Bölüm 2 Cistanches Herba (Rou Cong Rong) Tıbbi Ürünlerinin Türe Özgü Nükleotid İmzaları Kullanarak Tespiti

Bu çalışmada geliştirilen nükleotid imzalarını araştırarak, içerdiği olarak etiketlenen 31 Çin patentli ilacın 15'ininCistanches Herbabunun yerine, sekiz sahte içerik ve yedi zina dahil olmak üzere zina içeriyordu (Tablo 2). Örneğin, altı parti Cy ile değiştirildi. Songaricum, üç grup Shihu Yeguang hapı, bir grup Kangguzhi Zengsheng hapı, bir grup Sanbao kapsülü ve bir grup Wenweishu parçacığı dahil.

Ayrıca, aynı üreticiden farklı partiler biraz farklı sonuçlar üretti. Örneğin, bir üreticinin (ZCY16, ZCY69 ve ZCY71) üç serisi arasından bir seri, Ci'nin bir karışımını içeriyordu.çöl çiçeğive Cy. songaricum, bir parti bir karışımdan oluşuyorduCi. çöl çiçeğiveCi. tübülozave yalnızca bir parti içerirCi. tübüloza. Başka bir üreticiden (ZCY44 ve ZCY70) iki seri de farklıydı: bir seri Cy içeriyordu. songaricum, diğer parti şunları içeriyordu:Ci. çöl çiçeğiveCi. tübüloza.

Cistanches HerbaTest edilen 31 Çin patent ilacından 23'ünde tespit edildi (Tablo 2) ve yalnızca 16 numune orijinaldi, örneğin, katkı maddeleri veya sahte bileşenler olmadan.Ci. tübüloza16 Çin patentli ilaç grubunda tespit edildi ve Ci. Deserticola 10 partide tespit edildi. O. coerulescens hiçbir üründe tespit edilmedi (Tablo 2).

Cistanche Deserticola'nın birçok etkisi vardır, daha fazlasını öğrenmek için buraya tıklayın

TARTIŞMA

Piyasada Bulunan Tıbbi Ürünlerin İzlenmesi İçin Yeni Bir Yöntem Geliştirme GerekliliğiCistanchesbitki

Cistanches Herbaonarıcı Çin patentli ilaçlarda ve diğer tıbbi ürünlerde yaygın olarak kullanılan bir toniktir. Bununla birlikte, Çin patentli ilaçların kalite kontrolü, bileşenlerin çeşitliliği ve karmaşıklığı nedeniyle büyük bir zorluk teşkil etmektedir. Düzenleyici gözetim eksikliği nedeniyle, üründe tağşiş veya sahtecilik için önemli bir fırsat vardır. Ayrıca tüm ürünler Farmakope veya diğer standartlara uygun olarak işlenmelidir; işleme sırasında tağşiş veya sahteciliğe izin verilmez. Bu nedenle, çok kalpli iki boyutlu sıvı kromatografisi (Yao ve diğerleri, 2015), yakın kızılötesi yansıma spektroskopisi (Zhang ve Su, 2014; Zhang ve diğerleri, 2015) gibi kalite kontrol yöntemlerinin çeşitleri oluşturulmuştur. ) ve sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (Wang ve diğerleri, 2016b). Bununla birlikte, şu anda Çin Farmakopesi Komisyonu'nda (2015) bulunan analitik kimya yöntemleri, Çin patentli ilaçlardaki tüm bileşenlerin kimliğini doğrulamak veya katkı maddelerinin varlığını tespit etmek için kullanılamaz. Ayrıca, araştırmalar, bitkilerde hedeflenen metabolitlerin ürün işleme sırasında değiştirildiğini ve bunun da test sonuçlarında önemli değişkenliğe veya test yöntemlerinin tamamen başarısız olmasına neden olduğunu göstermiştir (Ananingsih ve diğerleri, 2013). Bu nedenle, türe özgü nükleotit imzaları gibi moleküler araçlar, sahte ürün ikamesi ve tağşiş ve etiketlenmemiş bileşenlerin dahil edilmesi riskine karşı kalite kontrol sistemlerini güçlendirmeye hazırdır.

ITS/ITS2, bitkisel ilaçların tanımlanması için yüksek verimli bir araç olarak görülse de, bu diziler yüksek oranda işlenmiş örneklerden çoğaltılamaz (Newmaster ve diğerleri, 2013; de Boer ve diğerleri, 2015). Wang et al. ITS2'nin Angelicae Sinensis Radix özütünden veya 120 dakikadan fazla kaynatılmış kaynatmalardan amplifiye edilemediğini bildirdi (Wang ve diğerleri, 2016a). Geleneksel teknolojilere ve Çin Farmakopesi Komisyonu'na (2015) göre Cistanches Herba, tıbbi etkinliğini artırmak için her zaman yüksek oranda işlenir; bu işlemler, DNA bozulmasına yol açan fırında kurutma, tuzlama ve şarapla buharda pişirmeyi içerir (Zou ve diğerleri, 2017). Ayrıca işleme sırasında bal, nişasta ve dekstrin gibi çeşitli eksipiyanlar eklenir. Bu eksipiyanlar tamamen çıkarılmazsa, DNA'nın saflığı etkilenecektir. Örneğin, Cistanches Herba içeren Sanbao kapsüllerini üretmek için aşağıdaki üretim süreci kullanılır: "Tıbbi dilimleri iki kez 1.5 saat kaynatın, kaynatmaları birleştirin ve karışımı süzün. ◦C) Diğer öğütülmüş tozları ekleyin ve homojen bir karışım elde etmek için birleştirin.Daha sonra karışımı 60°C'de kurutun ve ardından ince bir şekilde öğütün.

Ancak, yukarıda açıklanan üretim sürecinden sonra, Çin patentli ilaçların DNA ekstraksiyonu sırasında zorluklar olabilir ve bozulmuş DNA'dan uzun parçalar amplifiye edilemeyebilir, bu da zina yapanların tanımlanmasını engelleyecektir. DNA kalitesi ve saflığı açısından, genomik DNA ekstraksiyonundan önce, ön yıkama tamponuyla yıkama ve on paralel tüpün her parti için bir tüpe ayrıştırılması dahil olmak üzere ek adımlar ekledik.

Bu çalışmada kullanılan tüm Çin patentli ilaçlar 6-25 bileşen içerse de, geliştirilen primer çiftleri bu Çin patent ilaçlarındaki katkı maddelerinin dizilerini spesifik olarak büyütebilir. PCR ürünlerinin doğrudan dizilimi, temiz izleme dosyaları gösterdi. Bu nedenle, bu nükleotid imza yöntemi, hem otantik tür bileşenlerini hem de katkı maddelerini tanımlama yeteneğine sahiptir ve piyasa denetimi için DNA tabanlı moleküler tanı araçlarının uygulamasını genişletmelidir.

böbrek hasarı ve hastalığı cistanche ile tedavi edilebilir

Cistanches Herba Ürünlerinin Etkili Tanımlanması için Nükleotid İmzaları

PCR teknolojisini kullanan moleküler araçlar, kalite kontrol sistemlerinde tıbbi ürün kimlik doğrulaması için çok umut vericidir. Cistanches Herba'dan DNA'sı bozulmuş katkı maddelerinin tanımlanması için primerlerin başarılı bir şekilde uygulanması, PCR tabanlı bir tespit yönteminin yaygın olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Çin bitkisel ilaç pazarında, otantik Cistanches Herba türü bileşenlerinin fiyatı, katkı maddelerinin fiyatlarından beş kat daha fazladır. Sonuçlarımız Cy'nin olduğunu gösterdi. songaricum, Cistanches Herba'nın piyasadaki en yaygın zina maddesidir ve onu Ci takip eder. Sinensis. Cy. Songaricum, bu ilaçlar benzer morfolojik özellikleri paylaştığı için eklenmiştir. Ek olarak, Ci'nin kimyasal bileşimi. sinensis, Cistanches Herba'nınkine benzer. için kalite kontrol belirteçleri olarakCistanches Herbaekstraktlar, ekinakozit ve akteozit Ci'den ucuza ekstrakte edilebilir. sinensis. Bu nedenle, bazı ilaç fabrikaları Ci'yi kullanır. Cistanches Herba özlerinin üretiminde bir ikame olarak sinensis. Birlikte ele alındığında, bu çalışmanın sonuçları, tıbbi ürünler için piyasada önemli ölçüde sahtekarlık olduğunu göstermektedir.

Çin patent tıbbında tağşiş, diğer ülkelerde bulunanlara benzer. Kuzey Amerika'da (Newmaster ve diğerleri, 2013), Avrupa'da (Raclariu ve diğerleri, 2017) ve Asya'da (Cheng ve diğerleri, 2014; Shanmughanandhan ve diğerleri, 2016; Gao ve diğerleri. , 2017). Bu çalışmada, Çin patentli ilaçların sahte oranı yaklaşık yüzde 48,4'tü ve 31 örneğin sadece 16'sı orijinal Cistanches Herba'ydı. Ek olarak, aynı üreticinin ürünlerinde üretilen farklı sonuçların, Çin tıbbı malzemelerinin farklı partilerinin kalitelerindeki farklılıklara atfedilebileceğini düşündük. Bu nedenle, Çin patentli ilaçların kalitesini kontrol etmek için ham maddeler, ürünlere işlenmeden önce doğrulanmalıdır.

tağşişCistanches Herbageleneksel olarak hammadde arz ve talebi sorunları ile ilişkilendirilmiştir.Ci. çöl çiçeğiveCi. tübülozaşu anda formüle etmek için kullanılan iki orijinal bitkidir.Cistanches Herba. Ancak Ç. Deserticola, Çin Farmakopesi Komisyonu'nda (2000) listelenen geleneksel otantik Cistanches Herba'daki tek orijinal türdür. tubulosa bir zina olarak tanımlanır. Ci kıtlığı nedeniyle. çölikola kaynakları,Ci. tübüloza2005'ten beri Çin Farmakopesinde ek olarak listelenmiştir (Jiang ve Tu, 2009). Yakın zamana kadar bu bitkilerin fiyatları önemli ölçüde farklılık gösteriyordu; Ci. tubulosa, Ci'den çok daha ucuzdur. Deserticola, çünkü eskisinden çok daha büyük bir arz var. Burada sonuçlarımız Ci. tubulosa, ticari olarak temin edilebilen Cistanches Herba ürünlerinde daha yaygın olarak kullanılmaktadır.

Sonuç olarak, nükleotid imzaları ve PCR tabanlı

Bu çalışmada geliştirilen yöntemler, tıbbi ürün endüstrisi için bileşenlerin kimliğini doğrulamak ve tağşiş yapanları tespit etmek için yararlı araçlar olarak hizmet edebilir.CistanchesBitkisel ürünler. Duyarlılık sonucuna göre zina oranı on binde bir olsa bile qRT-PCR ile tespit edilebilir. Bu, bir nükleotid imzası tespit edildiğindeCistanchesBitkisel içerikli fonksiyonel ürünler, katkı maddesi veya sahte içerik olarak tanımlanabilir. Sahte içeriklerin veya karıştırılmış Cistanches Herba'nın tespit edilmesi için daha önce Çin Farmakopesinde kimyasal tespit yöntemleriyle mevcut olmayan yeni bir çözüm sağlandı. Ek olarak, bu yöntem, artan ilaç türlerini doğrulamak ve piyasa denetimi için DNA tabanlı moleküler tanı araçlarının uygulamalarını genişletmek için kullanılabilir.

rahatlatmak içinkronikböbrekhastalıkile birliktecistanche

YAZAR KATKILARI

JH çalışmayı tasarladı ve tasarımına katıldı. XW, RX ve JC örneklere katkıda bulundu ve deneyleri gerçekleştirdi. XW verileri analiz etti. Makaleyi XW, JH, ZZ, S-GN, JS ve SC hazırladı. Tüm yazarlar son makaleyi okumuş ve onaylamıştır.

FİNANSMAN

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [hibe numarası 81673552], CAMS Innovation tarafından desteklenmiştir.

Fund for Medical Sciences [hibe numarası 2016-I2 M- 3-016] ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın United Fund Key Projesi [hibe numarası U1403224].

TEŞEKKÜRLER

Chaokui Sun, Dianyun Hou ve Piao Zhang dahil olmak üzere numune toplama, tanımlama, laboratuvar çalışması ve el yazması hazırlama konusunda yardımcı olan meslektaşlarımıza teşekkür ederiz.

EK MATERYAL

Bu makalenin Ek Materyali çevrimiçi olarak şu adreste bulunabilir: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018. 01643/ful#tamamlayıcı-materyal

Ek Şekil S1|Altı türden ITS2 dizisinin hizalama sonucu.

Ek Şekil S2|Tüm numunelerin agaroz jel elektroforezi.

Ek Tablo S1|Cistanches Herba ve katkı maddelerinin numune alma bilgileri.

Ek Tablo S2|GenBank'tan indirilen ilgili türlerin dizi bilgileri.

Ek Tablo S3|Farklı Çin patentli ilaç numunelerinin beyan edilen bileşimleri.

Ek Veri Sayfası S1|Bu çalışmada elde edilen tüm diziler.

cistancheDeserticola'nın birçok etkisi var

REFERANSLAR

Ananingsih, VK, Sharma, A. ve Zhou, W. (2013). Gıda işleme ve depolama sırasında yeşil çay kateşinleri: stabilite ve tespit üzerine bir inceleme. Gıda Araş. Int. 50, 469-479. DOI: 10.1016/j.foodres.2011.03.004

Chen, H., Jing, FC, Li, CL, Tu, PF, Zheng, QS ve Wang, ZH (2007). Ekinakozit, monoamin striatal hücre dışı seviyelerini önler

6-hidroksidopamin lezyonlu sıçanlarda azalmadan kaynaklanan nörotransmitterler. J. Etnofarmakol. 114, 285-289. DOI: 10.1016/j.jep.2007.07.035

Chen, S., Yao, H., Han, J., Liu, C., Song, J., Shi, L., et al. (2010). Tıbbi bitki türlerinin tanımlanması için yeni bir DNA barkodu olarak ITS2 bölgesinin doğrulanması. PLoS ONE 5:e8613. DOI: 10.1371/journal.pone.0008613

Cheng, X., Su, X., Chen, X., Zhao, H., Bo, C., Xu, J., et al. (2014). Yüksek verimli sıralamaya dayalı geleneksel Çin tıbbı hazırlığının biyolojik içerik analizi: Liuwei Dihuang Wan'ın hikayesi. bilim 4:5147. DOI: 10.1038/srep05147

Çin Farmakopesi Komisyonu. (2000). Çin Halk Cumhuriyeti Farmakopesi. Bölüm I. Pekin: Çin Tıp Bilimi Basını.

Çin Farmakopesi Komisyonu. (2015). Çin Halk Cumhuriyeti Farmakopesi. Bölüm I. Pekin: Çin Tıp Bilimi Basını.

de Boer, HJ, Ichim, MC ve Newmaster, SG (2015). Bitkisel ilaçların DNA barkodlaması ve farmakovijilansı. İlaç Saf. 38, 611-620. DOI: 10.1007/sn40264-015-0306-8

Dubey, B., Meganathan, PR ve Haque, I. (2011). DNA mini barkodlama: nesli tükenmekte olan bazı Hint yılan türlerinin adli olarak tanımlanması için bir yaklaşım. Adli. bilim Int. Genet. 5, 181–184. DOI: 10.1016/j.fsigen.2010.03.001

Edgar, RC (2004). KAS: yüksek doğruluk ve yüksek verim ile çoklu dizi hizalaması. Nükleik Asitler Araş. 32, 1792-1797. DOI: 10.1093/var/gkh340

Fu, L. (1991). Çin Bitki Kırmızı Veri Kitabı. Bölüm I. Pekin: Science Press, 502.

Gao, Z., Liu, Y., Wang, X., Song, J., Chen, S., Ragupathy, S., et al. (2017). DNA barkodlamanın türev teknolojisi (nükleotid imzası ve SNP çift tepe yöntemleri), Çin patent ilaçlarındaki katkı maddelerini ve ikameyi tespit eder. bilim 7:5858. DOI: 10.1038/sn41598-017-05892-y

Gu, CM, Yang, XY ve Huang, LF (2016). Cistanches Herba: Bir nörofarmakoloji incelemesi. Ön. Farmakol. 7:289. DOI: 10.3389/fphar.2016.00289

Hajibabaei, M., Smith, MA, Janzen, DH, Rodriguez, JJ, Whitfield,

JB ve Hebert, PDN (2006). Minimalist bir barkod, DNA'sı bozulmuş bir örneği tanımlayabilir. Mol. ekol. Notlar 6, 959-964. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2006.01470.x

Japonya Farmakopesi Sözleşmesi. (2016). Japon Farmakopesi, 17. Baskı. Tokyo: Japonya Sağlık, Çalışma ve Refah Bakanlığı, 1831-1832.

Jiang, Y. ve Tu, PF (2009). Cistanche türlerinde kimyasal bileşenlerin analizi. J. Kromatogr. 1216, 1970-1979. DOI: 10.1016/j.chroma.2008.07.031

Keller, A., Schleicher, T., Schultz, J., Müller, T., Dandekar, T. ve Wolf, M. (2009). 5.8S-28S rRNA etkileşimi ve HMM tabanlı ITS2 ek açıklaması. Gen 430, 50-57. doi: 10.1016/j.gene.2008.10.012

Lei, L., Yang, F., Zhang, T., Tu, P., Wu, L. ve Ito, Y. (2001). Yüksek hızlı karşı akım kromatografisi ile Cistanches salsa (CA Mey.) G. Beck'ten ateosit ve 2'-asetil ateozitin hazırlayıcı izolasyonu ve saflaştırılması. J. Kromatogr. 912, 181–185. DOI: 10.1016/S0021-9673(01)00583-0

Li, Z., Lin, H., Gu, L., Gao, J. ve Tzeng, CM (2016). Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): Geleneksel Çin tıbbının en iyi ilaç hediyelerinden biridir. Ön. Farmakol. 7:41. DOI: 10.3389/fphar.2016.00041

Liu, XM, Li, J., Jiang, Y., Zhao, MB ve Tu, PF (2013). Cistanche Sinensis'ten (Orobanchaceae) kimyasal bileşenler. Biyokimya. Sist. ekol. 47, 21-24. DOI: 10.1016/j.bse.2012.09.003

Liu, Y., Wang, X., Wang, L., Chen, X., Pang, X. ve Han, J. (2016). Amerikan ginsengi ve ürünlerinin tanımlanması için bir nükleotid imzası. Ön. Bitki Bilimi 7:319. DOI: 10.3389/fpls.2016.00319

Lo, YT, Li, M. ve Shaw, PC (2015). DNA belirteçleri ile ginseng kaynatmalarındaki kurucu bitkilerin tanımlanması. Çene. Med. 10:1. DOI: 10.1186/s13020-015-0029-x

Meusnier, I., Singer, GA, Landry, JF, Hickey, DA, Hebert, PD ve Hajibabaei, M. (2008). Biyoçeşitlilik analizi için evrensel bir DNA mini barkodu. BMC Genomik 9:214. DOI: 10.1186/1471-2164-9-214

Newmaster, SG, Grguric, M., Shanmughanandhan, D., Ramalingam, S. ve Ragupathy, S. (2013). DNA barkodu, Kuzey Amerika bitkisel ürünlerinde kontaminasyonu ve ikameyi tespit eder. BMC. Med. 11:222. DOI: 10.1186/1741-7015-11-222

Raclariu, AC, Mocan, A., Popa, MO, Vlase, L., Ichim, MC, Crisan, G., et al. (2017). DNA metabarkodlama ve HPLC-MS kullanılarak Veronica officinalis ürün kimlik doğrulaması, Veronica chamaedrys ile yaygın olarak karıştırıldığını ortaya koyuyor. Ön. Farmakol. 8:378. DOI: 10.3389/fphar.2017.00378

Shanmughanandhan, D., Ragupathy, S., Newmaster, SG, Mohanasundaram, S. ve Sathishkumar, R. (2016). Hindistan'da kuponlu, DNA tabanlı biyolojik referans materyali kitaplığı kullanarak bitkisel ürün kimlik doğrulaması ve tağşiş tahmini. İlaç Saf. 39, 1211–1227. DOI: 10.1007/sn40264-016- 0459-0

Sun, ZY, Song, JY, Yao, H. ve Han, JP (2012). Cistanches Herba ve katkı maddelerinin nrITS2 dizisine dayalı moleküler tanımlaması. J. Med. Bitkiler Araş. 6, 1041-1045. DOI: 10.5897/JMPR11.115

Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M. ve Kumar, S. (2011). MEGA5: maksimum olabilirlik, evrimsel uzaklık ve maksimum cimrilik yöntemlerini kullanan moleküler evrimsel genetik analizi. Mol. Biol. Evrim. 28, 2731-2739. DOI: 10.1093/molbev/msr121

Wang, Q., Song, W., Qiao, X., Ji, S., Kuang, Y., Zhang, ZX, et al. (2016b). Geleneksel Çin tıbbı formülü Gegen-Qinlian kaynatma formülünün 50 biyoaktif bileşiğinin, tandem kütle spektrometrisi ile birleştirilmiş ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak eşzamanlı ölçümü. J. Kromatogr. 1454, 15-25. DOI: 10.1016/j.chroma.2016. 05.056

Wang, T., Zhang, XY ve Xie, WY (2012). cistanche çöl çiçeği

YC Ma, "Çöl ginsengi": bir inceleme. Ben. J.Çin. Med. 40, 1123-1141. DOI: 10.1142/S0192415X1250838

Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J. ve Chen, S. (2016a). Angelicae Sinensis Radix (Danggui) ve ürünlerinin tanımlanması için bir nükleotid imzası. bilim 6:34940. DOI: 10.1038/srep34940

Yao, CL, Yang, WZ, Wu, WY, Dai, J., Hou, JJ, Zhang, JX,

et al. (2015). Çok kalp kesen iki boyutlu sıvı kromatografisi ile beş Panax notoginseng saponininin eş zamanlı ölçümü: Çin patentli ilaçları içeren sekiz Notoginseng'in kalite kontrolüne yöntem geliştirme ve uygulama. J. Kromatogr. 1402, 71-81. DOI: 10.1016/j.chroma.2015.05.015

Zhang, C. ve Su, J. (2014). Geleneksel Çin tıbbi ürünlerinin analizine ve hızlı kalite değerlendirmesine yakın kızılötesi spektroskopi uygulaması. Acta. Eczacılık Günah. B4, 182-192. DOI: 10.1016/j.apsb.2014.04.001

Zhang, W., Qu, Z., Wang, Y., Yao, C., Bai, X., Bian, S., et al. (2015). Çin patent tıbbı Naosaitong hapında ginsenosid Rg1 ve Re'nin hızlı belirlenmesi için yakın kızılötesi yansıma spektroskopisi (NIRS). Spektrokim. Acta. Bir Mol. biyomol. spektrosk. 139, 184–188. DOI: 10.1016/j.saa.2014.11.111

Zou, P., Song, Y., Lei, W., Li, J., Tu, P. ve Jiang, Y. (2017). Farklı parçaların ayrımı için 1H NMR tabanlı metabolomiklerin uygulanması ve Cistanche Deserticola için yeni bir işleme iş akışının geliştirilmesi. Acta. Eczacılık Günah. B7, 647-656. DOI: 10.1016/j.apsb.2017.07.003

Çıkar Çatışması Beyanı: Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmaksızın yürütüldüğünü beyan eder.

Telif Hakkı © 2018 Wang, Xu, Chen, Song, Newmaster, Han, Zhang ve Chen. Bu, Creative Commons Atıf Lisansı (CC BY) koşulları altında dağıtılan açık erişimli bir makaledir. Orijinal yazar(lar)a ve telif hakkı sahibine/sahiplerine atıfta bulunulması ve kabul edilen akademik uygulamaya uygun olarak bu dergideki orijinal yayına atıfta bulunulması koşuluyla diğer forumlarda kullanım, dağıtım veya çoğaltmaya izin verilir. Bu şartlara uymayan hiçbir kullanım, dağıtım veya çoğaltmaya izin verilmez.