Bölüm 1: Hem Çağrışımsal Bellek Oluşturabilen Hem de Davranışsal İfadesini Ani Bir Şekilde Sonlandırabilen Dopaminerjik Nöronların Tanımlanması

İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Michael Schleyer,1* Alice Weiglein,1 Juliane Thoener,1 Martin Strauch,2 Volker Hartenstein,3

Melisa Kantar Weigelt,1 Sarah Schuller,1 Timo Saumweber,1 Katharina Eichler,4,5,6 Astrid Rohwedder,4,7 Dorit Merhof,2 Marta Zlatic,5,7 Andreas S. Thum,4,8 ve Bertram Gerber1,9 ,10*

1Leibniz Nörobiyoloji Enstitüsü, Öğrenme Genetiği veHafıza, 39118 Magdeburg, Almanya, 2Institute of Imaging & Computer Vision, RWTH Aachen Üniversitesi, 52056 Aachen, Almanya, 3Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, California 90095-1606, 4University of Konstanz, Enstitü for Biology, 78464 Konstanz, Almanya, 5HHMI Janelia Research Campus, Ashburn, Virginia 20147, 6Institute of Neurobiology, University of Puerto Rico Medical Science Campus, Old San Juan, Puerto Rico 00901, 7Department of Zoology, University of Cambridge, Cambridge, CB{ {12}}EJ, Birleşik Krallık, 8University Leipzig, Institute for Biology, 04103 Leipzig, Almanya, 9Centre for Behavioral Brain Sciences, 39108 Magdeburg, Almanya ve 10Institute for Biology, Otto von Guericke University Magdeburg, 39106 Magdeburg, Almanya

Hayati kaynakları aramak için çevreyi keşfetmekten, arama başarılı olduktan sonra bu kaynaklardan yararlanmaya geçiş, tüm hayvanlar için önemlidir. Burada, her iki cinsiyetten larva Drosophila melanogasterinin bu keşif-sömürü geçişini müzakere etmesine izin veren nöronal devreyi inceliyoruz. Bunu, Pavlovian koşullandırmayı yüksek çözünürlüklü davranışsal izleme, bireysel olarak tanımlanmış nöronların optogenetik manipülasyonu ve sinaptik organizasyonun EM veri tabanlı analizleriyle birleştirerek yapıyoruz. Dopaminerjik nöron DAN-i1'in optogenetik aktivasyonunun hemhafızaeğitim sırasında ve sonraki bir hatırlama testinde öğrenilen arama davranışını kesin olarak sonlandırın. Bununla birlikte, aktivasyonu doğuştan gelen davranışı etkilenmeden bırakır. Spesifik olarak, DAN-i1 aktivasyonu, koku ile eşleştirilmiş ve eşleştirilmemiş eğitimden sonra zıt değerlikli çağrışımsal hafızalar oluşturabilir ve hatırlama testi sırasında aktivasyonu, bu hafızalardan herhangi birinden kaynaklanan arama davranışını sonlandırabilir. Sonuçlarımız ayrıca davranışsal önemi açısından DAN-i1 aktivasyonunun şeker ödülüne benzediğini, ancak eşit olmadığını göstermektedir. DAN-i1 ile iki ana hedefi olan Kenyon hücreleri ve mantar gövdesi çıktı nöronu MBON-i1 arasındaki tüm sinaptik bağlantıların dendrogram analizleri, ayrıca DAN-i1 sinyallerinin eğitim sırasında ve geri çağırma testi sırasında iletilebileceğini düşündürmektedir. Kenyon hücreleri ve sırasıyla MBON-i1'e, önceden tanınmayan, yerel olarak sınırlı dallanma yapıları içinde. Bu, başarılı bir şekilde tamamlanması üzerine aramayı sonlandırmak için zarif bir devre motifi sağlayacaktır.

Anahtar sözcükler: dopamin; keşif-sömürü; mantar gövdesi; optogenetik; güçlendirme; arama

cistanchehafızayı geliştirebilir

Önem Beyanı

Hayatta kalma mücadelesinde hayvanlar yiyecek bulmak için çevrelerini keşfetmek zorundadır. Bununla birlikte, yiyecek bir kez bulunduğunda, artık taktığınız gözlüğü aramak kadar anlamsız olacak bir aramaya devam etmek yerine onu kullanmaya öncelik vermek uyarlanabilir. Bu keşif-sömürü dengesi, teknik arama cihazları için olduğu kadar hayvanlar ve insanlar için de önemlidir. Bir meyve sineği larvasının sadece 10,000 nöronundan hangisinin bu dengeyi bozabileceğini araştırıyoruz ve bunu yapabilen DAN-i1 adlı tek bir dopamin nöronunu tespit ediyoruz. Hayvan krallarında dopamin nöron işlevindeki benzerlikler göz önüne alındığında-

dom, bu, arama başarılı olduğunda nasıl sonlandırıldığına dair genel bir ilkeyi yansıtabilir.

giriiş

Çevresini keşfeden bir hayvan, yiyecek arayışına rehberlik etmek için geçmiş deneyimlerini kullanabilir. Bununla birlikte, yiyecek bulunduğunda, aramayı sona erdirmek ve bunun yerine yiyecek kaynağından yararlanmak uyarlanabilir. Burada, larva Drosophila melanogaster'ın bu keşif-sömürü geçişini müzakere etmesine izin veren devreleri inceliyoruz. Larva beyninin sayısal basitliği, hücreye özgü transgen ekspresyonu ve sinaptik bağlanabilirliği bilgisi ile birleştirilmiştir (Pfeiffer ve diğerleri, 2010; Li ve diğerleri, 2014; Eichler ve diğerleri, 2017; Saumweber ve diğerleri, 2018; Eschbach ve diğerleri, 2020), bunun bireysel olarak tanımlanmış nöronlar düzeyinde araştırılmasına izin verir.

D. melanogaster larvaları kokuları kolayca bir yiyecek ödülü ile ilişkilendirir (Scherer ve diğerleri, 2003; Gerber ve Hendel, 2006; Schipanski ve diğerleri, 2008; Rohwedder ve diğerleri, 2012; Apostolopoulou ve diğerleri, 2014; Kudow ve diğerleri. , 2017, 2019). Kritik olarak, bu koku-gıda ilişkilerine dayanan öğrenilmiş davranış, bir hatırlama testi sırasında ödül mevcutsa sona erer (Şekil 1A). Bu nedenle öğrenilmiş davranış, aranan sonuç (yani ödül) tarafından uyarlanabilir bir şekilde sonlandırılan bir arama olarak görülebilir (Schleyer ve diğerleri, 2011, 2013, 2015a). Doğuştan gelen koku alma davranışı aynı şekilde etkilenmez (Şekil 1B), bu tür doğuştan gelen davranışların refleks benzeri bir şekilde organize edildiğini düşündürür (Schleyer ve diğerleri, 2011, 2013, 2015a,b). Böylece, doğal ödüller iki etkiye neden olabilir: eğitim sırasında, daha sonra ödül aramaya rehberlik eden ipuçlarıyla ilişkilendirilebilecek bir ödül sinyali sağlarlar; ve geri çağırma testi sırasında, bu öğrenilmiş aramayı keskin bir şekilde sonlandırarak hayvanların bir kaynak bulunduğunda ondan uzaklaşmasını önleyebilirler. Dolayısıyla bu geçiş, motivasyondaki bir değişikliği (yani ödüle olan ilginin kaybolmasını değil) değil, ödül elde etme stratejisindeki bir değişikliği yansıtır.

Omurgasızlar ve omurgasızlar benzer şekilde, dopaminerjik nöronlar (DAN'lar), ilişkisel öğrenme için güçlendirici sinyaller sağlar (Waddell, 2013; Schultz, 2015; Kaun ve Rothenfluh, 2017). D. melanogaster'da, farklı DAN setleri sırasıyla iştah açıcı ve caydırıcı takviye taşır (larva: Schroll ve diğerleri, 2006; Rohwedder ve diğerleri, 2016; Saumweber ve diğerleri, 2018; Eschbach ve diğerleri, 2020; yetişkin sinekler: Schwaerzel ve diğerleri, 2003; Claridge-Chang ve diğerleri, 2009; Liu ve diğerleri., 2012) (benzer bir senaryo ortaya çıkan omurgasızlar da olabilir: Lammel ve diğerleri, 2012; Groessl ve diğerleri, 2018; Menegas ve diğerleri al., 2018). Bölmeli bir yapı oluşturan bu DAN'lar, mantar gövdesi olarak adlandırılan böceklerin en yüksek dereceli koku alma merkezinin içsel nöronları olan Kenyon hücrelerinin (KC'ler) paralel lifleriyle kesişir. Aynı bölümsel yapıya saygı duyan mantar gövdeli çıktı nöronları (MBON'lar), KC'ler boyunca bilgi toplar ve onu efferent devrelere gönderir (bkz. Şekil 2A–D) (larva: Selcho ve diğerleri, 2009; Pauls ve diğerleri, 2010). ; Eichler ve diğerleri, 2017; Saumweber ve diğerleri, 2018; Eschbach ve diğerleri, 2020; yetişkinler: Sejourne ve diğerleri, 2011; Places ve diğerleri, 2013; Aso ve diğerleri, 2014a,b; Oswald ve Waddell , 2015; Takemura ve diğerleri, 2017). Özellikle, yakın zamanda yapılan bir elektron mikroskobu rekonstrüksiyonu, DAN'ların iki ana hedefi olduğunu ortaya çıkardı: KC'ler ve MBON'lar (bakınız Şekil 2B)(larva: Eichler ve diğerleri, 2017; yetişkinler: Takemura ve diğerleri, 2017).

Larval D. melanogaster'da, pPAM kümesinden DAN'ların aktivasyonu, eğitim sırasında ödüllendirici bir etki gösterebilir (Rohwedder ve diğerleri, 2016). Bu kümenin dört gününden itibaren ikisi bireysel olarak böyle bir ödüllendirici etki verebilir (DAN-h1 ve DAN-i1) (Saumweber ve diğerleri, 2018). Burada odaklanmayı seçtik

Şekil 1. Şeker, ödül ve arama sonlandırma sinyalleri verebilir. Bir Larva, bir kokunun şekerle eşleştirilmiş veya eşlenmemiş olarak sunulduğu şekilde eğitilmiştir. Daha sonraki bir geri çağırma testinde, şekerin varlığında veya yokluğunda (üste doğru çizim) koku tercihleri ​​açısından test edildiler. Şeker yokluğunda yapılan test, ilişkisel kokuyu ortaya çıkardıhafıza, pozitif bir PI olarak ölçülür. Bunun davranışsal ifadesihafızaşeker varlığında sonlandırıldı. Böylece şeker iki tür sinyal verebilir: eğitim sırasında, hayvanlara daha sonra ödül aramalarında rehberlik etmek için koku ile ilişkilendirilebilecek bir ödül sinyali sağlar; ve hatırlama testi sırasında, aranan ödül olarak şeker, bu öğrenilmiş aramayı sona erdirmek için bir sinyal sağlar. Örnek boyutları: N=29, N =28. B, Larvalar, şekerin yokluğunda veya mevcudiyetinde (yukarı doğru çizim) doğal koku tercihi için test edildi. Şeker, doğuştan gelen koku alma davranışını etkilemedi ve refleks benzeri organizasyonunu önerdi. Örnek boyutları: Her biri N=20. Kutu çizimlerinin üzerindeki farklı harfler ikili anlamlılığı gösterir (Mann–Whitney U testi, p, 0.05, Bonferroni-Holm'a göre düzeltilmiştir). *Sıfırdan anlamlılık (tek örnek işaret testi, p, 0.05, Bonferroni-Holm'a göre düzeltilmiştir). ns, önemli değil. Tüm istatistiksel testler ve sonuçları, Genişletilmiş Veri Şekil 1-1'de kaynak verilerle birlikte rapor edilir. Bu deneyin PI puanlarının altında yatan koku tercih değerleri için Şekil 9A'ya bakın.

Şekil 2. DAN-KC-MBON matrisinin devresi. Medial lob kiazması. Koku bilgisi, doğuştan gelen bir yaklaşımın yanı sıra mantar gövdesi KC'lerinin kaliks bölgesine doğru (mor; tam olarak görüntülenen, sağ tarafta bir örnek KC'dir) doğru işlemek için işlenir. Tat ödül bilgileri aynı şekilde doğuştan gelen davranışları yönlendirmek için işlenir ve ayrıca çoğunlukla aminerjik modülatör nöronlar (görüntülenen DAN-i1, turkuaz/siyah) aracılığıyla mantar vücut loblarının ayrı bölümlerine (sol tarafta, bölmeler belirtilmiştir) doğru işlenir. Medial lobun (hk) dört bölmesinin her biri, kontralateral hemisferdeki aynı bölmeyi innerve eden tek bir DAN'dan girdi alır. Medial lobun MBON'ları, tipik olarak her iki hemisfere ait (gösterilen MBON-i1, macenta/sarı) tekli bölmelerden çekilir ve çıktılarını bölmeler arasında farklılık gösteren konfigürasyonlarda, yarımküresel bölünme boyunca iletir. Toplu olarak, MBON'lar şunlardan sorumludur:hafızatabanlı arama davranışı. Veriler Eichler ve ark. (2017) ve Saumweber ve ark. (2018). B, i bölmesindeki DAN-KC-MBON matrisi. DAN-i1 ve çoğu KC karşılıklı kimyasal sinapslar kurar ve hem DAN-i1 hem de KC'ler MBON-i1'e çıktı sağlar. Basit olması için, yalnızca sol DAN-i1 ve MBON-i1 nöronlarıyla sinapslar ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Aynı bağlantı, diğer bölümlerin hepsinde olmasa da çoğunda bulunur (Eichler ve diğerleri, 2017; Saumweber ve diğerleri, 2018). C, DAN-i1 (turkuaz) mantar gövdesinin dışından (koyu gri) hücre gövdesinin aynı tarafında (1 ile etiketlenmiş bölge) girdi alır ve ardından her iki yarım küredeki (2 ve 3 etiketli) i bölmesini innerve eder. MBON-i1 (macenta) orta çizgiyi iki kez geçer; her iki yarımkürenin i-bölmesinden girdi alır ve her iki yarımkürenin mantar gövdesine bitişik bölgelerde çıktı sağlar. D,C ile aynı, ancak hafifçe eğik bir görünümde, sol DAN-i1 ve MBON-i1 nöronlarının iskelet rekonstrüksiyonlarını ve bir örnek KC'yi (siyah) gösteriyor. Veriler Eichler ve ark. (2017). E, sol DAN-i1 nöronunun dendrogramı. Renkli noktalar, DAN-i1'den çıkış sinapslarını temsil eder. Üçgenler, DAN-i1'e giriş sinapslarını temsil eder. Renkler, ilgili sinapsın ortak nöronunu temsil eder. Mantar gövdesindeki diğer tüm sinapslar "Diğer" olarak etiketlenir. DAN-i1'in mantar gövdesinin dışında, özellikle 1. bölgede nöronlarla oluşturduğu sinapslar gösterilmez (Eschbach ve diğerleri, 2020). Noktalı çizgiler, nöronun beynin orta hattını geçtiği bölgeleri gösterir. F, E ile aynı, ancak sol MBON-i1 nöronu için. MBON-i1'in mantar gövdesinin dışındaki nöronlarla oluşturduğu sinapslar gösterilmez. Her iki yarıkürenin DAN-i1 ve MBON-i1 nöronlarının yüksek çözünürlüklü versiyonları ve tüm olgun KC'ler için sırasıyla Genişletilmiş Veri Şekilleri 2-1, 2-2 ve 2-3'e bakın. .

DAN-i1 üzerinde, çünkü daha önce daha ayrıntılı olarak analiz edilmiştir (Saumweber ve diğerleri, 2018) ve DAN-h1'den daha güçlü bir ödüllendirme etkisi sağladığı için (Saumweber ve diğerleri, 2018; yayınlanmamış veriler). İlk olarak, DAN-i1 ve hem ana çıktı ortakları olan MBON-i1 hem de KC'ler arasındaki tüm sinapsların uzamsal düzenlemesinin ayrıntılı bir hesabını sunuyoruz. Ardından, DAN-i1'in optogenetik aktivasyonunun sadece eğitim sırasında bir ödül sinyaline aracılık edip etmediğini değil, aynı zamanda hatırlama testi sırasında ödül aramayı öğrenmeyi akut olarak sonlandıran bir sinyale aracılık edip etmeyeceğini soruyoruz.

vücut geliştirme

Malzemeler ve yöntemler

Deneysel model ve konu detayları. Her iki cinsiyetten üçüncü evre beslenme evresi larvaları (D. melanogaster), yumurtlamadan 5 gün sonra yaşlandılar. Sinekler standart ortam üzerinde, 25 derecelik kütle kültüründe, yüzde 60 -70 bağıl nemde ve 12/12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde tutuldu. Bir gıda flakonundan bir kaşık besiyeri aldık, istenilen sayıda larvayı rastgele seçtik, çeşme suyunda kısaca duruladık ve deneye başladık.

DAN'larda ChR2-XXL ışık kapılı iyon kanalını ifade etmek için transgenik larvaları kullandık. Bu amaçla, efektör suşu UAS-ChR2-XXL (Dawydow ve diğerleri, 2014) (lütfen R. Kittel, University Leipzig tarafından sağlanmıştır) iki sürücü suşundan birine çaprazlanmıştır: ya 58E{{6 }}Gal4 (Pfeiffer ve diğerleri, 2008; Liu ve diğerleri, 2012; Rohwedder ve diğerleri, 2016) (Bloomington Stock Center no. 41347) veya split-Gal4 sürücü suşu SS00864 (Eichler ve diğerleri, 2017; Saumweber et al., 2018) çift heterozigot yavru elde etmek için. Bir sürücü, sürücü suşlarının w1118'in yerel bir kopyasına geçildiğini kontrol eder (Bloomington Stock Center #3605, #5905, #6326). Efektör, Gal4 (attP2) veya split-Gal4 (attP40/attP2) için kullanılan iniş alanlarını taşıyan, ancak henüz bir Gal4 alanı eklenmemiş ("boş") (Pfeiffer ve diğerleri, 2010) taşıyan bir suşu kontrol ettiği için çaprazlanmıştır. UAS- ChR2-XXL. 58E02 ve SS00864'ün ifade modelini, onları pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP'ye (Pfeiffer ve diğerleri, 2010) (Bloomington Stock Center #32185) çaprazlayarak onayladık. ChR2-XXL, gün ışığı ile etkinleştirilecek kadar hassas olduğundan (gösterilmemiştir), siyah karton ambalajla sürekli koyulaştırılan şişelerde sinekler büyütüldü. Şekil 8E'de sunulan deney için, UAS-ChR2 (Schroll ve diğerleri, 2006) 58E02-Gal4'e çaprazlanmıştır.

Deneysel kurulum. Davranış deneyleri için larvalar, 9 cm iç çaplı Petri kaplarında eğitilmiş ve şekil efsanelerinde belirtildiği gibi 9 veya 15 cm iç çaplı (her ikisi de Sarstedt'ten) Petri kaplarında test edilmiştir, her durumda yüzde 1 agaroz (elektroforez derecesi) ile doldurulmuştur. ; Roth). Koku gibi, parafin yağında (AM; CAS: 628-63-7; Merck) 1:20 oranında seyreltilmiş n-amil asetat ve bazı durumlarda ek olarak seyreltilmemiş 1-oktanol (OCT; CAS: {{) kullandık. 9}}; Merck).

Deneyler, 24 12 LED dizisi (470nm; Solarox) ve 6-mm kalınlığında buzlu Pleksiglas difüzyon plakası içeren özel yapım bir ışık masasıyla donatılmış 43 43 73cm'lik bir çevreleyen kutunun içinde yapıldı. ChR2-XXL aktivasyonu (120mW/cm2) için tek tip mavi ışık sağlamak için üstte. Petri kapları doğrudan difüzyon plakasının üstüne yerleştirildi. Petri kapları bir polietilen difüzyon halkası ile çevrelenmiştir; difüzyon halkasının arkasına 30 kızılötesi LED (850nm; Solarox), larvalar tarafından görülmeyen aydınlatma sağlamak için monte edildi, ancak çevrimdışı analiz için davranışlarının kaydedilmesine ve izlenmesine izin verdi. Bu amaçla, kızılötesi geçiş filtresi ile donatılmış bir kamera (Basler acA204090umNIR; Basler) Petri kabının üzerine yerleştirildi. Deneysel kurulumla ilgili ek ayrıntılar için bkz. Saumweber ve ark. (2018).

vücut geliştirme

İlişkisel koku-şeker öğrenme. Öğrenme deneyleri, yerleşik protokolleri izledi (Michels ve diğerleri, 2017). Koku kapları, özel yapım Teflon kaplara (her biri 0,5 mm çapında 7 delikli bir kapakla 5 mm iç çap) 10 ml koku maddesi eklenerek hazırlanmıştır. Petri kapları, havalandırmayı iyileştirmek için her biri 1 mm çapında 15 delik ile merkezde delinmiş modifiye kapaklarla kapatılmıştır.

Koku-şeker eğitimi için, ödül olarak (1) 2mol/L D-fruktoz (CAS: 57-48-7; Roth) içeren agaroz ile doldurulmuş bir Petri kabının ortasına 20 adet larva yerleştirildi ve iki koku ile donatıldı. karşı taraflarda, her ikisi de AM (AM1) ile doldurulmuş kaplar. 2.5 dakika sonra larvalar, iki boş kap (EM) ile donatılmış, sade, tatsız agaroz içeren taze bir Petri kabına yerleştirildi, burada da 2.5 dakika geçirdiler. Bu tür üç "eşleştirilmiş" eğitim döngüsü, her durumda taze Petri kapları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Vakaların yarısında eğitim, belirtildiği gibi (AM1/EM) ödül içeren Petri kaplarıyla başlarken, vakaların diğer yarısında sıralama tersine çevrildi (EM/AM1). AM1/EM (veya EM/AM1) eğitilmiş her larva kohortu için, ikinci bir kohort karşılıklı olarak, yani koku ve ödülün "eşleştirilmemiş" sunumlarıyla (sırasıyla AM/EM1 veya EM1/AM) eğitilmiştir.

Eğitimin ardından larvalar bir test Petri kabının ortasına aktarıldı ve koku tercihleri ​​açısından test edildi. Önemli olarak, geri çağırma testi, değerlendirmek için düz bir Petri kabında yapıldı.hafıza- temelli arama davranışı veya ödül içeren bir Petri kabında, ödülün varlığınınhafızatabanlı arama. Her iki durumda da, test Petri kabının bir tarafı bir AM kabı ve diğer tarafı bir EM kabı ile donatıldı. Test başladıktan 3 dakika sonra kamera görüntüsünden her iki taraftaki larva sayısı belirlendi. Bu sayılardan bir koku tercihi şu şekilde hesaplanmıştır:

Böylece, PI değerleri 1'den 1'e kadar değişebilir ve pozitif değerler, larvaların eşleştirilmiş eğitimden sonra kokuyu daha çok tercih ettiğini gösterir. Pozitif PI değerleri buna göre iştah açıcı bir çağrışım gösterir.hafızaen iyi şu şekilde yorumlanırhafızatabanlı arama davranışı. Negatif PI değerleri, aksine, caydırıcı çağrışımları gösterir.hafıza.

Optogenetik DAN aktivasyonu ile ilişkisel öğrenme. Optogenetik deneyler için eğitim ve test benzer şekilde yapıldı. Ancak, tüm Petri kapları sade agaroz ile doldurulmuştur (yani hiçbir ödüllendirici tatlandırıcı kullanılmamıştır). Bunun yerine, eşleştirilmiş eğitim için, 58E02-DAN veya 864- DAN'ı 2,5 dakika, ardından kokusuz 2,5 dakika karanlıkta (AM1/EM) etkinleştirmek için AM sürekli mavi ışık uyarımı ile eşleştirildi. Eşlenmemiş eğitim için koku sunumu ve ışık uyarımı ayrı ayrı gerçekleşti (AM/EM1). Şekil 8E'de sunulan deney için, koku ve ışık her biri 5 dakika süreyle sunuldu; bu deney, aksi takdirde Rohwedder ve diğerleri tarafından açıklanan prosedürleri izledi. (2016).

Bu tür üç eğitim döngüsünden sonra hatırlama testi yapıldı ve tarif edildiği gibi koku tercihi ve PI hesaplandı. Kritik olarak, geri çağırma testi ya DAN'ların eğitim sırasında bir ödül sinyaline aracılık edip etmediğini belirlemek için mavi ışık aktivasyonu olmadan ya da ek olarak DAN'ların aramayı sonlandırmak için bir sinyale aracılık edip edemeyeceğini belirlemek için mavi ışık aktivasyonu ile gerçekleştirilmiştir.

Bu protokolün varyasyonları şekil açıklamalarında belirtilmiştir.

Doğuştan koku alma davranışı. Koku kapları ve Petri kapları yukarıda tarif edildiği gibi hazırlandı. Şişeden 20 larvalık kohortlar toplandı, kısaca musluk suyunda yıkandı ve bir tarafında AM kabı, diğer tarafında boş bir kap bulunan bir Petri kabına yerleştirildi. 3 dakika sonra, doğal koku tercihi Denklem 1'e göre belirlendi. Bu tercih testi, bu test koşullarının değişip değişmediğini belirlemek için şekerin yokluğunda veya varlığında veya mavi ışık aktivasyonunun yokluğunda veya varlığında gerçekleştirildi. doğuştan gelen koku alma davranışı.

864-DAN aktivasyonu ile eğitimden sonra davranışsal modülasyonların analizi. Larva davranışı video ile izlendi ve Paisios ve diğerleri tarafından detaylı olarak tarif edildiği gibi analiz edildi. (2017). Kısaca, larva kemotaksinin iki yönü analiz edildi. İlk olarak, baş hadım (HC/saniye) modülasyonu (HC/s) aşağıdaki gibi hesaplandı:

Bu ölçüde, yön açısı (HA), hayvanın başının kokuya göre yönünü tanımlar, örneğin, kokunun kötü olduğunu belirten 0 derece veya 180 derecelik mutlak yön açıları (abs (HA)) ile. sırasıyla larvaların önünde veya arkasındadır. Dolayısıyla bu ölçüm, çekim için pozitif puanlar verirken (yani, HC, larvaları koku hedefinden uzağa yönlendirmek yerine yönlendirdiğinde), isteksizlik için negatif puanlar verir.

İmmünohistokimya. Larva beyinleri Ca{0}serbest salin solüsyonunda parçalandı ve 7 dakika boyunca Ca21-serbest salin solüsyonuyla 1:2 seyreltilmiş Bouin solüsyonunda sabitlendi. PBST (PBS içinde yüzde 0.3 Triton-X 100) içinde üç yıkama aşamasını (her biri 10 dakika) takiben, gece boyunca 4 derecede primer antikorlar ile inkübasyon yapıldı. PBS içinde üç yıkamadan (her biri 10 dakika) sonra doku, oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikorlarla inkübe edildi. PBS'de (her 10 dakika) üç son yıkama adımından sonra, örnekler Vectashield'e (Vector Laboratories) yerleştirildi. Preparatlar, bir DM 6000 CS konfokal mikroskobu (Leica Microsystems) altında incelendi.

vücut geliştirme

Antikorlar olarak, ya monoklonal anti-FASII fare antikoru (DSHB, yüzde 4 normal keçi serumu içeren blokaj solüsyonunda 1:50 seyreltilmiş) ve anti-GFP tavşan antikoru (A11122, Invitrogen, 1:1{ seyreltilmiş) kullandık. {28}}00, birincil antikorlar ve Cy3 anti-fare antikoru (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories) ve Alexa-488 anti-tavşan olarak yüzde 4 normal keçi serumu içeren blokaj solüsyonunda ikincil antikorlar olarak her ikisi de PBS içinde 1:200 oranında seyreltilmiş antikor (A11034, Invitrogen); veya birincil antikor olarak yüzde 0,3 PBST'de 1:100 oranında seyreltilmiş monoklonal anti-ChR2 fare antikoru (ProGen Biotechnik), yüzde 0,3 PBST'de 1:300 oranında seyreltilmiş Cy3 anti-fare antikoru (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories) kullandık. , ikincil antikor olarak ve Alexa-488 anti-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories), karşı boyama için yüzde 0,3 PBST'de 1:300 oranında seyreltildi.