Bölüm 1:Echinacoside, Hipotalamik Androjen Reseptörünü Hedefleyerek Sıçanlarda Sperm Miktarını Artırıyor
Mar 05, 2022
İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com
Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 ve Xiaoying Zhang1,2
Lütfen Bölüm 2 için buraya tıklayın
Erkek infertilitesi, dünya çapında erkek infertilitesinin yüzde 4,2'si olarak tahmin edilen prevalansı ile önemli bir sağlık sorunudur. İlk çalışmalarımız bunu gösterdiCistanche özlerifarelerde sperm hasarına karşı koruma veekinakozit(ECH) ana aktif bileşenlerden biridir. Burada, sıçanlarda oligoastenospermiyi tersine çeviren veya ona karşı koruyan doğal bir ürün olan ECH'nin önemli bir rolünü rapor ediyoruz. ECH, HPLC ile tahlil edildi, spermin miktarı ve kalitesi değerlendirildi ve hormon seviyeleri, radyo-immünosorbent tahlili ile belirlendi. ECH, Western blot ve qPCR analizi ile belirlendiği üzere androjen reseptörü (AR) ve steroidojenik ile ilgili anahtar genlerin seviyelerini azalttı. ECH ve AR arasındaki etkileşim, dolaylı ELISA ve moleküler yerleştirme ile değerlendirildi. Sonuçlar, ECH'nin Met-894 ve Val-713 cebinde hipotalamik AR ile birleştiğini ve AR'nin sitoplazmadan hipotalamustaki çekirdeklere transferini engellediğini göstermektedir. Seks hormonu regülasyonunun negatif geri beslemesi engellenirken, lüteinize edici hormon ve testosteronun salgılanmasını artırmak için pozitif geri bildirim uyarıldı ve ardından sperm miktarını arttırdı. Birlikte ele alındığında, bu veriler ECH'nin sperm miktarını artırmak ve sıçanlarda oligoastenospermiye karşı koruma sağlamak için hipotalamustaki AR aktivitesini bloke ettiğini göstermektedir.
Testis hücrelerinde testosteron üretimi, bir homeostatik geri besleme döngüsü oluşturarak hipotalamik-hipofiz-gonadal eksen (HPG) tarafından güçlü bir şekilde düzenlenir1. Hipotalamus tarafından salgılanan gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH), hipofiz bezinden luteinize edici hormonun (LH) salgılanmasını uyarabilir ve bu da testis Leydig hücrelerinde testosteron üretimini daha da uyarır. Testosteron, bir dizi steroidojenik enzim tarafından biyosentezlenir. Ana yollardan biri olarak, steroidojenik akut düzenleyici (StAR) protein, kolesterolü hücre içi kaynaklardan mitokondriye2 taşıyabilir ve burada kolesterol yan zincir parçalama enzimine (CYP11A1), 3 -hidroksisteroid dehidrojenaz (HSD3), 3 -, { Kolesterolün testosterona dönüşümünü katalize eden {10}}hidroksilaz (CYP17A1) ve 17 -hidroksisteroid dehidrojenaz (HSD 17).3,4. Testosteron daha sonra doza bağlı bir şekilde daha fazla LH salgısını aşağı regüle etmek için HPG elemanına negatif olarak geri beslenir.
Testosteronun HPG ekseni geri besleme döngüsü üzerindeki etkisi, hem hipotalamusta hem de hipofiz bezinde bulunan androjen reseptörüne (AR) bağlanarak gerçekleşir5. Farelerde, AR'nin ablasyonu ve minimal testosteron üretimi, LH ve folikül uyarıcı hormon (FSH) seviyelerinin artmasına neden olur6, bu da AR'nin negatif besleme döngüsünün düzenlenmesine katıldığını düşündürür. Testosteron sinyalinin klasik genomik mekanizması, testosteron hücreye difüze olduğunda ve AR'ye bağlandığında ortaya çıkar. Bu ligand-reseptör kompleksi daha sonra, translokasyonlarını değiştirmek için testosterona duyarlı genlerin düzenleyici bölgelerindeki androjen yanıt elemanlarına (ARE'ler) bağlandığı çekirdeğe yer değiştirir. Testosteron ayrıca, normal olarak büyüme faktörleri tarafından tetiklenen sitozolik sinyal kaskadlarının aktivasyonuna yol açan hızlı olaylarla karakterize edilen, steroid hormonu etkisinin klasik olmayan yolunu da indükler7,8. Klasik ve klasik olmayan testosteron yollarının her ikisi de spermatogenez ve doğurganlığın korunmasına katkıda bulunur. Bununla birlikte, testosteron sperm kalitesini artırmak için hareket ettiğinden, AR'nin işlevi klasik yolda daha önemlidir.
Ekinakozit(ECH), Ekinezya'nın9 tıbbi bitki türlerinden elde edilen biyoaktif bileşenlerden biridir vecistanche10. Geniş bir farmakolojik aktivite yelpazesine sahip Ekinezya özleri, 1 Modern Biyoteknoloji Araştırma Merkezi, Biyoteknoloji ve Gıda Mühendisliği Okulu, Anyang Teknoloji Enstitüsü, Anyang, Henan, 455000, Çin'dir. 2Veterinerlik Koleji, Northwest A & F Üniversitesi, Yangling, Shaanxi, 712100, Çin. 3Biyomedikal Bilimler Bölümü, Ontario Veteriner Koleji, Guelph Üniversitesi, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Kanada. Yazışmalar ve malzeme talepleri XZ'ye iletilmelidir.
Antioksidan özellikleri11 ve soğuk algınlığını 12 önleme yetenekleri nedeniyle Avrupa ve ABD'deki en popüler bitkisel takviyelerden biridir. İlginçtir,Cistanche özleri ve ECH geleneksel olarak geleneksel Çin tıbbında üreme fonksiyon bozukluğunu tedavi etmek ve erkek cinsel aktivitesini artırmak için bir tonik ajan olarak kullanılmıştır10. Bazı OTC ürünlericistanche ekstraksiyon, besleyici takviyeler olarak geliştirilmiştir ve Çin'in ve diğer bazı Asya ülkelerinin (Çin Gıda ve İlaç İdaresi) sağlıklı gıda pazarlarında popülerlik kazanmaktadır13. Bununla birlikte, ECH etkisinin altında yatan mekanizmalar belirsizliğini koruyor.
Erkek infertilitesi, dünya çapında erkek infertilitesinin yüzde 4,2'si olarak tahmin edilen prevalansı ile önemli bir sağlık sorunudur14. Erkek kısırlığının teşhisi şu anda sperm konsantrasyonu, hareketliliği ve morfolojisi gibi seminal parametrelerin analizini içeren sperm kalitesi çalışmasına dayanmaktadır15. Östrojen taklitçisi Bisfenol A (BPA), çeşitli hayvan ve insan türlerinde erkek doğurganlığı üzerindeki etkisi nedeniyle incelenen yaygın bir çevresel kirleticidir16. BPA, hipotalamik-hipofiz-gonadal ekseni bozar, erkek yavrularda testiküler steroidojenik enzimlerin ekspresyonunu ve testosteron sentezini inhibe eder17, hipogonadotropik hipogonadizm durumuna neden olur18. Bu çalışmada ECH'nin sperm kalitesi ve hormon düzeyleri üzerindeki etkilerini araştırdık. Ek olarak, ECH'nin zayıf sperm kalitesine karşı koruyucu etkisini daha fazla incelemek için bir sperm yaralanma model ajanı olarak BPA seçildi.
Cistanche özleri
Sonuçlar
ECH sperm miktarını arttırır. Kauda epididimindeki sperm sayıları, sperm canlılığı ve sperm hareketliliği Tablo 1'de sunulmuştur. 80 mg/kg ECH ve 15 mg/kg testosteron propiyonat (TP) ile tedavi epididimal sperm sayısını önemli ölçüde artırmıştır. Bununla birlikte, sperm canlılığı ve sperm motilitesinde anlamlı bir fark yoktu.
ECH, serum, ensefalon artı hipofiz ve testiste testosteron ve LH seviyelerini arttırır. ECH tedavisi serum, ensefalon artı hipofiz ve testisteki LH seviyelerini belirgin şekilde arttırdı (Şekil 1A). ECH(H) grubunda, LH seviyeleri serumda 1.1-kat, ensefalon artı hipofizde 1.4-kat ve testiste 1.2-kat arttı. Testosteron, ansefalon artı hipofiz ve testiste sırasıyla 1.5 ve 1.3-kat arttı, ancak ECH(H) tedavisinden sonra serumda olmadı. TP tedavisinden sonra, testosteron seviyeleri serumda, ensefalon artı hipofizde ve testiste 1.6, 1.8 ve 1.4-kat arttı.
ECH, steroidojenik enzim gen ekspresyonunu arttırdı. ECH, testiste anahtar steroidojenik enzimlerin ekspresyonunu önemli ölçüde arttırdı (Şekil 1B). ECH(H) grubundaki CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 ve HSD17'nin mRNA seviyeleri 3-kattan fazla artarken, StAR mRNA seviyeleri tüm ECH tedavilerinde anlamlı bir farklılık göstermedi (p > 0.05). TP, CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 ve HSD17'nin ifadesini önemli ölçüde değiştirmedi. Bu, ECH'nin steroidojenik enzim ekspresyonu üzerindeki etkisinin kapsamlı bir ısı haritası analizinde yansıtılır ve ECH'nin CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 ve HSD17 ve özellikle HSD3 1/ mRNA seviyelerini önemli ölçüde arttırdığını gösterir. 2 (Şekil 1C).
ECH, kan-beyin bariyerini ve daha az ölçüde kan-testis bariyerini geçebilir. HPG eksenindeki androjen geri besleme döngüsünü değerlendirmek için, ECH'nin hipotalamusa girme yeteneği bir dizi PK çalışmasında değerlendirildi. 30 mg/kg ECH'nin 12 saatlik tek oral uygulamasından sonra hipotalamusta ECH konsantrasyonları tespit edildi ve ECH, yüzde 33.92'lik ortalama hipotalamus/plazma oranı ile belirgin hipotalamus penetrasyonu gösterdi (Şekil 2A). T1/2 değerleri sırasıyla plazma ve hipotalamusta 2.61 ± 0.42 saat ve 1.88 ± 0.22 saat idi (Şekil 2B). Bununla birlikte, HPLC kullanılarak ECH'nin testise çok sınırlı erişimi tespit edildi. Testisteki ECH konsantrasyonları 0 idi.0Sonradan 0.5 saat, 1 saat ve 1.5 saat sonra sırasıyla 83 ug/mL, 0.043 ug/mL ve 0.028 ug/mL idi. tedavi.
ECH, hipotalamik AR translokasyonunu çekirdeğe azaltır. ECH'nin AR translokasyonu üzerindeki etkisini test etmek için, testis ve hipotalamusun sitoplazmasında ve çekirdeğinde AR ekspresyonu western blot analizi kullanılarak belirlendi. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, kontrol grubuna kıyasla hipotalamik çekirdeklerde ECH aşağı regüle AR proteini. Bir AR inhibitörü olan enzalutamid ile tedavi, hipotalamik çekirdeklerdeki AR protein seviyelerini 4.8-kat azalttı. Özellikle, sitoplazmik AR, ECH tedavisi ve enzalutamid tedavisi ile kontrollerden daha yüksekti; bu, ECH'nin, hipotalamusta sitoplazmadan çekirdeğe AR taşınmasını bloke ettiğini düşündürdü. Beklendiği gibi, ECH, testiste sitoplazmadan çekirdeğe AR taşınmasını engellemez (Şekil 3B).
ECH, HPG ekseni ile ilgili genlerin ekspresyonlarını arttırdı. ECH, ensefalon artı hipofiz karışım havuzlarında LH , LHR, GnRH 1 ve Gnrhr ekspresyonlarını anlamlı olarak arttırdı, ancak TP tedavisi sonrası GnRH 1 seviyelerinde anlamlı bir fark yoktu. Isı haritası analizi, GnRH 1 ve LH ekspresyonlarının HPG ekseni ile ilgili genler arasında en yüksek olduğunu göstermektedir.
Şekil 1. ECH'nin LH, testosteron ve majör steroidojenik enzim seviyeleri üzerindeki etkisi. Not: (A) serum, ensefalon artı hipofiz ve testisteki LH seviyeleri (mIU/mL, ortalama ± SD);
serum, ensefalon artı hipofiz ve testisteki T seviyeleri (ng/mL, ortalama ± SD); (B) ana steroidojenik enzimlerin ekspresyonu;
(C) testiste farklı steroidojenik enzimlerin mRNA ekspresyonunun hiyerarşik kümelenmesi. Yeşil, yeşil-kırmızı ve kırmızı renkler düşük,
sırasıyla orta ve yüksek bolluk, n=7. a,b,c Farklı harfler istatistiksel olarak farklı grupları belirtir (p <>
Şekil 2. Hipotalamusta ECH'nin dağılımı ve farmakokinetik parametreleri. Notlar: (A) hipotalamus/ plazma oranları ( yüzde ), 0.5 saat, 1.0 saat, 1.5 saat, 2.{'de ECH'nin (konsantrasyon) plazma ve hipotalamus maruziyetlerine dayalı olarak hesaplanmıştır. {8}} sa, 2.5 sa, 3.0 sa, 6.0 sa, 9.0 sa ve 12.0 sa oral uygulamadan sonra. (B) Plazma ve hipotalamusta ECH'nin farmakokinetik (PK) parametreleri. T1/2, yarı ömür; Cmax, tepe konsantrasyonu; Vz/F, görünen dağılım hacmi; MRT, ortalama tutma süresi; AUC, konsantrasyon-zaman eğrisinin altındaki alan.
AR, ECH'nin bir hedefidir. ECH ve AR arasındaki ilişkileri doğrulamak için ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) başarıyla sentezlendi (Şekil 5A,B). ECH-OVA'nın moleküler ağırlığı OVA'dan daha büyüktür, bu nedenle farklı hareketlilik oranlarına sahiptirler (Şekil 5A) ve ECH-OVA'nın absorbans zirvesi ECH ve OVA arasındadır (Şekil 5B),
Cistanche özleri
Figür 3. ECH'nin testis ve hipotalamusta AR taşınmasına etkisi. Notlar: (A) ECH'nin hipotalamusta AR taşınması üzerindeki etkisi. AR protein seviyeleri western blot analizi ile belirlendi ve çubuklar, Lamin B'ye normalize edilmiş nükleer AR'nin ve GAPDH'ye normalize edilmiş sitoplazmik AR'nin dansitometrik miktarını temsil ediyor. Her değer, altı bağımsız deneyin ortalama ± SD'sini temsil eder. a,b,c Çubukların üzerindeki farklı harfler istatistiksel olarak farklı grupları gösterir (p < 0.05);="">B) ECH'nin testiste AR taşınmasına etkisi.
ECH'nin OVA'ya başarıyla konjuge edildiğini düşündürür. Dolaylı ELISA sonuçları (Şekil 5C), anti-AR antikorunun, ECH-OVA (anti-OVA antikoru ile belirtilir) içeren kuyularda bulunan AR proteinini tespit edebildiğini gösterir, bu da ECH'nin AR proteinine bağlanabileceğini gösterir.
ECH, Met-894 ve Val-713'ın AR cebiyle birleşir. Bileşik ECH, insan AR'nin yüzeyindeki AF2 bölgesine kenetlendi ve ECH ve AR'nin teorik bağlanma modu, Şekil 5D'de gösterildi. Bileşik ECH, insan AR'nin cebinde bir kompakt konformasyon bağlanmasını benimsemiştir. ECH'nin iki fenil grubu, AR cebinin hidrofobik alanında bağlanır ve Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737 artıkları ile yakın hidrofobik temaslar sağlar. , Met-894 ve Ile-898 iken, ECH'nin diğer iki tarafı cebin girişine yerleştirildi ve sadece birkaç temas yaptı. Ayrıntılı analiz, hem Met-894 (bağ uzunluğu: 2.4 Å) hem de Val-713 (bağ uzunluğu: 2.7 Å), ECH arasındaki ana etkileşim olan ECH'nin hidroksi1 grupları ile hidrojen bağları oluşturduğunu gösterdi. ve insan AR.
ECH, BPA kaynaklı üreme hasarını hafifletir. ECH'nin üreme hasarı üzerindeki etkisini araştırmak için BPA ile indüklenen farelerde sperm kalitesi ve seks hormonları ve steroidojenik enzimler incelenmiştir. Şekil 6'da gösterildiği gibi, BPA tedavisi, sperm sayısını ve sperm hareketliliğini sırasıyla yüzde 26.5 ve yüzde 39.2 oranında önemli ölçüde azalttı. ECH uygulaması, sperm sayısındaki ve sperm motilitesindeki azalmayı sırasıyla yüzde 35,5 ve yüzde 30,1 oranında engelledi. BPA uygulaması ayrıca LH ve T sekresyonunda önemli bir düşüşe neden oldu ve ECH, tek başına BPA tedavisine kıyasla LH ve T seviyelerini sırasıyla yüzde 24,1 ve yüzde 18,3 oranında önemli ölçüde artırdı (Şekil 6A,B). BPA-ECH tedavisinde StAR, CYP17A1, 3 -HSD ve 17 -HSD'nin mRNA seviyeleri BPA tedavisine kıyasla önemli ölçüde arttı (Şekil 6C,D).
Şekil 4. ECH tedavisinden sonra HPA ile ilişkili gen ekspresyonundaki değişiklikler. Notlar: (A–D) çubukları, ensefalon artı hipofizde LH , LHr, Gnrh 1 ve Gnrhr'nin mRNA seviyelerini temsil eder. a,b,c Çubukların üzerindeki farklı harfler istatistiksel olarak farklı grupları gösterir (p < 0.05).="" (e)="" farklı="" steroidojenik="" enzimlerin="" mrna="" ekspresyonunun="" hiyerarşik="" kümelenmesi.="" yeşil,="" yeşil-kırmızı="" ve="" kırmızı="" renkler="" sırasıyla="" düşük,="" orta="" ve="" yüksek="" bolluğu="" temsil="" eder,="" n="7." kontrol="" (normal="" tuzlu="" su="" 10="" ml/kg="" ile="" tedavi="" edilir),="" ech(l)="" (ech="" 5="" mg/kg="" ile="" tedavi="" edilir),="" ech(m)="" grubu="" (ech="" 20="" mg/kg="" ile="" tedavi="" edilir),="" ech(h)="" (ech="" 80="" ile="" tedavi="" edilir="" mg/kg),="" tp="" (tp="" 15="" mg/kg="" ile="" tedavi="">
