgesinde ifade edildiğini gösterdi. dendritlerde (Şekil S2A). Yukarı regüle edilmiş miR-466f-3p'nin öğrenme ile ilişkisinin moleküler ve hücresel temelini anlamak vehafızaoluşumunda, ilk olarak miR-466f-3p'yi, pFUGW-miR-466f-3p-'den gelen ubikuitin promotörünün kontrolü altında bir dsRed füzyon polipeptidi ile birlikte aşırı eksprese ettik. dsRed plazmidi DIV10 birincil hipokampal nöronlara (Şekil S2B) dönüştürülür. miRNA ISH aracılığıyla, miR-466f-3p sinyalinin miR-466f-3p aşırı ekspresyon grubunda vektör kontrolüne veya mutant miR{{'ye göre daha güçlü olduğunu doğruladık. 12}}f-3p grubu (oklar, Şekil S2B). Paralel olarak, miR-466f-3p fonksiyon kaybının miR-466f-3p inhibisyonu ile etkisini incelemek için bir platform kurduk. pFUGW-miR-sünger-EGFP plazmitinden eksprese edilen EGFP mRNA'nın 30 UTR'si (Şekil S2C). Sünger plazmitteki EGFP muhabiri, hem transfeksiyon etkinliğinin bir göstergesi hem de hücresel miRNA aktivitesinin bir sensörü olarak hizmet etti (Kluiver ve diğerleri, 2012). Transfekte edilmiş HEK293T hücrelerinin önemli bir kısmında, EGFP sinyali, vahşi tip miR-466f-3p ile birlikte ekspresyon üzerine azaldı, ancak mutant miR-466f{{32 ile azalmadı. }}p, 30 UTR'de miR-466f-3p'nin miR- süngere bağlanmasıyla EGFP mRNA çevirisinin inhibisyonu nedeniyle (soldaki dört görüntüyü ve iki his programını karşılaştırın, Şekil S2C) . Buna karşılık, pFUGW-SCR-sünger-EGFP plazmidinden şifreli bir dizinin sekiz kopyasını kodlayan kontrol süngerinin miR-466f-3p veya mutantı (sağdaki dört görüntüyü ve iki histogramı karşılaştırın).

Şekil 2A'da gösterildiği gibi, miR-466f-3p'nin ektopik ifadesi, nöronların morfolojik değişiklikleriyle sonuçlandı, en önemlisi, dsRed eksprese eden vektör pFUGW- ile transfekte edilmiş kontrol nöronlarına göre nörit büyümesini artırdı. dsRed veya mutant miR-466f-3p ifade eden plazmit pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Niceleme verileri, nöron başına ortalama dendritik dal sayısının miR-466f-3p-aşırı ifade eden grup (çubuk II) ile vektör veya mutant kontrol (çubuklar I ve III) (sağda) arasında önemli ölçüde farklı olmadığını göstermiştir. üst histogram, Şekil 2A). Bununla birlikte, ortalama toplam dendrit uzunluğu ve birincil dendritlerin ortalama uzunluğu, miR-466f-3p aşırı ekspresyonu üzerine arttı (II. Çubuğu I ve III. Çubuklarla karşılaştırın, Şekil 2A'nın sağ alt histogramı). Paralel olarak, miR-sünger kullanarak endojen miR-466f-3p'yi engelledik. Görüldüğü gibi miR-466f-3p-inhibisyon ve kontrol grupları arasında dendritik dal sayısı açısından anlamlı bir fark yoktu (IV. çubuğu çubuk I ve V ile karşılaştırın, sağ üst histogram, Şekil 2A) , ancak miR-466f-3p-inhibisyon grubu, diğer gruplara göre ortalama toplam dendrit uzunluğunda ve ayrıca birincil ve ikincil dendritlerin ortalama uzunluklarında dikkate değer bir azalma gösterdi (çubuk IV'ü çubuk I ve çubuklarla karşılaştırın). V, Şekil 2A'nın sağ alt histogramı). Ayrıca, IF boyama, miR- 466f-3p aşırı ifadesinin inhibisyon değil, aynı zamanda dendritik dikenlerin yoğunluğunu da arttırdığını gösterdi (Şekil 2B, üst paneller ve sol alt histogram). Ayrıca, postsinaptik yoğunluk proteini 95 (PSD-95) için birlikte boyama gerçekleştirdik ve tam sayıda uyarıcı sinaps oluşturmak için ortak lokalize dendritik dikenlerin yoğunluğunu saydık (Şekil 2B, sağ alt histogram), bu da miR{{40'ı ortaya çıkardı. }}f-3p aşırı ekspresyonu, diğer kontrol gruplarına kıyasla PSD-95-pozitif dikenlerin yoğunluğunu arttırdı. Bununla birlikte, miR-466f-3p inhibisyonu, kontrol gruplarına göre PSD-95-pozitif dikenlerin yoğunluğunu önemli ölçüde değiştirmedi (Şekil 2B, sağ alt histogram). Birlikte, bu veriler, nöronal uyarının yokluğunda, miR-466f-3p inhibisyonunun tek başına uyarıcı sinapsların veya toplam dendritik dikenlerin yoğunluğunu etkilemediğini gösterir.