BÖLÜM 1 Süpürgelerden (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria ve P. Ramosa) İzole Edilen Fenilpropanoid Glikozitlerin Antioksidan ve Antikoagülan Etkileri

Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,

Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*

a Ło´d´z Üniversitesi, Genel Biyokimya Bölümü, Biyoloji ve Çevre Koruma Fakültesi, 90-236 Ł´od´z, Polonya

b Biyokimya ve Mahsul Kalitesi Bölümü, Toprak Bilimi ve Bitki Yetiştirme Enstitüsü, Devlet Araştırma Enstitüsü, 24-100 Puławy, Polonya

Biyolojik Çeşitliliği Araştırma ve Koruma Merkezi, Çevre Biyolojisi Bölümü, Biyoloji Enstitüsü, Jan Kochanowski Üniversitesi, 25-406 Kielce, Polonya

Soyut

Orobanchaceae'nin holoparazitik bitkileri,cistanche, Orobanche ve Phelipanche spp, fenilpropanoid glikozitlerin (PPG'ler) zenginlikleriyle bilinirler. Birçok PPG bileşiğinin, antimikrobiyal, anti-inflamatuar, antioksidan ve hafıza geliştirici gibi geniş bir aktivite yelpazesine sahip olduğu bulunmuştur. Avrupa süpürgelerinin (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) ve on tek izole fenilpropanoid bileşeninin biyoaktivite potansiyelini daha iyi araştırmak için, bunların antiradikal etkilerini, plazmada oksidasyona karşı koruyucu etkilerini in vitro sistemde araştırdık. ve pıhtılaşma parametreleri üzerindeki etkisi. Test edilen özler, Trolox'un gücünün yüzde 50-70'i kadar bir temizleme etkinliği gösterdi. OC özü, zenginasteosit, asil biriminde bir B-halkası katekol parçası olmayan tek PPG içeren PR özünden yüzde 20'nin üzerinde daha iyi antiradikal potansiyele sahipti. Ayrıca, sadece sekiz test edilmiş PPG'nin H2O2/Fe ile muamele edilmiş insan plazmasında antioksidan potansiyel gösterdiği bulunmuştur; bununla birlikte, test edilen üç PPG, antioksidan özelliklere ek olarak antikoagülan potansiyele sahipti. PPG'lerin yapısının, özellikle asil ve katekol kısımlarının mevcudiyetinin, esas olarak antioksidan özellikleri ile ilişkili olduğu görülmektedir. Bu bileşiklerin antikoagülan potansiyeli kimyasal yapıları ile de ilgilidir. Seçilmiş PPG'ler, oksidatif stres ile ilişkili kardiyovasküler hastalıkları tedavi etme potansiyeli sergiler.

Daha fazla bilgi için lütfen iletişime geçin:Joanna.jia@wecistanche.com

cistanchetubulosa'nın birçok etkisi vardır

1. Giriş

Oksidatif stres, hızlandırılmış yaşlanma ve bazı kanserler dahil olmak üzere canlı organizmaların sağlığı üzerindeki olumsuz etkisi ile yaygın olarak bilinir. Oksidatif stresin ortaya çıkması, vücut hücrelerinde oksidatif ve antioksidatif mekanizmalar (enzimatik (katalaz, glutatyon peroksidaz) ve enzimatik olmayan (glutatyon) savunma dahil) arasındaki dengesiz bir denge ile ilişkilidir [1]. Oksitleyici radikaller ve kapalı kabuklu türler dahil olmak üzere reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı üretimi, oksidatif stres oluşumunun arkasındaki ana mekanizmalardan biridir. Bununla birlikte, ROS'un neden olduğu biyolojik etki, büyük ölçüde konsantrasyona, maruz kalma süresine ve yere bağlıdır. Normal koşullar altında (düşük konsantrasyon) oksijen/azot radikalleri ikincil haberciler rolünü oynayabilir, ancak daha yüksek düzeyde hücre zarları gibi biyolojik yapılarla reaksiyona girmeye başlayabilirler [2]. Tüm ROS türleri arasında, bir hidroksil radikali (HO.), biyo-makromoleküllere en büyük zararlardan birine neden olur: proteinler, lipitler ve DNA. Oksidatif stresin kardiyovasküler olanlar da dahil olmak üzere bir dizi hastalıkta önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Kan sistemi bozuklukları, hemostazın ve plazma biyobelirteçlerinin çeşitli parametrelerindeki değişikliklerle ilişkilendirilmiştir ve/veya bundan önce gelmiştir [1,3].

Öte yandan, polifenoller ve çoklu doymamış yağ asitleri gibi birçok doğal madde, reaktif oksijen türlerinin oluşumunu önleyebilen ve/veya azaltabilen güçlü antioksidanlar olarak tanımlanmıştır. Bu özelliklere sahip bileşikler, birçok gıda ürününde ve bitki kaynaklı farmasötik preparatlarda bulunur. Bu nedenle, taze sebze ve meyvelerle zenginleştirilmiş bir diyet ve doğal antioksidanlara dayalı antioksidan tedaviler, oksidatif stres seviyesini azaltabildikleri ve çeşitli patofizyolojik süreçleri önleyebildikleri için yaygın olarak tavsiye edilmektedir [4,5]. Bitki polifenolleri, yaygın olarak dağıldıkları ve antimikrobiyal, antioksidan ve antienflamatuar gibi çeşitli biyolojik etkiler sergiledikleri için fenolik asitlerin önemli bir yer işgal ettiği çeşitli ikincil metabolitler grubudur. Fenilpropanoid glikozitler (PPG'ler), hidroksisinamik asidin ester akrabalarıdır ve holoparazitik Orobanchaceae bitkilerinde bulunan sekonder metabolitlerin ana/tek sınıfıdır.cistanche, Orobanche ve Phelipanche spp. Bu ailenin birkaç türü, çiftçilerin tarlalarda kurtulmak istedikleri ciddi mahsul zararlılarıdır (örneğin Phelipanche ramosa), çok azı farmakolojide kullanılırken, çoğu insanlar için çok az öneme sahiptir. bitkicistancheAsya geleneksel tıbbında böbrek yetmezliği tedavisinde ve bağışıklık ve hafıza arttırıcı, yaşlanmayı geciktirici ve yorgunluk önleyici ajan olarak yaygın olarak kullanılmaktadır [6]. Çeşitli araştırma gruplarının fitokimyasal analizleri, asetonid, ekinakozit ve podyum tarafı gibi fenilpropanoid glikozitlerin Herba Cistanche'ın ana aktif bileşenlerinden biri olduğunu göstermiştir [7]. Jedrejek ve diğerleri tarafından Polonya'da bulunan birkaç süpürge türü hakkında yakın zamanda yapılan bir çalışma. [8], bu bitki materyalinin benzer bir kalitatif bileşime (PPG'lerin hakimiyeti) sahip olduğunu, ayrıca, eşdeğer veya hatta aştığını göstermiştir.cistanchespp. aktif maddelerin içeriği açısından [8].

Cistanche Deserticola'nın birçok etkisi vardır, daha fazlasını öğrenmek için buraya tıklayın

Bu çalışma, çeşitli fenil bakımından zengin üç süpürge otu ekstraktının (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Phelipanache Arenaria – PA ve P. ramosa – PR) antiradikal ve antioksidan potansiyelinin yanı sıra hemostaz parametreleri üzerindeki etkisini değerlendirmeyi amaçlamıştır. -

prostanoidler ve bunların tekli PPG bileşenleri. Antiradikal kapasite 2,2′-azinobis-3-etilbenztiazolin-6-sülfonik asit/Trolox Eşdeğeri (ABTS/TE) ve 2,2-difenil-1-pikrilhibrazil (DPPH) kullanılarak ölçüldü. ) testler. Plazma test sistemindeki oksidatif stres, bir hidroksil radikali (H2O2/Fe), ardından lipid peroksidasyonu (tiobarbitürik asit-reaktif türler (TBARS) tahlili) kullanılarak indüklendi ve protein karbonil ve tiyol gruplarının seviyesi ölçüldü. Belirlenen hemostaz parametreleri arasında şunlar vardı: aktive parsiyel tromboplastin zamanı (APTT), protrombin zamanı (PT) ve trombin zamanı (TT).

2. Malzemeler ve yöntemler

2.1. kimyasallar

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radikali (DPPH), 2,2'-azinobis-3-etilbenztiazolin-6-sülfonik asit (ABTS), potasyum persülfat, {{9 }}hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilik asit (Trolox), dimetilsülfoksit (DMSO), tiyobarbitürik asit (TBA), formik asit (LC-MS derecesi), ve H2O2, Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO., ABD) satın alındı. Metanol (HPLC gradyan derecesi) ve asetonitril (LC-MS derecesi) Merck'ten (Darmstadt, Almanya) elde edildi. on fenil-

2′-O-asetillakteosit (yüzde 97), 2′-O-asetilpoliumozit (yüzde 98), 3-O-metilpoliumosid (yüzde 96), asetonid (yüzde 99), arena dahil olmak üzere bu çalışmada test edilen propanoik bileşikler içeride (yüzde 97), crenatoside (yüzde 98), teniposide (yüzde 99), poliumoside (yüzde 99), tubuloside A (yüzde 96) ve wiedemannioside D (yüzde 96) aşağıda verilen bitki materyalinden daha önce tarafımızdan izole edilmiştir [ 8]. Bileşiklerin saflığı, bir UHPLC-PDA-MS analizi kullanılarak değerlendirildi. Ultra saf su, bir Milli-Q su arıtma sistemi (Millipore Co.) kullanılarak kurum içinde hazırlandı. Diğer reaktifler analitik derecedeydi ve yerel ticari tedarikçiler tarafından sağlandı.

2.2. Bitki materyali

Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel ve P. Ramos (L.) Pomel dahil olmak üzere üç süpürge türünün çiçekli bitkileri prof. Renata Piwowarczyk (Jan Kochanowski Üniversitesi, Kielce, Polonya) ve Polonya'daki doğal bir kaynaktan toplanmıştır.

Kupon örnekleri (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦K, 20.4000◦E), xerothermic otlak, parazitize Galium boreale, Mayıs 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◦K, 22.5801◦E), psammoma- lu otlak ve nadas, parazitize Artemisia campestris, Haziran 2014;

P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), tarla, parazitize Solanum Lycopersicum, Eylül 2014), Kielce'deki Jan Kochanowski Üniversitesi'nin (KTC) Herbaryumunda depolanmıştır. Bitki materyali, ekstraksiyondan önce liyofilize edildi ve ince bir şekilde öğütüldü.

2.3. Süpürge özlerinin hazırlanması

Toz haline getirilmiş bitki materyali (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 gr, P. Arenaria (PA) – 3 gr ve P. ramosa (PR) – 3 gr), 40 ◦C'de ve 1500 psi'de (çözücü basıncı) yüzde 80 MeOH ile ekstrakte edildi. ) hızlandırılmış bir ASE 200 kullanarak

çözücü çıkarıcı (Dionex, Sunnyvale, CA, ABD). Ekstraktlar buharlaştırıldı ve dondurularak kurutuldu (Gamma 2-16 LSC dondurarak kurutucu, Christ, Almanya). OC, PA ve PR için ekstraksiyon verimliliği, bitki materyalinin ağırlığına göre sırasıyla yüzde 55, yüzde 37 ve yüzde 43 idi. Yüksek karbonhidrat içeriği nedeniyle (veriler gösterilmemiştir), ham ekstraktlar, Oasis HLB mikro kolonu (500 mg; Waters, Milford, MA, ABD) üzerinde katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile daha da saflaştırıldı. Şekerler yüzde 1 MeOH ile çıkarıldı, ardından ilgili bileşikler yüzde 80 MeOH ile ayrıştırıldı. Çözücünün çıkarılmasından sonra, OC, PA ve PR özleri liyofilize edildi (Gamma 2-16 LSC dondurarak kurutucu) ve SPE saflaştırma verimleri yüzde 53 (OC), yüzde 67 (PA) ve yüzde 51 (PR) idi. .

2.4. Süpürge özlerinin fitokimyasal özellikleri

Süpürge özlerinin kalitatif ve kantitatif analizleri, bir fotodiyot dizi detektörüne (PDA) bağlı bir ACQUITY UPLC sistemi (Waters) ve bir tandem dört kutuplu kütle spektrometresi (TQD-MS/MS) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Dondurularak kurutulmuş OC, PA ve PR özleri, 0,50 mg/mL'lik bir konsantrasyonda yüzde 50 metanol içinde çözündürüldü ve daha sonra

BEH C18 kolonu (100 x 2.1 mm, 1.7 um, Waters) üzerinde kromatografiye tabi tutulmuştur. Kromatografik koşullar aşağıdaki gibidir: fırın sıcaklığı – 25 ◦C,

lineer gradyan 10→mobil faz B'nin yüzde 25'i (asetonitril içinde yüzde 00,1 formik asit) mobil faz A'da (H2O'da yüzde 00,1 formik asit) 12'nin üzerinde min, akış hızı – 0,4 mL/dak, enjeksiyon hacmi – 2 μL, UV aralığı – 190–490 nm (3.6 nm çözünürlük). MS analizi, aşağıdaki ayarlar kullanılarak elektrosprey iyonizasyon (ESI) ile negatif iyon modunda gerçekleştirilmiştir: tarama aralığı 100–1200 m/z; kılcal voltaj 2,8 kV; koni voltajı 35 V;

kaynak sıcaklığı 150 ◦C; desolvasyon sıcaklığı 450 ◦C; çölleşme

gaz akışı 900 L/h ve koni gaz akışı 100 L/h. Veri toplama ve işleme, Waters MassLynx 4.1 yazılımı kullanılarak yapıldı.

Fenilpropanoid glikozit (PPG) zirveleri, elde edilen LC-MS verilerinin daha önce izole edilmiş bileşiklerinkilerle karşılaştırılmasıyla tanımlandı [8]. Süpürge özleri içindeki PPG'lerin niceliği, 330 nm'de algılama ile UPLC-UV yöntemine ve kullanılarak harici bir standart kalibrasyona dayanmaktadır.asteosit(Sigma-Aldrich, yüzde 99, HPLC) olarak

grup standardı. 1-200 ug/mL aralığında altı konsantrasyonda doğrusal bir kalibrasyon eğrisi hazırlandı ve iyi doğrusallık gösterdi (R2

0.999). Nicel sonuçlar, üç enjeksiyonun ortalama SD değerini temsil eder ve miligram olarak ifade edilir.asteositözütün gramı başına eşdeğerler (eq) (mgasteositeşdeğer/g).

2.5. İn vitro antiradikal aktivite

2.5.1. ABTS radikal süpürme testi

ABTS antiradikal testi, Kontek ve diğerleri tarafından açıklanan yöntem kullanılarak gerçekleştirilmiştir. [9], aşağıdaki gibi küçük değişikliklerle: Reaktifleri hazırlamak için yüzde 20 MeOH kullanıldı (7 mM ABTS ve 4.9 mM potasyum per-

sülfat); 100-400 ug/mL aralığında dört konsantrasyon seviyesinde OC, PA ve PR ekstraktlarının çözeltileri ve 10 250 ug/mL aralığında altı konsantrasyon seviyesinde Trolox çözeltileri hazırlandı. yüzde 50 MeOH. Numunenin ABTS çalışma solüsyonuna oranı 1:25 (v/v) idi. 734 nm'de absorbans, 30 dakikalık inkübasyondan sonra ölçülmüştür.

karanlıkta bir UV-vis spektrofotometresi (Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ABD).

Absorbans inhibisyonu (yüzde ) şu şekilde hesaplandı: [(Absecon-

trol–Mutlak)/Mutlak kontrol] ×100.

Süpürge özlerinin Trolox Eşdeğerleri (TE) hesaplandı

TE=mörnek/mstandart formülünü kullanarak, burada m doğrunun eğimidir

çizgi eğrileri (absorbans inhibisyonuna karşı konsantrasyon). TE değeri

örnek, Trolox'a karşı normalleştirilmiş etkinliğini açıklar (TEstandard =

1.0). OC, PA ve PR özleri ve Trolox için IC50 değerleri,

deneysel olarak ulaşıldı, daha sonra düz çizgilerinden hesaplandı

eğriler (absorbans inhibisyonuna karşı konsantrasyon) ve şu şekilde ifade edilir

ug/mL.

Test üç kopya halinde yapıldı ve sonuçlar sunuldu

ortalama olarak ± standart sapmalar (SD).

2.5.2. DPPH radikal süpürme tahlili

DPPH antiradikal testi, Jedrejek ve ark. [8] ve Brand-Williams ve ark. [10], aşağıdaki gibi küçük değişikliklerle: 50▽ 250 ug/mL aralığında dört konsantrasyon seviyesinde OC, PA ve PR ekstraktlarının çözeltileri ve 10▽ aralığında altı konsantrasyon seviyesinde Trolox çözeltileri. 250 ug/mL, yüzde 50 MeOH ile hazırlandı. Numunenin DPPH'ye oranı 1:19 (h/h) idi. 517 nm'deki absorbans, bir UV-vis spektrofotometre (Evolution 260 Bio) kullanılarak karanlıkta 30 dakikalık inkübasyondan sonra ölçülmüştür. Absorpsiyon inhibisyonu (yüzde ) şu şekilde hesaplandı: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] ×100. Test numunelerinin Trolox Eşdeğeri (TE) ve IC50 değerleri, ABTS testinde (Bölüm 2.5.1) olduğu gibi hesaplanmıştır. Tahlil üç kopya halinde yapıldı ve sonuçlar ortalama ± SD olarak sunuldu.

2.6. İnsan plazması ile deneyler için test edilmiş bitki bileşiklerinin ve özlerinin stok çözeltileri

Test edilen bileşiklerin ve bitki özlerinin stok çözeltileri, yüzde 50 DMSO içinde hazırlandı. Test edilen numunelerdeki nihai DMSO konsantrasyonu yüzde 0,05'ten düşüktü ve etkileri tüm deneylerde belirlendi.

2.7. İnsan plazma izolasyonu

İnsan kanı veya plazması, bir kan bankasına (Lodz, Polonya) ve bir tıp merkezine (Lodz, Polonya) altı düzenli donörden (sigara içmeyen erkek ve kadın) alındı. Kan, bir CPD solüsyonu (sitrat/fosfat/dekstroz; 9:1; h/h kan/CPD) veya CPDA solüsyonu (sitrat/fosfat/dekstroz/adenin; 8.5:1; h/h; kan/CPDA) olarak toplanmıştır. Bağışçılar, bağıştan en az iki hafta önce herhangi bir ilaç veya bağımlılık yapıcı madde (tütün, alkol ve antioksidan takviyesi dahil) almamıştı. Kan örneklerine ilişkin analizimiz, Helsinki İnsan Araştırmaları Deklarasyonu yönergelerine göre yapıldı ve Lodz Üniversitesi İnsan Deneylerinde Araştırma Etiği Komitesi tarafından onaylandı. Plazma, taze insan kanının oda sıcaklığında 25 dakika 4500xg'de santrifüjlenmesiyle hazırlandı. Protein konsantrasyonu, Whitaker ve Granum [11] prosedürüne göre 280 nm'de test edilen örneklerin absorbansı ölçülerek hesaplandı.

2.8. İnsan plazmasında oksidatif stres belirteçleri

2.8.1. Lipid peroksidasyon ölçümü

Plazma lipid peroksidasyonu, tiyobarbitürik asit reaktif maddelerin (TBARS) konsantrasyonu ölçülerek nicelendirildi. TBARS konsantrasyonu, molar yok olma katsayısı (ε=156,000 M 1 cm1) kullanılarak hesaplandı. Yöntem daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır [12,13]. 2.8.2. Karbonil grubu ölçümü Karbonil gruplarının seviyesi molar yok olma katsayısı (ε=22,000 M 1 cm1) kullanılarak hesaplandı ve Bartosz'a göre nmol karbonil grupları/mg plazma proteini olarak ifade edildi [ 13] ve Levine ve ark. [14]. 2.8.3. Tiyol grubu tayini Plazma proteinlerindeki tiyol grubu içeriği, bir SPECTROstar Nano Mikroplaka Okuyucu (BMG LABTECH, Almanya) kullanılarak 412 nm'de 5,5'-ditiol-bis-(2- nitrobenzoik asit) ile spektrofotometrik olarak ölçüldü. Yöntem başka bir yerde daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır [15-17].

2.9. Hemostaz parametreleri

2.9.1. Protrombin zamanı (PT) ölçümü

PT, bir Optik Pıhtılaşma kullanılarak koagülometrik olarak belirlendi

Harfler Tukey testinin sonuçlarını gösterir (p < 0.05), değerler aynı

Bir satırdaki harf önemli ölçüde farklı değildir.

2.9.2. Trombin zamanı (TT) ölçümü

TT, Malinowska ve ark. [18].

2.9.3. Aktive parsiyel tromboplastin zamanı (APTT) ölçümü

APTT, Mali Now ska ve arkadaşlarına göre bir K-3002 Optik Pıhtılaşma Analiz Cihazı (Kselmed, Grudziadz, Polonya) kullanılarak koagülometrik olarak belirlendi. [18].

2.10. Veri analizi Belirsiz verileri ortadan kaldırmak için Q-Dixon testi yapıldı.

Veriler Shapiro-Wilk testi ile normal dağılım ve Levene testi ile varyans eşitliği için test edildi. İstatistiksel olarak anlamlı farklılıklar ANOVA, ardından Tukey çoklu karşılaştırma testi veya Kruskal-Wallis testi kullanılarak belirlendi. Karşılaştırmalar p < 0.05'te="" önemli="" kabul="" edildi.="" değerler,="" ortalama="" ±="" sd/sem="" olarak="">