Bölüm 1 UPLC-QTOF / MS ve DNA Barkodlamasına Dayalı Cistanches Herba'nın Kimyasal Ve Genetik Ayrımcılığı
Mar 03, 2022
İletişim: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com
Soyut
Cistanches Herba"Çölün Ginseng'i" olarak bilinen (Rou Cong Rong), özellikle yang'ı güçlendirmek için böbrek takviyesinde, güç ve beslenme üzerinde çarpıcı bir iyileştirici etkiye sahiptir. Bununla birlikte, Cistanches Herba, Cistanche deserticola ve Cistanche tubulosa'nın iki bitki kökeni, farmakolojik etki ve kimyasal bileşenler açısından farklılık gösterir. Bu çalışmada ilk olarak Cistanches Herba'nın bitki kökenini ayırt etmek için, kimyasal ve genetiğin birleşik bir yöntem sistemi - UPLC-QTOF / MS teknolojisi ve DNA barkodlaması - kullanılmıştır. Sonuçlar, PCA ve OPLS-DA analizleri ile iki kökeni ayırt etmek için üç potansiyel belirteç bileşiğinin (kampneoside II, cistanoside C ve cistanoside A'nın bir izomeri) elde edildiğini göstermiştir. DNA barkodlaması, iki kökeni doğru bir şekilde ayırt etmeyi sağladı. NJ ağacı, iki kökenin iki klad halinde kümelendiğini gösterdi. Bulgularımız, Cistanches Herba'nın iki kökeninin farklı kimyasal bileşimlere ve genetik varyasyonlara sahip olduğunu göstermektedir. Bu, Cistanches Herba'nın iki kökeninin ilk bildirilen değerlendirmesidir ve bulgu, kalite kontrolünü ve klinik uygulamasını kolaylaştıracaktır.
Giriş
Cistanches Herba"Çölün ginsengi" olarak bilinen (Rou Cong Rong), kurutulmuş etli saplardan kaynaklanır.Cistanche deserticolaYC Ma veCistanche tubulosa(Schrenk) Çin Farmakopesine (2010 baskısı) göre peruk ve böbrek-yin'i tonlamak, yaşam özüne fayda sağlamak ve bağırsakları rahatlatmak için popülerdir. Şu andaCistanches Herbaesas olarak kuzeybatı Çin'deki kurak ve sıcak çöllerde, özellikle Sincan ve İç Moğolistan eyaletlerinde dağılmıştır. Bununla birlikte, iki kökeniCistanches Herbafarmakolojik aktiviteleri ve kimyasal bileşenleri bakımından farklılık gösterir. Tu ve ark. üç Cistanche türünün kaynaşmasını araştırdılar (C. deserticola,C. tubulosa,Cistanche salsa) ve şunu buldu:C. tubulosaYang eksikliği fare modelinde en düşük etkiyi göstermiştir [1]. Zhang ve ark. farmakolojik aktiviteyi karşılaştırdılar.C. deserticola,C. tubulosa,veC. salsa,ve bu türlerin yorgunluk önleyici ve hipoksi toleransı gibi tıbbi işlevlere sahip olduğunu, ancak aynı ölçüde olmadığını bulmuştur [2]. Önceki araştırmalar kimyasal bileşeni rapor etmiş ve kimyasal bileşenin ve içeriğin bitki kökenleri için farkını göstermiştir.Cistanches Herba[3]. Klinik uygulama ve piyasa dolaşımına gelince, tonik olarak,C. tubulosaJaponya'da geleneksel olarak kan dolaşımını teşvik eden bir ajan olarak ve iktidarsızlık, kısırlık, lumbago, vücut zayıflığı tedavisinde kullanılmıştır [4-8]. Sonuç olarak, iki kökeni ayırt etmek büyük önem taşımaktadır.Cistanches Herbakalite kontrol ve klinik uygulama için. Bununla birlikte, iki kökenin ayrımcılığına odaklanan bir araştırma yoktur.Cistanches Herba. Mikroskopi, ultraviyole ve kızılötesi algılama dahil olmak üzere birçok araştırılmış yöntem, basit diziler arası tekrarlar yöntemi, cinsini tanımlamak için kullanılmıştır.Mesafeler, ama sadece iki köken için değil, özellikle [9-20]. Burada, Cistanches Herba, UPLCQTOF / MS (kuadrupol uçuş süresi kütle spektrometrisi ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi) ve DNA barkodlamasının iki kökenini ayırt etmek için konjonktürel olarak kimyasal ve moleküler teknikleri kullandık. UPLC-QTOF/MS, diğer tekniklere kıyasla daha hızlı ve verimli bilgi sağlar. UPLC-QTOF/MS'nin yüksek seçiciliği ve duyarlılığı, hem kantitatif hem de nitel analizlerin yanı sıra metabolit analizi ve Geleneksel Çin Tıbbında karmaşık bileşiklerin tanımlanması için uygulanmasına neden olmuştur [21-22]. Ana bileşen analizi (PCA) ve gizli yapı diskriminant analizine (OPLSDA) ortogonal projeksiyon da potansiyel belirteç bileşiklerini tanımlamak için geliştirilmiştir. Daha kolay ve daha evrensel bir moleküler belirteç teknolojisi olan DNA barkodlaması, türleri veya cinsleri tanımlamak için bir DNA parçası kullanır. Geleneksel tanımlama yöntemlerinden ve diğer moleküler belirteç teknolojilerinden daha objektif, daha doğru ve gerçekleştirilmesi daha kolaydır. Ayrıca, DNA barkodlaması, tıbbi bitkiler de dahil olmak üzere hayvanları ve bitkileri tanımlamak için başarıyla uygulanmıştır [23-26]. Bu araştırmanın amacı, iki bitki kökeninin ayırt edilmesi için UPLC-QTOF / MS ve DNA barkodlamasını birleştiren bilimsel bir yöntem sistemi kurmaktır.Cistanches Herba.
Bütün kökleri uzaklaştırır
Gereç ve Yöntemler
Etik beyan Saha çalışmalarının nesli tükenmekte olan veya korunan türleri içermediğini onaylıyoruz. GPS koordinatları örnek bilgilere dahil edilmiştir, lütfen tablo 1'e bakınız."
Bitki materyalleri ve reaktifler
Cistanches Herba'nın etli sapları Mayıs 2012'de İç Moğolistan, Qinghai Eyaletleri, Sincan Uygur Özerk Bölgesi, Çin Halk Cumhuriyeti'ndeki vahşi çöl bölgelerinden toplanmıştır (Tablo 1). Araştırmanın örneklerinin tümü, belirli bir iznin gerekli olmadığı özel arazilerde değil, vahşi çöl bölgelerinde toplandı. Sapların botanik kimlikleri Dr. Linfang Huang tarafından doğrulandı. Kupon örnekleri Tıbbi Bitki Geliştirme Enstitüsü'ne yatırıldı. UPLC analizi için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) sınıfı asetonitril (Merck KGaA, Darmstadt, Almanya) ve formik asit (Tedia, ABD) kullanılmıştır. Deiyonize su, bir Milli-Q sistemi (Millipore, Bedford, MA, ABD) kullanılarak arıtıldı. Diğer tüm kimyasallar analitik sınıftaydı.
Numune hazırlama
Cistanches Herba örnekleri (1.0 g, 65-ağ) 50-mL konik şişeye aktarıldı ve 50 mL% 70 metanol eklendi. 30 dakika bekletildikten sonra, ultrasonikasyon (35 kHz) 30 dakika oda sıcaklığında gerçekleştirildi. 10 dakika boyunca 10.000 devir / dak'da santrifüjlemeden sonra, süpernatant 4uC'de depolandı ve analiz için UPLC-QTOF / MS sistemine enjeksiyondan önce 0.22 mm'lik bir membrandan süzüldü.
UPLC-QTOF/MS
UPLC analizi için aşağıdaki sistemler/parametreler kullanılmıştır: Waters Empower 2 veri istasyonuna bağlı ikili çözücü dağıtım pompası, otomatik örnekleyici ve PDA dedektörü ile donatılmış Waters Acquity sistemi (Waters); ultrasonikasyon (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonik Instrument Co, Zhejiang, Çin); ve AB135-2 elektronik analitik terazi modeli (MettlerToledo., Greifensee, Zürih, İsviçre). Bir Waters Acquity UPLC BEH C18 sütunu (1.7 mm, 2.16100 mm, Waters) ve bir Waters C18 koruma sütunu (aynı malzeme, sular) kullanıldı ve 30uC'de muhafaza edildi. Mobil faz, aşağıdaki gibi bir gradyan programı ile% 0.1 formik asit sulu çözeltisi (A) ve asetonitril (B) idi: 0-3 dakika,% 10-22 B; 3–4 dakika, %22–23 B; 4–6 dakika, %23–35 B; 6–8 dakika, %35–37 B; 8–11 dk, %37–42 B; 11-12 dakika, %42-48 B; 12–15 dakika, 0,3 mL/dak akış hızında %48–%50 B. Enjeksiyon hacmi 5 mL idi.
UPLC / MS analizi, negatif iyon modunda çalıştırılan bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) kaynağı ile donatılmış bir QTOF Synapt G2 HDMS sistemi (Waters, Manchester, İngiltere) üzerinde gerçekleştirildi. Çözünme gazı olarak N2 kullanıldı. Çözünme sıcaklığı 800 L / s akış hızında 450uC'ye ayarlandı ve kaynak sıcaklığı 120uC'ye ayarlandı. Kılcal ve koni voltajları sırasıyla 2500 ve 40 V'a ayarlandı. Veriler, 50-1200 Da arasında, 0.1-sn tarama süresi ve 15-sn analiz süresi boyunca 0.01-s interscan gecikmesi ile toplandı. Argon, 7.06661023 Pa basınçta çarpışma gazı olarak kullanıldı. Tüm MS verileri, kütle doğruluğu ve tekrarlanabilirliği sağlamak için LockSpray sistemi kullanılarak toplanmıştır. m/z 554.2615'teki lösin-enkefalinin [M-H]- iyonu, negatif ESI modunda kilit kütlesi olarak kullanıldı.
Veri analizi
Cistanches Herba örnekleri için UPLC-QTOF/MS verileri, potansiyel diskriminant değişkenleri tanımlamak için analiz edildi. ES ham verilerinin tepe bulgusu, hizalanması ve filtrelenmesi, Marker Lynx uygulama yöneticisi, sürüm 4.1 (Waters, Manchester, İngiltere) kullanılarak gerçekleştirildi. Kullanılan parametreler aşağıdaki gibidir: 0-15 dakika tutma süresi (tR), 50-1200 Da kütle, 0.02 dakika tutma süresi toleransı ve 0.02 Da'lık kütle toleransı. Her coğrafi konumdan toplanan üç replika örnek kullanıldı (n = 3). Modeli oluşturmak için toplam 6.339 değişken kullanılmıştır.
DNA barkodlaması: DNA ekstraksiyonu, PCR amplifikasyonu ve dizilimi
C. deserticola ve C. tubulosa'nın (30 mg) kurutulmuş etli saplarından alınan örnekler, 30 r / s frekansında 2 dakika boyunca ovuşturuldu. DNA, üreticinin talimatlarına (Tiangen) göre ekstrakte edildi. Spesifik olarak, protokol, kloroformun bir kloroform karışımı ile değiştirileceği şekilde değiştirildi: izoamil alkol (aynı hacimde 24: 1) ve izopropanol (aynı hacimde) ile tampon çözeltisi GP2. Ovuşturulmuş toz 1.5 ml eppendorf tüplerine kondu, 10-20 s vorteks kullanılarak karıştırılmak üzere 700 mL 65uC önceden ısıtılmış GP1 ve 1 mL b-merkaptoetanol ilave edildi ve 65uC'de 60 dakika boyunca inkübe edildi; 700 mL kloroform karışımı eklenmesi: izoamil alkol (24: 1), 12000 rpm'de (,134006g) 5 dakika santrifüj; Yeni bir tüpe pipet süpernatant, 700 mL izopropanol ekleyerek, 15-20 dakika karıştırarak; Tüm karışımın CB3 spin kolonuna borulanması ve 12000 rpm'de 40 s santrifüj yapılması; Filtrasyonun atılması ve 500 mL GD eklenmesi (kullanımdan önce kantitatif susuz etanol eklenmesi), 40 s için 12000 rpm'de santrifüj; membranı yıkamak için filtratın atılması ve 700 mL PW (kullanımdan önce kantitatif susuz etanol eklenmesi) eklenmesi, 12000 rpm'de 40 s santrifüj; Filtrasyonun atılması ve 500 mL PW eklenmesi, 12000 rpm'de 40 s santrifüj; Artık yıkama tamponu PW'yi çıkarmak için filtrat ve santrifüjün 12000 rpm'de 2 dakika boyunca atılması; Sıkma kolonunun CB3'ün temiz bir 1.5 ml'lik eppendorf tüpe aktarılması ve oda sıcaklığında 3-5 dakika kurutulması; Toplam DNA'yı elde etmek için 12000 rpm'de 2 dakika santrifüj yapın. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için primerler daha önce bildirilen dizilere dayanıyordu [4,5]. PCR reaksiyon karışımları, 25 mL'lik bir son hacimde, 2-mL DNA şablonu, 8.5- mL ddH2O, 12.5-mL 26Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Çin), 1/1-mL ileri/geri (F/R) primerleri (2.5 mM) içeriyordu. PCR amplifikasyonu Kress ve ark. [4] tarafından tanımlandığı şekilde gerçekleştirilmiştir. PCR reaksiyonunun primer değerleri fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59-39) ve rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (59-39) idi. PCR ürünleri ayrıldı ve %1 agaroz jel elektroforezi ile saptandı. PCR ürünleri, üreticinin protokolüne uygun olarak saflaştırıldı ve doğrudan dizilemeye tabi tutuldu.
Cistanche'ın ana etkili bileşiği: Acteoside
Sonuç -ları
UPLC-QTOF/MS ile geçici tepe ataması C. deserticola ve C. tubulosa'nın farklı üretim alanlarından temsili kromatogramları Şekil 1'de gösterilmiştir. Parmak izi kromatogramı, Cistanches Herba örnekleri arasında benzerlikler olduğunu gösterdi. Toplam 23 nitelikli kütle piki tespit edilmiş ve tutma süreleri ve kütle spektrumları daha önce bildirilenlerle eşleştirilerek 16 pik tespit edilmiştir (Tablo 2) [29-35]. Zirveler 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 ve 23 geçici olarak sırasıyla cistanoside F, mussaenoside acide, cistanbuloside C1/C2, campneoside II, campneoside II, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, syringalide A-39-a-L-rhamnopyranoside, cistanoside C, 29-acetylacteosid, osmanthuside B, cistanoside D, tubuloside B ve cistancinenside A olarak tanımlanmıştır. Kimyasal bileşenlerin öncelikle feniletanoid glikozitler (PhGs) olduğu belirlenirken, bir bileşik olan mussaenosid asit, bir iridoid polisakkarit idi. PhG'ler, böbrek eksikliğinin tedavisi ve antioksidan ve nöroprotektif etkiler açısından ana aktif bileşiklerdir [36]
C. deserticola ve C. tubulosa'nın PCA'sı
PCA, farklı bitki türlerinin örneklerini ayırt etmek için kullanıldı. PCA, ikincil metabolit bileşiminin çok değişkenli verilerindeki benzerlikleri ve / veya farklılıkları görselleştirmeyi amaçlayan, denetimsiz çok değişkenli bir veri analizi yöntemidir [37]. İki bileşenli PCA modeli kümülatif olarak varyasyonun %46,04'ünü oluşturuyordu (PC1, %36,43; PC2, %9,61). Şekil 2, tür kökenine göre çizilen PCA skorlarında 24 numunenin iki gruba ayrıldığını ve C. deserticola ve C. tubulosa'nın kimyasal bileşiminin önemli ölçüde farklı olduğunu göstermektedir.
Cistanche'ın ana etkili bileşiği: Echinacoside
