BİRİNCİ BÖLÜM Ekikokazit, Hipotalamik Androjen Reseptörünü Hedefleyerek Sıçanlarda Sperm Miktarını Artırır

Ekikosid östrojeni nasıl uyarır ve sperm sayısını nasıl arttırır?

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 ve Xiaoying Zhang1,2

Erkek infertilitesi, dünya çapında erkek infertilitesinin tahmini %4.2'si prevalansı ile önemli bir sağlık sorunudur. İlk çalışmalarımız, Cistanche ekstraktlarının farelerde sperm hasarına karşı koruma sağladığını veekikosid(ECH) başlıca aktif bileşenlerden biridir. Burada aşağıdakiler için önemli bir rol bildiriyoruz:ECH, sıçanlarda aspermi olarak oligoya karşı ters çeviren veya koruyan doğal bir üründür.ECHHPLC ile test edildi, sperm miktarı ve kalitesi değerlendirildi ve hormon düzeyleri radyoimmu sorbent testi ile belirlendi. EKH azaltılmış androjen reseptörü (AR) ve anahtar seviyeleriWestern blot ve qPCR analizi ile belirlenen steroidojenik ilişkili genler. Aralarındaki etkileşimECHAR ise dolaylı ELISA ve moleküler kenetlenme ile değerlendirildi. Sonuçlar, ECH'nin Met-894 ve Val-713'ün cebinde hipotalamik AR ile kombine edilmesinin, AR'nin transferini engellediğini göstermektedir.hipotalamusta çekirdeklere sitoplazma. Cinsiyet hormonu regülasyonunun negatif geri bildirimi inhibe edilirken, luteinize edici hormon ve testosteronun salgılanmasını arttırmak için pozitif geribildirim uyarıldı ve daha sonra sperm miktarını arttırdı. Birlikte ele alındığında, bu veriler şunu göstermektedir:oECHsperm miktarını artırmak ve sıçanlarda oligo aspermiye karşı korunmak için hipotalamusta AR aktivitesini bloke eder.

Daha fazla bilgi için lütfen iletişime geçin:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola'nın birçok etkisi vardır, daha fazla bilgi için buraya tıklayın

Testis hücrelerinde testosteron üretimi, homeostatik bir geri besleme döngüsü oluşturarak hipotalamik-hipofiz-gonadal eksen (HPG) tarafından güçlü bir şekilde düzenlenir1. Hipotalamus tarafından salgılanan gonadotropin salgılayan hormon (GnRH), hipofiz bezinden luteinize edici hormonun (LH) salgılanmasını uyarabilir ve bu da testis Leydig hücrelerinde testosteron üretimini daha da uyarır. Testosteron, bir dizi steroidojenik enzim tarafından biyosentezlenir. Ana yollardan biri olarak, steroidojenik akut düzenleyici (StAR) protein, kolesterolü hücre içi kaynaklardan mitokondriye2 taşıyabilir ve burada kolesterolün testosterona dönüşümünü katalize eden kolesterol yan zincir bölünme enzimine (CYP11A1), 3β-hidroksisteroid dehidrogenaz (HSD3β), 17α-hidroksilaz (CYP17A1) ve 17βhidroksisteroid dehidrogenaza (HSD 17β) maruz kalır. Testosteron daha sonra negatif olarak, doza bağımlı bir şekilde daha fazla LH sekresyonunu aşağı regüle etmek için HPG elemanına geri beslenir.

Testosteronun HPG ekseni geri besleme döngüsü üzerindeki etkisi, hem hipotalamusta hem de hipofiz bezinde bulunan androjen reseptörüne (AR) bağlanarak oluşur5. Farelerde, AR ve minimal testosteron üretiminin ablasyonu, LH ve folikül uyarıcı hormon (FSH) seviyelerinin artmasına neden olur6, bu da AR'nin negatif besleme döngüsünün düzenlenmesine katıldığını düşündürür. Testosteron sinyallemesinin klasik genomik mekanizması, testosteron hücreye yayıldığında ve AR'ye bağlandığında ortaya çıkar. Bu ligand-reseptör kompleksi daha sonra translokasyonlarını değiştirmek için testosterona duyarlı genlerin düzenleyici bölgelerindeki androjen yanıt elementlerine (ARE'ler) bağlandığı çekirdeğe yer değiştirir. Testosteron ayrıca, normalde büyüme faktörleri tarafından tetiklenen sitozolik sinyal kaskadlarının aktivasyonuna yol açan hızlı olaylarla karakterize edilen steroid hormon etkisinin klasik olmayan yolunu da indükler7,8. Klasik ve klasik olmayan testosteron yolaklarının her ikisi de spermatogenez ve doğurganlığın korunmasına katkıda bulunur. Bununla birlikte, AR'nin işlevi, testosteronun sperm kalitesini arttırmaya etki ettiği klasik yolda daha önemlidir.

Ekikosid(ECH), Ekinezya9 ve Cistanche10'un tıbbi bitki türlerinden türetilen biyoaktif bileşenlerden biridir. Geniş bir farmakolojik aktivite spektrumuna sahip olan Ekinezya özleri, esas olarak antioksidan özellikleri11 ve soğuk algınlığını önleme yetenekleri nedeniyle12 Avrupa ve ABD'deki en popüler bitkisel takviyelerden biridir. IlginçtirCistanche (Sistanşe)özler veECHgeleneksel Çin tıbbında üreme fonksiyon bozukluğunu tedavi etmek ve erkek cinsel aktivitesini artırmak için geleneksel olarak tonik bir ajan olarak kullanılmıştır10. Cistanche ekstraksiyonunun bazı OTC ürünleri besleyici takviyeler olarak geliştirilmiştir ve Çin'in ve diğer bazı Asya ülkelerinin (Çin Gıda ve İlaç İdaresi) sağlık gıda pazarlarında popülerlik kazanmaktadır13. Bununla birlikte, altta yatan mekanizmalarECHeylem belirsizliğini koruyor. Erkek infertilitesi, dünya çapında erkek infertilitesinin tahmini %4,2'si prevalansı ile önemli bir sağlık sorunudur14. Erkek infertilitesinin tanısı şu anda sperm konsantrasyonu, motilitesi ve morfolojisi gibi seminal parametrelerin analizi de dahil olmak üzere sperm kalitesinin incelenmesine dayanmaktadır15. Östrojen taklidi Bisfenol A (BPA), çeşitli hayvan ve insan türlerinde erkek doğurganlığı üzerindeki etkisi nedeniyle incelenen yaygın bir çevresel kirleticidir16. BPA, hipotalamik-hipofiz-gonadal ekseni bozar, testiküler steroidojenik enzimlerin ekspresyonunu ve erkek yavrularda testosteron sentezini inhibe eder17, hipogonadotropik hipogonadizm durumuna neden olur18. Bu çalışmadaECHsperm kalitesi ve hormon seviyelerinde. Ek olarak, BPA, koruyucu etkisini daha fazla incelemek için bir sperm yaralanması model ajanı olarak seçildi.ECHdüşük sperm kalitesine karşı.

Sonuçlar ECH sperm miktarını arttırır. Kauda epididimindeki sperm sayıları, sperm canlılığı ve sperm motilitesi Tablo 1'de sunulmuştur. 80mg / kg EKH ve 15mg / kg testosteron propiyonat (TP) ile tedavi, epididim sperm sayısını önemli ölçüde arttırmıştır. Bununla birlikte, sperm canlılığı ve sperm motilitesinde anlamlı bir fark yoktu.

EKH, serum, ensefalon + hipofiz ve testislerde testosteron ve LH seviyelerini arttırır. EKH tedavisi özellikle serum, ensefalon+hipofiz ve testisteki LH düzeylerini önemli ölçüde arttırmıştır (Şekil 1A). ECH(H) grubunda, LH düzeyleri serumda 1.1 kat, ensefalon + hipofizde 1.4 kat ve testislerde 1.2 kat artmıştır. Testosteron, ensefalon + hipofiz ve testislerde sırasıyla 1.5 ve 1.3 kat artmış, ancak ECH (H) tedavisinden sonra serumda anlamlı olarak artmamıştır. TP tedavisinden sonra, testosteron seviyeleri serum, ensefalon + hipofiz ve testislerde 1.6, 1.8 ve 1.4 kat artmıştır.

EKH steroidojenik enzim gen ekspresyonunu arttırdı. EKH, testisteki anahtar steroidojenik enzimlerin ekspresyonunu anlamlı derecede arttırmıştır (Şekil 1B). ECH(H) grubundaki CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2 ve HSD17β'nin mRNA düzeyleri 3 kattan fazla artarken, StAR mRNA düzeyleri tüm EKH tedavileri ile anlamlı bir fark göstermedi (p>0.05). TP, CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2 ve HSD17β ekspresyonunu önemli ölçüde değiştirmedi. Bu, ECH'nin steroidojenik enzim ekspresyonu üzerindeki etkisinin kapsamlı bir ısı haritası analizinde, EGH'nin CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2 ve HSD17β ve özellikle HSD3β1/2'nin mRNA seviyelerini önemli ölçüde artırdığını göstermektedir (Şekil 1C).

EKH kan-beyin bariyerini ve daha az ölçüde kan-testis bariyerini geçebilir. HPG eksenindeki androjen geri besleme döngüsünü değerlendirmek için, ECH'nin hipotalamusa girme yeteneği bir dizi PK çalışmasında değerlendirildi. EKH konsantrasyonları hipotalamusta 12 saatlik tek oral 30mg/kg EKH uygulamasından sonra saptandı ve EKH ortalama hipotalamus/plazma oranı %33.92 ile belirgin hipotalamus penetransı gösterdi (Şekil 2A). Te T1/2 değerleri plazmada ve hipotalamusta sırasıyla 2.61±0.42 saat ve 1.88±0.22 saat idi (Şekil 2B). Bununla birlikte, HPLC kullanılarak ECH'nin testislere çok sınırlı erişimi tespit edildi. Testiste EKH konsantrasyonları tedaviden sonra sırasıyla 0.5h, 1h ve 1.5h'de 0.083 μg / mL, 0.043 μg / mL ve 0.028 μg / mL idi.

EKH, çekirdeğe hipotalamik AR translokasyonunu azaltır. EKH'nin AR translokasyonu üzerindeki etkisini test etmek için, testis ve hipotalamusun sitoplazmasında ve çekirdeğinde AR ekspresyonu batı leke analizi kullanılarak belirlendi. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, EKH hipotalamik çekirdeklerde AR proteinini kontrol grubuna kıyasla beş kat aşağı regüle etti. Bir AR inhibitörü olan enzalutamid ile tedavi, hipotalamik çekirdeklerdeki AR protein seviyelerini 4.8 kat azalttı. Özellikle, sitoplazmik AR, EKH tedavisi ve enzalutamid tedavisi ile kontrollerden daha yüksekti, bu da EKH'nin AR'nin sitoplazmadan hipotalamustaki çekirdeğe taşınmasını engellediğini düşündürmektedir. Beklendiği gibi, EKH sitoplazmadan testisteki çekirdeğe AR taşınımını inhibe etmez (Şekil 3B).

EKH, HPG ekseni ile ilişkili genlerin ekspresyonlarını arttırdı. EKH, ensefalon+hipofiz karışım havuzlarında LHβ, LHR, GnRH 1 ve Gnrhr ekspresyonlarını anlamlı derecede arttırmış, ancak TP tedavisinden sonra GnRH 1 düzeylerinde anlamlı bir fark bulunmamıştır. Isı haritası analizi, GnRH ifadelerinin 1 ve LH β, HPG ekseni ile ilişkili genler arasında en yüksekti.

AR, ECH'nin bir hedefidir. ECH ve AR arasındaki ilişkileri doğrulamak için, ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) başarıyla sentezlendi (Şekil 5A, B). ECH-OVA'nın moleküler ağırlığı OVA'dan daha büyüktür, bu nedenle farklı hareketlilik oranlarına sahiptirler (Şekil 5A) ve ECH-OVA'nın absorbans zirvesi ECH ve OVA arasındadır (Şekil 5B),

EKH'nin OVA'ya başarılı bir şekilde konjuge edildiğini düşündürmektedir. Dolaylı ELISA sonuçları (Şekil 5C), anti-AR antikorunun, EKH'nin AR proteinine bağlanabileceğini düşündüren ECH-OVA içeren kuyucuklarda (anti-OVA antikoru ile belirtilen) mevcut AR proteinini tespit edebildiğini göstermektedir. ECH, Met-894 ve Val-713'ün AR cebi ile birleşiyor. Bileşik EKH, insan AR'sinin yüzeyindeki AF2 bölgesine yerleştirildi ve ECH ve AR'nin teorik bağlanma modu Şekil'de gösterildi. 5D. İki fenil EKH grubu, AR cebinin hidrofobik alanına bağlandı ve Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737, Met-894 ve Ile-898 kalıntıları ile yakın hidrofobik temasları sürdürdü, oysa ECH'nin diğer iki tarafı cebin girişine yerleştirildi ve sadece birkaç temas yaptı. Ayrıntılı analiz, hem Met-894'ün (bağ uzunluğu: 2.4Å) hem de Val-713'ün (bağ uzunluğu: 2.7Å), ECH ve insan AR arasındaki ana etkileşim olan ECH'nin hidroksi1 gruplarıyla hidrojen bağları oluşturduğunu göstermiştir. EKH'nin üreme hasarı üzerindeki etkisini araştırmak için, BPA'ya bağlı farelerde sperm kalitesi ve cinsiyet hormonları ve steroidojenik enzimlerin seviyeleri incelenmiştir. Şekil 6'da gösterildiği gibi, BPA tedavisi sperm sayısını ve sperm motilitesini sırasıyla% 26.5 ve% 39.2 oranında önemli ölçüde azaltmıştır. EKH uygulaması, sperm sayısında ve sperm motilitesinde sırasıyla% 35.5 ve% 30.1 oranında azalmayı önledi. BPA uygulaması ayrıca LH ve T sekresyonunda önemli bir azalmaya neden oldu ve EKH, LH ve T düzeylerini tek başına BPA tedavisine kıyasla sırasıyla% 24.1 ve% 18.3 oranında önemli ölçüde artırdı (Şekil 6A, B). BPA-ECH tedavisinde StAR, CYP17A1, 3β-HSD ve 17β-HSD'nin mRNA düzeyleri BPA tedavisine göre anlamlı olarak artmıştır (Şekil 6C, D).