Bölüm 1: Cistanche Herba'nın Cistanosid'i Oksidatif Stresin Bastırılması Yoluyla Hipoksiye Bağlı Erkek Üreme Hasarını İyileştirir
Mar 26, 2022
İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Soyut:Artan kanıtlar, hipoksinin erkek kısırlığının bir nedeni olduğunu ve hipoksinin oksidatif stres (OS) ile ilişkili olabileceğini göstermektedir. Cistanoside (Cis), CistanchesHerba'dan ekstrakte edilebilen ve çeşitli biyolojik fonksiyonlara sahip bir feniletanoid glikozit bileşiğidir. Bu çalışma, Cis'in hipoksi tarafından indüklenen üreme hasarı üzerindeki koruyucu etkilerini araştırmayı ve altta yatan spesifik mekanizmaları keşfetmeyi amaçladı. Hücre ve hayvan hipoksisi deneysel modelleri oluşturulmuş ve farklı Cis alt tiplerinin erkek üreme sistemi üzerindeki koruyucu etkileri hem in vitro hem de in vivo olarak değerlendirilmiştir. Sonuçlar, hipoksinin, artan OS ile ilişkili olan hücre döngüsü durması ve apoptoz aktivasyonu yoluyla GC-1 hücrelerinin canlılığını önemli ölçüde azalttığını gösterdi. Ayrıca Cis, hem in vitro hem de in vivo olarak antioksidan enzim aktivitelerini önemli ölçüde geri yükleyen güçlü antioksidatif etkiler gösterdi. ve hücre canlılığını arttırırken ve apoptozu azaltırken reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerini aşağı düzenler. Önemli olarak, burada incelenen Cis alt tiplerinin (Cis-A, Cis-B, Cis-C ve Cis-H) tümü, aralarında Cis-B'nin etkilerinin en önemli olduğu belirli antioksidan etkiler göstermiştir. Bu çalışma, Cis'in testislerde ve GC-1hücrelerinde antioksidan enzim aktivitelerini etkileyerek hipoksi ile indüklenen OS'nin zararlı etkilerini belirgin şekilde azalttığını göstermektedir.
Anahtar Kelimeler: Cistanosid, hipobarik hipoksi, erkek kısırlığı, oksidatif stres, üremeyi koruma
taze sardunya bitkisi
giriiş
Şu anda, dünya çapında üreme çağındaki yaklaşık 48,5 milyon (yüzde 15) çift kısırlıktan [1] etkilenmektedir; bunların arasında, vakaların yüzde 40-50 kadarı, çevresel ve yaşam tarzıyla güçlü bir şekilde ilişkili bir durum olan erkek kısırlığına [2] atfedilmektedir. faktörler. Kanıtlar, memeli testisin düşük oksijen basıncına duyarlılığının, bazı erkek kısırlığının nedensel bir faktörü olduğunu göstermektedir [3]. Önceki çalışmalarda gösterildiği gibi, hipobarik hipoksiye [4-7] maruz kalındığında spermatogenez bozulur ve azalır.
Altta yatan mekanizmayı araştırmak için, çalışmalar hipobarik hipoksiye maruz kalmanın reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini arttırdığını göstermiştir [8, 9]. ROS, erkek üreme sisteminde önemli bir rol oynar. Düşük seviyelerde sperm kapasitasyonu, akrozom reaksiyonu ve spermatozoa-oosit füzyonu için gereklidirler[10]. Bununla birlikte, aşırı ROS, spermnükleer/mitokondriyal DNA hasarını ve plazma membranı peroksidatif hasarını indükleyebilir, bu da artan erkek kısırlığı riski için ana etiyolojik faktörlerdir [11, 12]. Bu nedenle, hipoksiye bağlı ROS birikimi erkek kısırlığının bir nedeni olabilir.
Çok yıllık bir parazit tıbbi bitki olan Cistanches Herba, kurak alanlarda yaygın olarak bulunur [13] ve farmakolojik aktiviteleri nedeniyle [14-17] yaygın olarak kullanılır. Cistanches Herba'nın tüm etkili içerikleri arasında PhG'ler ana aktif bileşen olarak kabul edilmiştir. Bugüne kadar, Cistanches bitkilerinden 34 PhG izole edilmiştir [13]. Cistanches Herba'dan izole edilen aktif bir PhG olan Cistanoside (Cis), antioksidan etkileri nedeniyle dikkat çekmiştir.
Cis'in antioksidan etkileri ve hipoksiye bağlı erkek kısırlığında ROS'un rolü göz önüne alındığında, Cis, hipoksiye bağlı erkek kısırlığının tedavisi için potansiyel bir ilaç adayı olarak kabul edilir. Bununla birlikte, hipoksi ile indüklenen erkek kısırlığının veya ilgili sinyal yollarının tedavisinde Cistanches Herba'dan ekstrakte edilen Cis'in antioksidan etkilerini ele alan az sayıda rapor bulunmaktadır. Bu çalışmada, in vitro ve in vivo hipoksi deneysel modelleri oluşturulmuş ve farklı Cislerin etki bileşenleri değerlendirilmiştir.
Cistanche'ın birüreme üretimi etkisi.
Malzemeler ve yöntemler
Hücre kültürü ve reaktif
Fare spermatogonia hücre dizisi GC-1spg(GC-1), American TypeCulture Collection'dan (ATCC) satın alındı ve yüzde 10 fetalbovin serumu, yüzde 1 L- ile desteklenmiş DMEM'de (Invitrogen, ABD) kültürlendi. glutamin (100 mM), penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 ug/mL) yüzde 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 derecede. Cis (Cis-A, B, C, H), Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd.'den (Çin) satın alındı.
Hücre canlılığı tahlili
Hücre canlılığı hücre sayma kiti{{0}}tahlili (CCK-8) ile test edildi. Kısaca, GC-1 hücreleri 96-kuyucuklara oyuk başına 1.5x103 olacak şekilde tohumlandı ve 24 saat 37 derecede kültürlendi. Daha sonra hücreler, farklı konsantrasyonlarda (yüzde 20, yüzde 15, yüzde 10, yüzde 5) oksijen veya farklı konsantrasyonlarda (2 uM, 0.2 uM, 0.02 uM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C) ile muamele edildi. , Cis-H) gerekli süre için. Daha sonra süpernatant atıldı ve hücre canlılıkları bir CCK-8 kiti (DojindoJapan) kullanılarak tespit edildi. Her kuyunun absorbansı, bir mikroplaka okuyucu (BioRad USA) kullanılarak 450 nm'de ölçülmüştür. Son olarak, hücre canlılıkları aşağıdaki formüle göre hesaplanmıştır:
Hücre canlılığı=(ODdeney grubu - ODblank grubu)/(ODkontrol grubu - ODblank grubu) × yüzde 100 .
Western blot analizi
Hasat edilen hücreler veya dokular, proteinleri çıkarmak için RIPA tamponunda homojenleştirildi (RIPA BeyotimeÇin; Kokteyl Roche İsviçre). Süpernatanlar toplandı ve proteinlerin konsantrasyonu BCA yöntemiyle (Beyotime) test edildi. Her numuneden yaklaşık 40 ug ekstrakte edilmiş protein, SDS-PAGE ile ayrıldı ve nitroselüloz (NC) filtre membranına (BeyotimeChina) elektrotransfer edildi. NC filtre zarları, 1.5 saat boyunca yüzde 5 yağsız süt ile bloke edildi ve spesifik antikorlarla (anti-PARP 1:1000, anti-Kaspaz-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax1: 1000, anti-GAPDH 1:1000; tüm antikorlar, gece boyunca 4 derecede Cell Signaling Technology, ABD'den satın alındı. Daha sonra, tüm NC membranları, ilgili yaban turpu peroksidaz konjuge ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1.5 saat boyunca inkübe edildi ve bir görüntüleme sistemi (Tannon, Çin) ile görüntülendi.
cistanche özü tozu takviyeleri
Hücre döngüsü algılama
Hücre döngüsünü analiz etmek için bir akış sitometrik tahlili (FCM) yapıldı. Hücreler, 72 saat boyunca farklı koşullar altında işleme tabi tutuldu ve hasat edildi. Hücreler daha sonra PBS ile yıkandı, yüzde 75 etanol içinde sabitlendi ve propidiumiodide (PI) ile boyandı. Her numune için 1 x 104 hücre toplandı ve akış sitometrisi (FACSCalibur, BD Biosciences) ile analiz edildi. Daha sonra, G1/S/G2 faz hücrelerinin oranı ve çoğalma indeksi [Faz(S artı G2)/Faz(G1 artı S artı G2) x yüzde 100] hesaplandı.
Ki-67 boyama
Hücreler konfokal bir tabakta kültürlendi ve 72 saat boyunca hipoksi veya farklı Cis alt tipleri ile işlendi. Tüm hücreler yüzde 4 paraformaldehit ile sabitlendikten sonra, anti-Ki-67 antikor (1:200, Cell Signaling Technology) ile inkübe edildi. Daha sonra, tüm hücreler karşılık gelen bir CY-3-konjuge anti-tavşan IgG antikoru (1:200, Boster, Çin) ve DAPI solüsyonu (1.0 ug/mL, Beyotime) ile inkübe edildi. Floresans, bir Fluoview FV1000 konfokal mikroskobu (Olympus, Japonya) ile gözlendi.
ROS tespiti
DCFH-DA kullanılarak hücre içi ROS seviyelerini ölçmek için FCM tanıtıldı. Askıya alınan hücreler 6-kuyulu plakalara ekildi ve farklı işlemlere tabi tutuldu. 72 saatlik tedaviden sonra hücreler, 10 uM DCFH-DA (Beyotime) ile serumsuz DMEM içinde süspanse edildi. ROS içerikleri daha sonra 488 nm uyarma dalga boyuna ve 525 nm emisyon dalga boyuna sahip bir Beckman Coulter Akış Sitometri Sistemi üzerinde floresanla aktive olan hücre sınıflandırmasıyla belirlendi [18].
Lipid Peroksidasyonunun (LPO) Tayini
LPO'yu saptamak için tiyobarbitürik asit reaktif maddeler (TBARS) tahlili yapıldı. Tüm çalıştırma adımları, talimatlara (Sigma ABD) uygun olarak gerçekleştirildi. Konsantrasyonlar, standart olarak malondialdehit kullanılarak elde edilen 1.56x105/(M·cm) molar sönme katsayısı kullanılarak hesaplandı. Sonuçlar, nmol MDA eşdeğeri/mg protein olarak ifade edilir.
Enzim aktivitelerinin belirlenmesi
Enzim aktiviteleri, glutatyon redüktaz (GR), glutatyon peroksidaz (GPx) ve süperoksit dismutaz (SOD) içeren tahlil kitleri kullanılarak test edildi. Tüm çalıştırma adımları, sağlanan talimatlara (Nan Jing Jian Cheng BioengineeringInstitute China) uygun olarak gerçekleştirildi.
Hayvanlar ve deney protokolü
Olgun erkek Wistar sıçanları (180-220 g, 8 w yaşlı) Xi'an, Çin'deki Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesinin hayvan merkezinden alındı. Hayvanların kullanım izni Üniversite Etik Kurulundan alındı (Referans numarası : 20190506). Hayvan deneyi, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için üniversite yönergelerine göre yapıldı.
Tüm sıçanların, deneyin başlamasından yaklaşık bir hafta önce adapte olmalarına izin verildi. Aklimasyondan sonra ratlar rastgele her grupta 5 hayvan olacak şekilde 6 gruba ayrıldı. Kontrol grubundaki sıçanlar normal basınç (PO2: yüzde 20; hava basıncı:101,3 kPa) altında büyütülürken, model ve Sistreated gruplarındaki sıçanlar düşük basınçlı bir oksijen odasında büyütüldü (iç basınç 61.6 kPa'ya eşdeğer, deniz seviyesinden 4000 metre yükseklikte; PO2: yüzde 14.55 ) yüksek irtifa hipoksik ortamı simüle etmek için. Tüm sıçanlar, otomatik 12-saat aydınlık/karanlık döngüsü ile 22±2 derece ve nem koşullarında plastik kafeslerde yiyecek ve suya serbest erişime sahipti. Model ve Cis uygulanan gruplardaki sıçanlar, hipobarik koşullar altında kaldılar, ancak her 96 saatte bir tonormobarik koşullara aktarıldılar, bu sırada onlara yiyecek ve su sağlandı ve kafesler temizlendi. Hipobarikten hipobarik geçiş süresi yaklaşık 2 saatti. Tüm tedavi grupları, 8 hafta boyunca oral gavaj yoluyla karşılık gelen Cis (8 mg/kg/gün) ile tedavi edildi, oysa kontrol ve model sıçanlar eşit hacimde su ile tedavi edildi.
8 hafta sonra sıçanlar anestezi altında sakrifiye edildi. Testisler, epididim ve seminal veziküller ayrıldı ve tartıldı ve organ indeksi aşağıdaki formüle göre hesaplandı: (organ ağırlığı/hayvan ağırlığı) × yüzde 100. Daha sonra epididimdeki spermler toplandı ve motiliteleri ve akrozomenzim aktiviteleri test edildi. Benzer şekilde histopatolojik çalışmalar ve ROS, LPO ve antioksidan enzim aktivite tespiti için testis dokuları toplandı.
Canlı sperm oranının değerlendirilmesi
Epididim cerrahi makasla kesildi ve sperm süspansiyonu normal salin içinde hazırlandı. Canlı sperm oranını değerlendirmek için, 5 μL sperm süspansiyonu eşit hacimde eozin-Ystain ile dikkatlice karıştırıldı. Daha sonra spermler ışık mikroskobu altında sayıldı. Hem boyalı (ölü sperm) hem de boyanmamış sperm (canlı sperm) hesaplanarak canlı sperm oranları değerlendirildi.
Cistanche tubulosa tozuartırırcanlı sperm oranları.
Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın.
Sperm akrozom enzim aktivitesinin belirlenmesi
Sperm akrozom enzim aktivitesi tahlili, sperm akrozomenzimlerini değerlendirmek için kullanıldı [19]. Her gruptaki sonuçlar aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı: Akrozom enzim aktivitesi (μIU)=(ODExperimentgroup - ODBlank grubu)/(247.5×10) × 106.
istatistiksel analiz
Tüm nicel veriler ortalama± SD olarak ifade edildi ve SPSS 22.0 yazılımı kullanılarak analiz edildi. Verileri iki grup arasında karşılaştırmak için Independent Student t testi kullanıldı. *P< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">
