BÖLÜM 1 Ekinakozit, Sıçan Serebrokortikal Sinir Terminallerinde Voltaja Bağlı Ca2 artı Girişi ve Protein Kinaz C'yi Bastırarak Glutamat Salınımını Önler
Mar 07, 2022
Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 ve Su Jane Wang 3,*
1 Anesteziyoloji Bölümü, Uzak Doğu Memorial Hastanesi, Pan-Chiao Bölgesi, New Taipei Şehri 22060, Tayvan; drluchengwei@gmail.com (CWL); drlin1971@gmail.com (TYL);nskh9450n@yahoo.com.tw (SKH)
2 Makine Mühendisliği Bölümü, Yuan Ze Üniversitesi, Taoyuan 32003, Tayvan
3 Tıp Fakültesi, Fu Jen Katolik Üniversitesi, No. 510, Zhongzheng Rd., Xinzhuang Dist., New Taipei 24205, Tayvan.
Soyut:Glutamaterjik sistem, nöroprotektan tedavilerin etkilerine dahil olabilir. Ekinakozit, şifalı Çin bitkisinden elde edilen bir feniletanoid glikozitHerba Cistanche,nöroprotektif etkileri vardır. Bu çalışma, ekinakozidin sıçan serebrokortikal sinir terminallerinde (sinaptozomlar) 4-aminopiridin ile uyarılmış glutamat salınımı üzerindeki etkilerini araştırdı. Ekinakozid inhibe Ca2 artıbağımlı, ancak Ca değil2 artı-bağımsız, 4-aminopiridinle uyarılmış glutamat salınımı, konsantrasyona bağlı bir şekilde. Ekinakozid ayrıca sitoplazmik serbest Ca2'deki 4-aminopiridin ile uyarılmış artışı da azalttı.2 artıkonsantrasyonu ancak sinaptozomal membran potansiyelini değiştirmedi. Ekinakozidin 4-aminopiridin ile uyarılmış glutamat salınımı üzerindeki inhibitör etkisi, geniş spektrumlu bir Cav2.2 (N-tipi) ve Cav2.1 (P/Q-tipi) kanal blokeri olan cu-konotoksin MVIIC tarafından önlendi. ancak hücre içi Ca'ya duyarsızdı.2 artısalınım inhibitörleri dantrolen ve 7-kloro-5-(2-klorofenil)-1,5-dihidro-4,1-benzodiazepin{{ 8}}(3H)-bir (CGP37157). Ayrıca, ekinakozid, protein kinaz C'nin 4-aminopiridin kaynaklı fosforilasyonunu azalttı ve protein kinaz C inhibitörleri, ekinakozidin glutamat salınımı üzerindeki etkisini ortadan kaldırdı. Bu sonuçlara göre, ekinakozidin uyarılmış glutamat salınımı üzerindeki inhibitör etkisinin, düşük voltaja bağlı Ca2 ile ilişkili olduğunu öneriyoruz.2 artıprotein kinaz C aktivitesinin girişi ve ardından baskılanması.
Anahtar Kelimeler:ekinakozit; glutamat salınımı; serebrokortikal sinir terminalleri; gerilime bağlı Ca2artı kanallar; Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ve orta serebral arter tıkanıklığının protein kinaz C'si[9-12]. Bununla birlikte, ekinakozidin nöroproteksiyona neden olduğu mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır.
Daha fazla bilgi için lütfen iletişime geçin:Joanna.jia@wecistanche.com
Ekinakozitcistanche'de birçok işlevi var
1. Giriş
Ekinakozitiçinde bulunan önemli bir feniletanoid glikozittir.Herba Cistanche, unutkanlık, iktidarsızlık ve kronik kabızlığı tedavi etmek için kullanılan iyi bilinen bir geleneksel Çin tıbbı [1].Ekinakozitantioksidasyon, anti-inflamasyon, antikanser, hepatoproteksiyon ve immün modülasyon gibi çeşitli biyoaktivitelere sahiptir [2-4]. Özellikle,ekinakozitnöroprotektif etkileri vardır; örneğin, birincil sıçan kortikal nöronlarında, insan nöroblastom SH-SY5Y hücrelerinde ve feokromositoma (PC12) hücrelerinde oksidatif stres veya nörotoksin kaynaklı nörotoksisiteye karşı koruma sağlayabilir [5-8]. Üstelik,ekinakozitParkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ve orta serebral arter tıkanıklığının hayvan modellerinde beyin hasarını hafifletir ve bilişsel işlevi geliştirir [9-12]. Bununla birlikte, hangi mekanizma aracılığıylaekinakozitnöroproteksiyona neden olduğu tam olarak anlaşılamamıştır.
Nöroproteksiyon, toksik saldırılar üzerine nöronal yapıyı ve işlevi korumanın karmaşık bir sürecidir. Glutamat eksitotoksisitesinin azaltılması, beyin nöroproteksiyonunda yer alan potansiyel bir mekanizma olarak kabul edilir. Uyarıcı bir amino asit nörotransmitteri olan glutamat, çeşitli beyin fonksiyonlarında çok önemli bir role sahiptir [13]. Bununla birlikte, yüksek glutamat konsantrasyonları altında glutamat reseptörlerinin aşırı aktivasyonu, hücre içi Ca2 artı aşırı yüklenmeye, mitokondriyal disfonksiyona, serbest radikal üretimine ve nöronal ölüme neden olur [14,15]. Bu patolojik süreç, serebral iskemi, travmatik beyin hasarı, epilepsi ve nörodejeneratif hastalık dahil olmak üzere çok sayıda beyin bozukluğunda rol oynar [16,17]. Bu nedenle, patofizyolojik glutamaterjik iletimi bloke eden inhibitörler, potansiyel nöroprotektif ilaçlar olarak kabul edilir. Bunların dikkate değer örnekleri, glutamat reseptör antagonistleri [18,19]; bununla birlikte, bu ilaçlara yönelik klinik deneyler, daha az etkililik ve istenmeyen, hatta sitotoksik yan etkiler nedeniyle başarısız olmuştur [20,21]. Doğrudan glutamat reseptör blokajına ek olarak, glutamat salınımının inhibisyonu, nöroproteksiyon için etkili bir strateji olabilir. Birkaç nöroprotektan (örneğin, memantin ve riluzol) sıçan beyin dokularında glutamat salınımını azaltabilir [22-24].
Glutamatın eksitotoksisitedeki rolü ve nöroprotektif profili göz önüne alındığındaekinakozit, bu çalışmada sıçan serebral korteksinden saflaştırılmış izole sinir terminalleri (sinaptozomlar) kullanıldı.ekinakozitglutamat salınımı ve daha fazla keşfedilen potansiyel mekanizmalar üzerine. İzole sinir terminali hazırlığı, herhangi bir postsinaptik etkinin yokluğunda ilaçlar tarafından nörotransmitter salınımının presinaptik düzenlemesini incelemek için iyi kurulmuş bir modeldir [25]. Bu modeli kullanarak, etkisini değerlendirdik.ekinakozitglutamat salınımı, membran potansiyeli, presinaptik Ca2 artı akışı ve protein kinaz C aktivitesi üzerine. Literatür incelememize göre, bu, mekanizmayı belgeleyen ilk rapordur.ekinakozitPresinaptik seviyede endojen glutamat salınımını inhibe eder.
Ekinakozit anti-oksidasyon yapabilir
2. Sonuçlar
2.1. EkinakozitVeziküler Ekzositozu Azaltarak Sıçan Serebrokortikal Sinir Terminallerinden 4-Aminopiridin-Uyarılmış Glutamat Salınımını Engeller
Şekil 1, konsantrasyona bağlı etkisini göstermektedir.ekinakozitsaflaştırılmış sıçan serebrokortikal sinaptozomlarından {{0}}aminopiridinle uyarılmış glutamat salınımı üzerine. 1 mM CaCl2 ile inkübe edilen sinaptozomlarda, 1 mM 4-aminopiridin, 1, 5, 10, 30 ve 50 uM azaltılan 7,4 0,1 nmol/mg/5 dk'lık bir glutamat salınımı uyandırdı.ekinakozit6.5 ˘ 0.2, 5.8 ˘ 0.3, 4.8 ˘ {{1{14}}}.2, 4.1 ˘ 0.1, veya 2.3 ˘ 0.4 nmol/mg/5 dak, sırasıyla (F(5,24)=67.1, p=0.000). için IC50 değeriekinakozitDoz-yanıt eğrisinden türetilen 4-aminopiridin ile uyarılmış glutamat salınımının aracılı inhibisyonu 24 uM idi. Ayrıca, 300 µM etilen glikol bis(-aminoetil eter)-N,N,N1,N{{ içeren hücre dışı Ca2 artı içermeyen bir solüsyonda 1 mM 4-aminopiridin tarafından uyarılan glutamat salınımı 13}}tetraasetik asit (EGTA) 2.1 ˘ 0.2 nmol/mg/5 dak (F(2,12)=310.65, p=0.000) idi ve bu Ca2 4-aminopiridinle uyarılmış glutamat salınımının artı bağımsız bileşeni 20 uM'den etkilenmediekinakozit(1.8 ˘ 0.2 nmol/mg/5 dak; p=0.58; Şekil 1). Bir veziküler taşıyıcı inhibitörü [26] 0.1 µM bafifilomisin A1 ile tedavi edilen sinaptozomlarda, 4-aminopiridinle uyarılmış glutamat salınımı önemli ölçüde azaldı (2.2 ˘ 0.2 nmol/mg/ 5 dk; F (2,12)=249.518, p=0.000). Bafifilomisin A1, 20 µM ekinakozit varlığında glutamat salınımını önemli ölçüde engelleyemedi (2.1 ˘ 0.2 nmol/mg/5 dak; p=0.94; Şekil 1). Buna karşılık, 10 µM DL-threo-beta-benzil-oksiaspartat (DL-TBOA, bir glutamat geri alım inhibitörü) [27], 4-aminopiridinle uyarılmış glutamat salınımını 11.8 0.4 nmol/mg/5 dakikaya yükseltti ( t(8)=´11.31, p=0.000). DL-TBOA varlığında bile, 20 µMekinakozit{{0}}aminopiridinle uyarılmış glutamat salınımını önemli ölçüde inhibe etti (7.7 ˘ 0.2 nmol/mg/5 dak; F(2,12)=87.23, p=0.{{ 12}}; Şekil 1)
2.2. EkinakozitSitosolik Ca'yı azaltır2artıKonsantrasyon Ama Sinaptozomu Değiştirmez
Mem zar Potansiyeli
1 mM 4-aminopiridinin neden olduğu sinaptozom depolarizasyonu Ca'yı artırdı2artı konsantrasyon(p= 0.000; Tablo 1). 20 |vM uygulamasıekinakozitbaral Ca'yı önemli ölçüde etkilemedi2artı konsantrasyon (t(8) = 0.06, p= 0.95) ancak 4-aminopiridinin neden olduğu artışı iia Ca'yı önemli ölçüde azalttı2artı konsantrasyon (t(10) = 6.16, p =0.000). Ek olarak, 3',3',3'-dipropiltiadikarbosiyanin iyodürde [DiSC] 1 mM 4-aminopiridin arttı3(5)] floresan (p= 0.000). ek o(20 fdM ekinakozit, dinlenme membran potansiyelini değiştirmedi (t(8)=0.976,p= 0.36) veya DiSC'deki 4-aminopiridin aracılı artışı önemli ölçüde değiştirin3(5) floresan (t(8) = —0.014, p= 0.99; Tablo 1).
cistancheekinakozitböbrek hastalığını tedavi edebilir
2.3. Azaltılmış- CO2 artıCav2.2 (N-Tipi) ve Cav2.1 (P/Q-Tipi) Kanallarından Akım, 4-Aminopiridin-Uyarılmış Glutamat Salınımının İnhibisyonu ile İlişkili OlabilirEkinakozit
Figür 2 2 cu-konotoksin MVIIC, bir N olduğunu gösterir-ve P / Q tipi Ca2artı kanal engelleyici,
{{0}}aminopiridinle uyarılmış glutamat salınımı 7,4 土 0,2'den 2'ye düşürüldü0 土 0,1 nmol/mg/5 dak (t(9) = 25.35, p{{0}}.000). Cu-konotoksin MVIIC varlığında, 20 pM ekinakozidin 4-aminopiridinle uyarılmış glutamat salınımı üzerindeki etkisi önemsizdi (1.8 土 0.2 nmol/mg/5 dak;t(8) = 1.06, p= 0.32). Dantrolen (10 ^M), hücre içi Ca inhibitörü2artı Crom'u endoplazmik retikulumu serbest bırakın [28], azaltılmış 4-aminopiridinle uyarılmış glutamat salınımı (5.6 土 0.3 nmol/mg/5 dak; F(2,14)=104). 95,p= 0.000). Ancak dantrolen varlığında 20 pJMekinakozitglutamat salınımını yine de önemli ölçüde inhibe edebilir (3.3 土 0.2 nmol/mg/5 dak;p= 0.000). 100 pM 7-kloro-5-(2-klorofeni)-1,5-dihidro-4,1-benzotiazepin kullanılarak benzer sonuçlar gözlendi -2(3H)-one (CGP37157), mitokondriyal Na'nın bir zar geçirgenliği engelleyicisiartı/CA2artı takas. İncelenen beş sinaptozomal preparatta, 20 pMekinakozit100 pM CGP37157 ile kombine edildiğinde 4-aminopiridinle uyarılmış glutamat salınımını yüzde 48,3 土 yüzde 5,2 (F(2,13) = 136.79,p= 7.000), tek başına ekinakozit tarafından inhibisyona benzer (yüzde 46,2 土 yüzde 2,3;p = 0.89;
2.4. Ekinakozit4-Aminopiridin-Uyarılmış (Protein Kinaz C Aracılığıyla Sinyal Vererek Glutamat Salımı) İnhibitörleri
Şekil 3'te gösterildiği gibi, 10 derece jlM 2-[1-(3-dimetilaminopropil)indol-3-il]-3-(indol-3-il) maleimid (GF109203X), genel bir protein kinaz C inhibitörü [29], azaltılmış 4-aminopiridinle uyarılmış glutamat salınımı (F(2,13) = 19.46, p=0 .000). GF109203X ile tedavi edilen sinaptozomlarda, 20 pM ekinakozit, 4-aminopiridin ile uyarılmış glutamat salınımını yalnızca yüzde 5,5 土 yüzde 1,8 (p=0,89), tek başına ekinakozitten daha az (yüzde 42,4 土 2,3) azalttı. yüzde ; p=f.000). 5,6,7,13-tetrahidro-13-metil-5-okso-12H-indolo[2,3-a]pirolo[3 ile de benzer sonuçlar elde edildi. ,4-c]karbazol-12-propannitril (Go6976), Ca2 artı bağımlı protein kinaz C izoformları için seçicidir (a, |3I, |3II, y) [29]. 3 pM Go6976 varlığında, 20 pMekinakozitglutamat salınımını yüzde 11,9 土 yüzde 2,9 azalttı (p=0,59), bu da tek başına ekinakozit ile karşılaştırıldığında önemli bir azalmaya işaret ediyor (yüzde 42,4 土 yüzde 2,3 ; p=0.000; Figür 3). Buna karşılık, bir Ca2 artı-bağımsız protein kinaz C6 inhibitörü olan 3 pM rottlerin [30], 4-aminopiridin (1 mM)-uyarılmış glutamat salınımını önemli ölçüde değiştirmedi (p=0.45). Bununla birlikte, rottlerin varlığında, 20 pM ekinakozit etkin bir şekilde ortalama yüzde 37,1 土 salımın yüzde 5,6'sı kadar bir inhibisyona neden oldu (F(2,13) = 19.72, p=0.{{33). }}), tek başına echinacoside ile buna benzer (p=0.41; Şekil 3). Ayrıca, mitojenle aktive olan protein kinaz inhibitörü 2-(2-amino-3-metoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-one) (PD98059 ) (50 pM) ve protein kinaz A inhibitörü N-[2-(p-bromosinnamilamino)etil]-5-izokinolinsülfonamid (H89) (100 pM), 4-aminopiridin uyarılmış glutamat salınımını azalttı (p=0.000). PD98059 veya H89 varlığında bile, 20 pMekinakozitsalınımı etkili bir şekilde azalttı (F(2,13) = 52.3, p=0.000; Şekil 3).
Şekil 4, tha11 mM 4-aminopiridinin, sinaptozomlarda protein kinaz C'nin fosforilasyonunu arttırdığını gösterir (t(4) = —6.871, p= 0.002). Sinaptozomlar, 4-aminopiridin eklenmeden önce 10 dakika boyunca 20 pM ekinakozid ile ön işleme tabi tutulduğunda, 4-aminopiridin kaynaklı protein kinaz C fosforilasyonu önemli ölçüde azaldı (F(2).a6) = 29.202, p = 0.00 1).
Ekinakozitiçindecistancheartırabilirbağışıklık sistemi
2.5. Ekinakozit-Glutamat Salınımının Aracılı İnhibisyonu Gama-Aminobütirik Asit Tip A (GAB) İçermez3AA) alıcı
Şekil 5'te, SR95531'in (GABA'nın bir antagonisti) yokluğunda veya varlığında ekinakozidin 4-aminopiridinle uyarılmış glutamat salınımı üzerindeki etkisiAreseptörü) karşılaştırıldı. Ek olarak, 100 pM SR95531, 4-aminopiridin (1 mM)-uyarılmış glutamat salınımını önemli ölçüde değiştirmedi. İçinde
SR95531- ile tedavi edilen sinaptozomlar, 20 pM ekinakozit uygulaması, 4-aminopiridin ile uyarılmış glutamat salınımı (F(2,12)=42 üzerinde yüzde 43'lük bir inhibisyonla sonuçlandı.p= 0.000), tek başına ekinakozit tarafından üretilen inhibisyondan önemli ölçüde farklı olmayan (yüzde 40;p= 0.000). Benzer bir sonuç, başka bir GABAa reseptör antagonisti olan bicuculline (50 pM) ile elde edildi. Bicuculline varlığında ölçülen salıverme ve
