Bölüm 2: Sirkadiyen Gen Per1'in Epigenetik Düzenlemesi Hipokampal Bellekte Yaşa Bağlı Değişikliklere Katkı Sağlıyor

İletişim: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Lütfen Bölüm 1 için buraya tıklayın

Per1'in yıkılması uzun vadede zarar verirhafızagenç farelerde.Daha sonra, dorsal hipokampusta Per1'in yukarı regülasyonunun uzun vadede gerekli olup olmadığını test etmek içinhafızaoluşumunda, 10-dakika OLM eğitiminden 48 saat önce genç farelerin dorsal hipokampüsüne Per1'i hedefleyen siRNA'yı infüze ettik. Per1 siRNA'nın infüzyonu, son test seansından 2 saat sonra ölçüldüğü gibi dorsal hipokampusta PER1 proteininde önemli bir azalma üretti (Şekil 4d, Ek Şekil 5). PER1 proteininin bu nispeten mütevazı yıkımı (~ yüzde 30), ciddi şekilde bozulmuş proteinler üretti.hafızaOLM için oluşum; Per1 siRNA ile aşılanmış fareler, eğitim ve test arasında DI'de anlamlı bir artış göstermedi ve test sırasında toplam nesne keşfi üzerinde hiçbir etkisi olmayan kontrol farelerine göre (Şekil 4e) test sırasında hareketli nesne için önemli ölçüde daha az tercih gösterdi (Şekil 4f) ve eğitim öncesi alışma oturumları sırasında harekette fark yok (Ek Şekil 8c). Bu, ilk kez, hipokampus içindeki bir çekirdek sirkadiyen saat geninin seçici olarak yerel olarak bozulmasınınhafızaoluşum.

Per1 aşırı ifade geliştirirhafızayaşlanan farelerde. Nihayet,Per1'in dorsal hipokampusta aşırı ekspresyonunun yaşa bağlı durumu iyileştirmek için yeterli olup olmadığını belirlemek içinhafızaBozukluklar için, iki tamamlayıcı yöntem kullanarak Per1'i yerel olarak artırdık. İlk olarak, bir v5 epitop etiketi (pLVX-v5Per1) ile vahşi tip Per1'i eksprese eden bir lentivirüs kullandık (Şekil 5a, Ek Şekil 6a). Bu plazmitin Per1'i aşırı ifade ettiğini doğrulamak için HT22 hücrelerini pLVX-v5Per1 veya pLVX-EV ile transfekte ettik ve Per1 mRNA ifadesini ölçtük. Transfeksiyondan 24 ve 48 saat sonra, kontrol plazmidi ile transfekte edilmiş hücrelere göre pLVX-v5Per1 ile transfekte edilmiş hücrelerde Per1 mRNA önemli ölçüde artmıştır (Şekil 5b). pLVX-v5Per1'in transfeksiyonu ayrıca 24 saatte Per2 (Per1 ile etkileşime giren bir Dönem saat ailesi üyesi) için mRNA'da önemli bir artışa yol açtı (Ek Şekil 6b), ancak bu artış Per1'de gözlenen artıştan çok daha küçüktü ( 24 sa, Per1: 466-EV'ye göre kat artış, Per2: EV'ye göre 1.6-kat artış). Bununla birlikte, Per1 aşırı ekspresyonu, en yakın aşağı akış geni Hes7'nin transkripsiyonunu etkilemedi (Ek Şekil 6c).

Per1 aşırı ifadesinin iyileşip iyileşmediğini belirlemek içinhafızayaşlanan farelerde performans, pLVX-v5Per1, davranıştan 2 hafta önce 18-mo farelerinin dorsal hipokampüsüne infüze edildi. pLVX-v5Per1 fareleri önemli ölçüde iyileştihafızapLVX-EV (boş vektör) kontrollerine göre testte OLM için (Şekil 5c). Sadece pLVX-v5Per1 fareleri, testte (Şekil 5d) veya alışkanlık sırasında harekette (Ek Şekil 8d) toplam keşifte gözlemlenen grup farklılıkları olmaksızın, eğitime göre dinlenme halindeki hareketli nesne tercihinde önemli bir artış gösterdi.

Davranışı takiben, bir hayvan alt kümesinden alınan hipokampal doku, in vivo uygun gruplarda pLVX-EV ve pLVX-v5Per1 transkriptlerinin varlığını doğrulamak için RNA dizilimi için işlendi (Ek Şekil 7a, b, f, g).

Bu yaklaşımı tamamlamak için, dorsal hipokampusta Per1'in transkripsiyonel aktivasyonunu yönlendirmek için CRISPR/dCas9 Sinerjistik Aktivasyon Aracısı (SAM) sistemini33 de kullandık. Bu sistem üç lentiviral bileşenden oluşur: katalitik olaraketkin olmayan Cas9 (dCas9), bir GFP etiketi (dCas9-VP64-GFP), iki MS2 RNA aptameriyle Per1'i hedefleyen modifiye edilmiş bir tek kılavuzlu RNA (sgRNA) ile bir VP64 transkripsiyonel aktivasyon alanına kaynaşmıştır. üçüncü bileşeni, bir MS2- çift transkripsiyonel aktivatörü (MS2-p65-HSF1) füzyon proteinini işe alın(Şekil 5e). Kontrol hayvanları, SAM sistemini Perl'e hedeflemek için gereken 20 nükleotid dizisinden yoksun bir kontrol sgRNA'sı aldı (ctrl sgRNA olarak anılır). Bu bileşenlerin Per1 promotöründe birleştirilmesi, üç efektör alanının (VP64, p65 ve HSF1) Per1 transkripsiyonunu yürütmesine izin verir. Doğrulamak için, Şekil 5 Per1'in dorsal hipokampusta aşırı ekspresyonunun etkinliği, nesne konumunda yaşa bağlı bozuklukları iyileştirir.hafıza. v{{0}}etiketli Per1'i (pLVX-v5Per1) aşırı ifade etmek için kullanılan lentivirüs yapısının şeması, boş vektör kontrolüne (pLVX-EV) kıyasla. b Per1 mRNA, HT22 hücrelerinde pLVX-v5Per1'in transfeksiyonundan 24 ve 48 saat sonra EV ile transfekte edilmiş hücrelere kıyasla önemli ölçüde arttı (İki yönlü ANOVA: Grup x Zaman Noktası etkileşimi (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{40}}1),="" sidak'ın="" post="" hoc="" testleri,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-plvx-v5per1="" hipokampal="" infüzyonları="" verilen="" mo="" fareler,="" plvx-ev="" kontrol="" virüsü="" verilen="" farelere="" göre="" olm="" için="" önemli="" ölçüde="" daha="" iyi="" bellek="" gösterdi="" (iki="" yönlü="" anova:="" virüs="" x="" oturum="" etkileşimi,="" (f(1,29))="" {{34="" }}.15,="" p="">< 0.05),="" sidak'ın="" post="" hoc="" testleri,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" n="16," 15,="" tüm="" erkekler).="" d="" testte="" her="" iki="" grup="" için="" toplam="" keşif="" benzerdi="" (t(29)="0.57," p="0.57)." e="" per1="" transkripsiyonunu="" çalıştırmak="" için="" kullanılan="" crispr/dcas9="" sinerjistik="" aktivasyon="" aracısı="" (sam)="" sisteminin="" şeması.="" üst:="" sam'ın="" bireysel="" bileşenleri.="" alt:="" per1="" promotöründe="" bir="" araya="" getirilen="" ve="" per1="" transkripsiyonunu="" çalıştıran="" bileşenler.="" f="" per1="" mrna,="" ht22="" hücrelerinde="" crispr-sam="" bileşenlerinin="" transfeksiyonundan="" 48="" saat="" sonra,="" kontrol="" sgrna="" ile="" transfekte="" edilmiş="" hücrelere="" kıyasla="" önemli="" ölçüde="" arttı="" (iki="" yönlü="" anova:="" grup="" x="" zaman="" noktası="" etkileşimi="" (f(1,8)="14).77" ,="" p="">< 0.01),="" sidak'ın="" post="" hoc="" testleri,="" **p="">< 0,001,="" n="3,3,3,3)." sgrna="" per1'i="" hedefleyen="" crispr-sam="" sisteminin="" hipokampal="" infüzyonları="" verilen="" g="" 18-mo="" fareler="" önemli="" ölçüde="" daha="" iyi="">hafızaOLM için, kontrol sgRNA'lı EV kontrol fareleriyle karşılaştırıldığında (İki yönlü ANOVA: Virüs x Oturum etkileşimi (F(1,30)=5.83, p < 0.05)="" ,="" sidak'ın="" post="" hoc="" testleri,="" ***p="">< 0,001,="" n="17," 15,="" tüm="" erkekler).="" h="" toplam="" keşif,="" testte="" her="" iki="" grup="" için="" benzerdi="" (t(30)="0.41," p="0.68)." veriler,="" crispr-sam="" sisteminde="" ortalama="" ±="" sem="" olarak="" sunulur,="" ht22="" hücrelerini="" üç="" plazmitin="" tümü="" ile="" transfekte="" ettik,="" hücreleri="" 24="" veya="" 48="" saat="" sonra="" topladık="" ve="" per1="" mrna="" ekspresyonunu="" ölçtük.="" transfeksiyondan="" 48="" saat="" sonra,="" per1="" sgrna="" verilen="" grupta="" kontrollere="" kıyasla="" per1="" mrna="" önemli="" ölçüde="" arttı="" (şekil="" 5f),="" bu="" da="" crispr-sam="" sisteminin="" per1="" mrna="" ifadesini="" etkin="" bir="" şekilde="" yönlendirdiğini="" doğruladı.="" per2="" mrna="" (ek="" şekil="" 6e)="" veya="" hes7="" mrna="" (ek="" şekil="" 6f)="" için="" ifadede="" hiçbir="" değişiklik="" gözlemlemedik,="" bu="" da="" crispr-sam="" sisteminin="" hedef="" gen="" per1'in="" seçici="" aşırı="" ekspresyonunu="" tahrik="" ettiğini="">

Daha sonra, 18-mo farelere CRISPR-SAM lentivirüslerinin hipokampal içi infüzyonları verildi (Ek Şekil 6d) ve 2 hafta sonra OLM'de eğitildi. pLVX- v5Per1 aşırı ekspresyonumuzda gözlemlendiği gibi, CRISPR-SAM aracılı Per1 aşırı ekspresyonu önemli ölçüde iyileştihafızaPer1 sgRNA ile aşılanmış farelerde, kontrol hayvanlarına göre (Şekil 5g) performans, toplam keşif (Şekil 5h) veya alışkanlık sırasındaki hareketi etkilemeden (Ek Şekil 8e). Yalnızca Per1 sgRNA verilen fareler, eğitime göre hareketsiz haldeki hareketli nesne tercihinde önemli bir artış gösterdi, bu da bozulmamış olduğunu gösterir.hafızanesne konumları için (Şekil 5g). Davranışın ardından, bir hayvan alt kümesinden alınan hipokampal doku, in vivo olarak uygun gruplarda CRISPR transkriptlerinin varlığını doğrulamak için RNA dizilimi için işlendi (Ek Şekil 7c–g). Birlikte, bu sonuçlar, dorsal hipokampusta Per1'in aşırı ekspresyonunun, uzun süreli nesne konum belleğindeki yaşa bağlı bozuklukları iyileştirmek için yeterli olduğunu göstermektedir. Bu nedenle Per1, uzun süreli hafıza oluşumu için kritik olan, HDAC3 tarafından düzenlenen ve yaşlanan beyinde bozulan anahtar bir gendir.

Tartışma

Sonuçlarımız, baskılayıcı histon deasetilaz HDAC3'ün silinmesinin veya bozulmasının, hem uzun vadede hem de uzun vadede yaşa bağlı bozuklukları iyileştirebileceğini göstermektedir.hafızave sinaptik plastisite. Ayrıca, HDAC3'ün silinmesi, dorsal hipokampusta sirkadiyen Per1 geninin deneyim kaynaklı ekspresyonunu geri yükler. Hipokampal PER1 ekspresyonu uzun süreli bellek oluşumu için kritik olduğundan (Şekil 4) ve hipokampusta Per1'in aşırı ekspresyonu yaşa bağlı bellek bozukluklarını iyileştirdiğinden (Şekil 5), PER1, HDAC3'ün silinmesinin iyileştirdiği potansiyel bir mekanizmadır.hafızave yaşlanan farelerde sinaptik plastisite. Daha geniş olarak, Per1'in yaşa bağlı bozulması, yapıya bağlı olarak hem uzun süreli bellekte hem de sirkadiyen ritmiklikte yaşa bağlı bozulmaları birbirine bağlayabilir.

Mevcut çalışmadan elde edilen önemli bir bulgu, hipokampal LTP'deki yaşa bağlı bozuklukların HDAC3'ün silinmesi veya bozulmasıyla iyileştirilebileceğiydi. Bu, HDAC3'ün farmakolojik blokajının aynı zamanda birleştirici hipokampal LTP34'te yaşa bağlı bozuklukları iyileştirebileceğini gösteren Sajikumar laboratuvarından yapılan son çalışmalarla tutarlıdır. İlginç bir şekilde, eski HDAC3flox/flox ve HDAC3(Y298H) hayvanlarından alınan dilimlerin, genç HDAC3flox/flox veya HDAC3(Y298H) hayvanlarından alınan dilimlerle aynı güçlenme düzeyine ulaşamadığını bulduk (Şekil 2c, f), bu da şunu düşündürür: yaşlanan beyinler, genç beyinlere göre daha düşük bir plastisite tavanına sahip olabilir. Güçlenmedeki bu fark için olası bir açıklama, CA122'deki yaşa bağlı sinaptik temas kaybının, yaşlanan hipokampustaki plastisite tavanını düşürebileceğidir, çünkü daha az sayıda mevcut sinaps genç DH'deki nispeten bol sinapslardan daha hızlı doygun hale gelecektir. Durum buysa, stimülasyon protokolünü güçlendirmek veya aralıklı stimülasyon nöbetleri sağlamak35, ek sinaps bulunmadığından, yaşlanan hipokampusta LTP'yi daha fazla artırmamalıdır. Bu farklılığın altında yatan mekanizmayı belirlemek için daha fazla çalışma gerekli olacaktır.

RNA dizileme sonuçlarımız, yalnızca küçük bir gen alt kümesinin, yaşlanan beyinde HDAC3 delesyonu ile restore edilme kriterlerine uyduğunu göstermiştir (Şekil 3e). Bu nedenle, genç beynin gen ekspresyon profilini özetlemek yerine, yaşlanan beyinde HDAC3'ün silinmesi, Per1 de dahil olmak üzere uzun süreli hafıza oluşumu için kritik öneme sahip birkaç anahtar genin deneyime bağlı ekspresyonunu restore etti. HDAC3'ün geri yüklenen deneyime bağlı Per1 ifadesinin odaksal olarak silinmesi ve HDAC3, OLM eğitimine yanıt olarak Per1 promotöründen fiziksel olarak kaldırıldığından, Per1 doğrudan HDAC3 tarafından düzenleniyor gibi görünmektedir. Ayrıca, Per1 ifadesi için gereklidirhafıza, DH bozulmuş uzun vadede PER1 proteininin siRNA aracılı yıkımı olarakhafızagenç farelerde oluşumu ve aşırı ekspresyon düzeldihafızayaşlanan farelerde OLM için. Özellikle, Per1'i aşırı eksprese etmek için kullanılan her iki lentiviral sistem, dorsal hipokampüsün CA1b bölgesinde yalnızca az sayıda hücreyi transfekte etti (Ek Şekil 6a, d), bu yapıların varlığını RNA dizilimi ile doğrulamayı gerekli kıldı (yöntemlere bakınız). ). Önceki çalışma, dorsal hipokampüsün bu kesin bölgesinin OLM36 için kritik olduğunu gösterdiği gibi, bu, bellekle ilgili bir yapı içinde Per1'in küçük bir odak değişikliğinin bile uzun süreli bellek oluşumunu etkileyebileceğini göstermektedir. Bu, beyin boyunca Per1'in spesifik olmayan silinmesinin genç farelerde hafıza oluşumunu bozabileceğini gösteren önceki araştırmaları genişletir6,28,29. Bu nedenle, yaşlanan beyinde Per1'in anormal HDAC3-aracılı baskısı, hem uzun süreli hafıza oluşumunda hem de sirkadiyen ritmiklikte yaşa bağlı bozukluklara yol açabilecek önemli bir olaydır. Bu çalışma, Per1'in, HDAC3'ün yaşlanan beyindeki uzun süreli belleği düzenlediği önemli bir gen olduğunu açıkça gösterse de, diğer genler büyük olasılıkla HDAC3'ün silinmesinin bellek geliştirici etkilerine katkıda bulunur. HDAC3'ün sinaptik plastisite ve bellek üzerindeki etkilerine aracılık etmesi önerilen diğer genler arasında NF-KB34, FMRP37 ve Nr4a226 bulunur. Mevcut çalışmada, Per1 gibi, HDAC3 delesyonu ile iyileşen, yaşlanan beyinde bozulmuş ekspresyon gösteren ek üç gen tanımladık (Şekil 3f:Nr4a1, Egr1, Tsc22d3). Bu farklı genlerin, HDAC3'ün silinmesinin hafıza geliştirici etkilerine benzersiz bir şekilde nasıl katkıda bulunduğu şu anda belirsizdir. Özellikle, bu genlerin tümü, uzun süreli bellek oluşumu 38, 39 için kritik olan ve PER16, 28'in hem yukarı hem de aşağı akışında olan CBP / CREB yolu ile arayüz oluşturur. PER1, CREB fosforilasyonunun yukarı akışında olduğundan6, Per1'in HDAC3-aracılı baskısının CREB fosforilasyonunu azaltması, sonuçta Fmrp40,41 ve Nr4a gen ailesi üyeleri Nr4a1 ve Nr4a226 gibi CREB aracılı genlerin transkripsiyonunu bozması mümkündür. HDAC3, PER1 ve bu diğer moleküler oyuncular arasındaki karmaşık dinamikleri anlamak, gelecekteki araştırmaların önemli bir hedefi olacaktır.

Mevcut çalışmada, yaşlanan beyinde Per1'i aşırı eksprese etmek için iki tamamlayıcı yöntem kullandık: pLVX-v5Per1 kullanılarak tam uzunluktaki Per1 cDNA yapısının aşırı ekspresyonu ve CRISPR-SAM sistemi kullanılarak endojen Per1'in transkripsiyonel aktivasyonu. pLVX aracılı aşırı ekspresyon, Per1 mRNA'da büyük bir artışa neden olmasına rağmen (Şekil 5b), buna başka bir Periyot aile üyesi olan Per2'de bir artış eşlik etti (Ek Şekil 6b). Bununla birlikte, aşağı akış geni Hes7'nin ifadesi, pLVX-v5Per1 tarafından değiştirilmemiştir (Ek Şekil 6c). Öte yandan CRISPR-SAM sistemi, Per1 mRNA'da Per2 veya Hes7 ifadesinin hedef dışı geliştirmelerinden kaçınan daha ince bir artış üretti (Ek Şekil 6e–f). Her iki yaklaşım da benzer şekilde uzun vadede iyileştikçehafızayaşlanan farelerde, pLVX-v5Per1 ile gözlemlenen Per2'deki hedef dışı artışın, uzun süreli bellekte gözlenen iyileşmenin nedeni olması pek olası değildir.

Uzun vadede sirkadiyen etkilerhafızageleneksel olarak SCN içindeki düzensizlikten kaynaklandığına inanılır, bu da daha sonra dorsal hipokampus gibi hafıza oluşumunda yer alan çevresel yapılardaki değişiklikleri tetikler. Sirkadiyen ritmiklik ve uzun süreli hafıza oluşumu arasında açık bir bağlantı olmasına rağmen, bireysel sirkadiyen saat genlerinin DH'deki rolü hakkında çok az şey bilinmektedir. Plastisite ile ilgili gen basamakları sirkadiyen salınımları3,6 gösterdiğinden, hafıza günün saatiyle yakından bağlantılıdır.hafızasirkadiyen döngünün belirli dönemlerinde daha kolay elde edilebilir. Örneğin, bağlam korkusu koşullandırma, MAPK fosforilasyon seviyelerinin en yüksek olduğu gündüz saatlerinde daha güçlü bir şekilde edinilir3. Ayrıca, yaşlanmaya, muhtemelen merkezi sirkadiyen saatteki, suprakiazmatik çekirdekteki (SCN) değişikliklere bağlı olarak sirkadiyen ritimlerin bozulmasının eşlik ettiği iyi belgelenmiştir (inceleme için1). Sirkadiyen saatteki bu bozulma, yaşa bağlı bozukluklarla nasıl ilişkilidir?hafızaaçık bir sorudur. Sonuçlarımız, HDAC3'ün yaşlanan hipokampusta deneyime bağlı Per1'i sınırladığını ve muhtemelen uzun süreli bellekte gözlenen bozulmalara katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu nedenle Per1'in epigenetik baskısı, hem sirkadiyen ritmiklikte hem de uzun süreli hafıza oluşumunda yaşa bağlı bozukluklar arasında önemli bir arayüzü temsil edebilir.

Temel kanonik sirkadiyen saat genlerinden Per1, hipokampal uzun vadede dramatik bir şekilde etkilemeye benzersiz bir şekilde hazırdır.hafıza. Per1 ağırlıklı olarak SCN çıkış yollarında yer alıyor gibi görünüyor ve hipokampus gibi SCN'nin aşağı akışındaki periferik saatlerde önemli bir rol oynuyor42. Ayrıca, son çalışmalar, Per1'in CREB fosforilasyonunu kontrol ederek gündüz/gece döngüsü boyunca uzamsal bellek oluşumunu "geçitleyebileceğini" öne sürüyor6,28,29. Gerçekten de, sıçanlarda yapılan çalışmalar da dahil olmak üzere en az üç diğer RNA-seq çalışmasında bağlam veya uzamsal öğrenmeden sonra hipokampal Per1 mRNA yukarı regülasyonu gözlemlenmiştir, bu da Per1'in türler arasında öğrendikten sonra tipik olarak yukarı regüle edildiğini gösterir20,43,44. Mevcut çalışmanın sonuçlarıyla birlikte, bu çalışma, PER1 ifadesinin hipokampal uzun süreli bellek oluşumu için kritik derecede önemli olduğunu göstermektedir; PER1'de gece29 veya yaşlanmayla meydana gelen azalmalar hipokampal durumu bozabilirhafıza. Bugüne kadar,

Per1'i içeren araştırmahafızaoluşumu, yalnızca hipokampus6,28,29,45,46 gibi bellekle ilgili yapılara ek olarak çekirdek sirkadiyen saat ve diğer bölgelerdeki Per1 ifadesini bozan küresel nakavtlara dayanmıştır, bu da hipokampal PER1'in özel olarak gerekli olup olmadığını belirlemeyi imkansız kılar. hafıza oluşumu. Gerçekten de, bazı raporlarda genel Per1 silme işlemi sirkadiyen ritmikliği etkiler42. Burada, doğrudan dorsal hipokampusta PER1 ifadesinin azaltılmasınınhafızagenç farelerde Per1'in dorsal hipokampusta lokal aşırı ekspresyonu, yaşlanan farelerde hafızayı iyileştirebilir. Dorsal hipokampustaki seçici silme HDAC3 (Per1'i düzenleyen) bu çalışmada sirkadiyen aktivite paternleri üzerinde hiçbir etkiye sahip olmadığından (Ek Şekil 4) ve dorsal hipokampüsün elektrolitik lezyonları bile sirkadiyen ritmi 47 etkilemek için yetersiz görünmektedir. Per1'i dorsal hipokampus içinde manipüle etmek, merkezi sirkadiyen saatin işlevini etkiler. Bununla birlikte, Per1'deki deneyime bağlı artışların veya Per1'in virüs aracılı aşırı ekspresyonunun, sirkadiyen aktivite modellerini etkilemeden bile, hipokampal nöronlardaki diğer saat genleri gibi diğer moleküler oyuncuların sirkadiyen salınımını etkilemesi mümkündür. Per1'in bu potansiyel etkileşimli ortakları belirlemek de dahil olmak üzere bellek oluşumunu nasıl değiştirdiğini anlamak, gelecekteki çalışmaların hedefi olacaktır.

Birlikte, bu sonuçlar, çekirdek sirkadiyen saat geni Per1'in yerel olarak anahtar bir rol oynadığını göstermektedir.hafızaSCN'deki işlevinden bağımsız bir rol olan bellek oluşumunu değiştirmek için yapılar. Daha genel olarak, bu, sirkadiyen saatlerin değiştiğine dair geleneksel hipoteze meydan okur.hafızaoluşumu, çekirdek sirkadiyen saatteki değişiklikler tarafından yönlendirilir ve bunun yerine, sirkadiyen saat genlerinin hipokampal hücrelerde daha özerk bir rol oynadığı hipotezini destekler, muhtemelen günün saatine dayalı hafıza oluşumuna yol açar6.

yöntemler

Fareler. Test sırasında genç yetişkin fareler 2 ila 4 aylıktı ve yaşlanan fareler 18 ila 20 aylıktı. Tüm fareler C57BL/6J idi veya bir C57BL/6 arka planında tutuldu (HDAC3 plus / plus ve HDAC3flox/flox fareleri). Fareler, yiyecek ve suya serbest erişime sahipti ve ışıklar, 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsünde tutuldu. Tüm davranış testleri ışık döngüsü sırasında yapıldı. Tüm deneyler, hayvan bakımı ve kullanımına ilişkin ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine göre yapıldı ve California Üniversitesi, Irvine Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

Ameliyat. Farelere izofluran ile anestezi uygulandı (uyarılmış, yüzde 4; korunan yüzde 1.5–2.0) ve stereotaksik içine yerleştirildi. Enjeksiyon iğneleri, Bregma'ya göre 0.2 mm/15 s (AP, -2.0 mm; ML, ± 1.5 mm, DV, − 1.5 mm) hızında dorsal hipokampa indirildi. ). Hedef derinliğe ulaştıktan iki dakika sonra, 1.0 ul virüs veya siRNA çift taraflı olarak DH'ye 6 ul/saat hızında infüze edildi. CRISPR-SAM lentiviral infüzyonları için, üç virüsün bir kokteyli, aynı hızda yarım küre başına 1.5 μL'lik bir nihai hacme kadar infüze edildi. Enjeksiyon iğneleri, virüsün yayılmasını sağlamak için enjeksiyondan iki dakika sonra yerinde kaldı. Enjektörler daha sonra 0.1 mm yükseltildi ve 15 saniyede 0.1 mm oranında çıkarılmadan önce bir dakika daha oturmaya bırakıldı. Viral infüzyonlar davranış analizinden 2 hafta önce gerçekleştirilirken, siRNA yıkımı eğitimden 2 gün önce gerçekleştirilmiştir13. Tüm enjeksiyon deneyleri için, hayvanlar farklı enjeksiyon koşullarına rastgele atanmıştır (hepsi AAV-CaMKII-Cre enjekte edilmiş olan HDAC3 plus/plus ve HDAC3flox/flox fareleri hariç). Tüm davranış deneyleri için, her bir viral koşuldaki hayvanlar, kafes/eğitilmiş gruplara rastgele atanmış ve tüm koşullar (nesneler, kutular, vb.) gruplar arasında dengelenmiştir.

AAV üretimi. AAV2.1-CaMKII-Cre, Penn Vector Core'dan satın alındı ​​(titre: 1.81 × 1013 GC/ml). AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5 için, vahşi tip HDAC3'ü hipokampal cDNA'dan amplifiye ettik ve ürünü, CMV promotörü ve -globin intronunun kontrolü altında modifiye edilmiş bir pAAV-IRES-hrGFP'ye (Agilent) klonladık. 3x-FLAG etiketi, IRES elemanı ve hrGFP vektörden çıkarıldı ve HDAC3'e (plazmit MW91) bir C-terminal füzyonuna izin veren bir V5 etiketi ile değiştirildi. Nokta mutasyonunu yaratmak için, nükleotidleri, amino asit 298'de (plazmit MW92) tirozin yerine bir histidin kalıntısını kodlayacak şekilde değiştirdik. Boş vektör kontrolü için, HDAC3 kodlama dizisi mevcut değildi, ancak diğer tüm elementler kaldı (plazmit MW87). AAV, Penn Vector Core ile yapıldı ve son titreler qPCR ile belirlendi (AAV-HDAC3(Y298H): 6.48 x 1012 GC/ml; AAV-EV: 1.35 x 1013 GC/ml).

Lentivirüs üretimi. CRISPR/dCas9 Sinerjistik Aktivasyon Aracısı (SAM) sistemi için, dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) ve MS2- için lentiviral plazmitler Addgene'den satın alındı. P65-HSF1_Higro (#61426-LVC) yapıları (titreler 8× 106 TU/ml'den büyük veya eşit). Per1 sgRNA için, Per1 promotöründeki (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) CRE elementine karşılık gelen bir antisens kılavuz dizisini klonladık ve Addgene sgRNA(MS2) klonlama omurgasına (#61427) yerleştirdik. Kontrol sgRNA, plazmide hiçbir kılavuz sekansın klonlanmaması dışında özdeşti. Hem Per1 sgRNA (titre: 6.8 x 107 IFU/ml) hem de kontrol sgRNA (3.5 x 107 IFU/ml) için lentivirüsler, USC Eczacılık Okulu Lentiviral Laboratuvarı tarafından üretildi.

pLVX-V5Per1 aşırı ekspresyon yapısı için, Addgene pCMV-Sport2-mPer1 plazmidinden (#16203) tam uzunlukta vahşi tip Per1'i büyüttük ve ürünü değiştirilmiş bir pLVX-EF1 -IRES-mCherry'ye klonladık omurga (Takara, #631987). IRES ve mCherry elemanları çıkarıldı ve bir V5 etiketi ile değiştirildi, bu da PER1'e (plazmit MW206) bir N-terminal füzyonuna izin verdi. Boş vektör (EV) kontrolü için, PER1 kodlama dizisi mevcut değildi ama diğer tüm elementler kaldı (Plasmid MW93). pLVX-v5Per1 (titre: 1.3 x 108 IFU/ml) ve pLVX-EV (titre: 1.5 x 108 IFU/ml) için lentivirüsler, USC Eczacılık Okulu Lentiviral Laboratuvarı tarafından üretildi. Tüm lentiviral yapılar, EF1 promotörü altında ifade edildi.

pLVX-v5Per1 ve CRISPR-SAM'in Hücre Kültürü Doğrulaması. pLVX-v5Per1'in Per1 mRNA'nın aşırı ekspresyonunu ürettiğini doğrulamak için, fare HT22 hücreleri (Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031) Lipofectaine LTX (Invitrogen) kullanılarak pLVX-v5Per1 veya pLVX-EV (Şekil 5a) ile transfekte edildi. Benzer şekilde, CRISPR-SAM sisteminin Per1 transkripsiyonunu etkin bir şekilde sürdürebildiğini doğrulamak için, HT22 hücreleri dCas9-VP64 (lenti MS2-P65_HSF1_Blast ile transfekte edildi) Feng Zhang Addgene plazmid #61425), MS2-P65-HSF1 (lenti dCAS-VP64_Blast, Feng Zhang'dan bir hediyeydi, Addgene plazmid #61426) ve ya Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) veya hedefleme yapmayan kontrol sgRNA (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2)_zeo omurgası, Lipofectamine LTX (Invitrogen) kullanılarak Feng Zhang, Addgene plazmid #61427) tarafından hediye edildi. Hücreler 24 veya 48 saat sonra toplandı, parçalandı ve mRNA yukarıda tarif edildiği gibi izole edildi. qRT-PCR, Tablo S4'te listelenen Per1, Per2 ve Hes7 primerleri ve prob kullanılarak yukarıda tarif edildiği gibi yapıldı.

siRNA. Per1 yıkım deneyi için, Per1'i hedefleyen Accell SMARTpool küçük enterferans yapan RNA'lar (siRNA'lar; Dharmacon, GE), ddH20 içinde nihai toplam 10 uM konsantrasyona seyreltildi ve DH'ye (1.0 ul/yan) infüze edildi. Accell hedeflemeyen havuz siRNA kontrol olarak kullanıldı (toplam konsantrasyon, 10 uM) ve aynı şekilde infüze edildi. siRNA deneyleri için, fareler yukarıda tarif edildiği gibi ele alındı ​​ve alıştırıldı ve alışmanın son gününden sonraki gün ameliyat yapıldı. Farelere ameliyattan sonra tam gün iyileşme süresi verildi ve ertesi gün (ameliyattan yaklaşık 48 saat sonra) maksimum hedef yıkımını sağlamak için eğitildi. Devrilmeyi sağlamak için, testten ~1 saat sonra fareler kurban edildi ve dorsal hipokampustan alınan yumruklar, PER1 proteininin yıkılmasını sağlamak için western blot'larla işlendi.

Nesne konumu ve nesne tanımahafızagörevler. Nesne konumu ve nesne tanıma belleği görevleri için, fareler 4 gün boyunca 2 dakika/gün süreyle işlendi ve daha sonra nesnelerin yokluğunda art arda altı gün boyunca 5 dakika/gün bağlamına alıştırıldı. Eğitim sırasında, fareler iki özdeş nesneye (100 ml'lik beherler, baharat kutuları veya cam mumluklar) maruz bırakıldı ve 10 dakika boyunca keşfetmelerine izin verildi. Kalıcılık testi sırasında (uzun süreli olarak 24 saat sonra)hafızaveya kısa süreli hafıza için 60 m sonra), farelerin 5 dakika boyunca keşfetmesine izin verildi. Nesne konumu içinhafıza, iki tanıdık nesneden biri yeni bir yere taşındı. Nesne tanıma içinhafıza, nesne konumları sabit kaldı, ancak nesnelerden biri yeni bir öğeyle değiştirildi. Nesne tanıma belleği alışkanlığı, OLM testinin tamamlanmasından en az bir hafta sonra başladı ve yeni bir bağlam ve tanıdık olmayan nesneler kullanıldı48. Keşif, fare kafası nesneye yöneldiğinde ve 1 cm içinde geldiğinde veya burun nesneye dokunduğunda puanlandı. Toplam keşif süresi kaydedildi (t) ve yeni madde tercihi bir ayrım indeksi olarak ifade edildi (DI=(tyeni -tfamiliar) / (yeni roman artı tfamiliar) x yüzde 100). Eğitim oturumları için, testte hareket ettirilmek üzere belirlenen nesne, eğitim ve test DI'sinin doğrudan karşılaştırılmasına izin vermek için yeni nesne olarak kullanıldı. Test sırasında 2 saniyeden veya eğitim sırasında 3 saniyeden daha kısa bir süre boyunca her iki nesneyi de araştıran fareler, daha sonraki analizlerden çıkarıldı. Eğitim sırasında bir nesneyi tercih eden (DI > ±20) fareler de çıkarıldı. Alışma seansları (kat edilen mesafeyi ve hızı belirlemek için) ANY-labirent davranışsal analiz yazılımı (Stoelting Co) kullanılarak analiz edildi. Tüm alışkanlık, eğitim, test ve puanlama, deney gruplarına kör olan deneyciler tarafından yapıldı.

Bağlam korkusu koşullandırma. Bağlamsal korku koşullandırma için, fareler ilk olarak 5 gün boyunca ele alındı. Edinme sırasında, fareler 2 dakika ve 28 saniye boyunca bağlama maruz bırakıldı, ardından 2 saniyelik (0.75 mA) bir şok, tipik olarak sağlam uzun vadeli bellek12,20 üreten bir protokol. Fareler, çıkarılmadan önce 30 saniye daha bağlamda kaldı. Fareler, eğitimden 60 m sonra, ele alınan ancak eğitilmemiş ev kafes kontrolleri ile birlikte kurban edildi. Donma davranışı Ethovision 11 yazılımı (Noldus)12 kullanılarak ölçülmüştür.

Yükseltilmiş artı labirent. Artı labirent, deney gruplarına kör bir deneyci tarafından yapıldı. ORM'nin tamamlanmasından bir hafta sonra, artı labirentte bir fare alt kümesi test edildi. Labirentin iki kolu açıktı (30 × 5 cm) ve iki kol kapalıydı (30 × 5 × 15 cm), merkezi bir platform (5 × 5 cm) ile birbirine bağlandı. Labirent yerden 40 cm yüksekteydi. Fareler, her farenin açık kollardan birine bakan merkezi platform üzerine yerleştirilmesinden oluşan aparat üzerinde 5 dakika boyunca test edildi. Denekler arasında labirent yüzde 70 etanol ile temizlendi. Kapalı ve açık kollarda geçirilen zamanın yüzdesi, ANY-labirent yazılımı kullanılarak puanlandı.

Sirkadiyen ritim analizi. Genç ({0}}ay) ve yaşlanan (18-ay) HDAC3 plus / plus ve HDAC3flox/flox fareleri, 12 saatlik aydınlık/karanlık (LD) döngüsü altında yetiştirildi ve barındırıldı. AAV-CaMKII-Cre infüzyonundan iki hafta sonra (yukarıda tarif edilmiştir), fareler 7 gün boyunca izole edilmiş 12 saatlik bir LD alıştırma odasına transfer edildi. Fareler daha sonra ışıktan korunan bir aktivite analiz odasına transfer edildi, burada lokomotor aktivite optik ışın hareket dedektörleri (Philips Respironics) kullanılarak analiz edildi. Aktivite, fareler ilave 3 hafta boyunca sabit karanlığa (DD) geçirilmeden önce ışıktan korunan odada 2 haftalık LD döngüsü sürüklenmesi sırasında izlendi. DH'deki HDAC3 silme işleminin endojen sirkadiyen ritimleri etkileyip etkilemediğini belirlemek için DD aşaması boyunca aktivite izleme devam etti. Veriler Minimitter VitalView 5.0 kullanılarak toplandı ve serbest aktivitenin başlangıcını belirlemek için Clocklab yazılımı (Actimetrics) kullanıldı. Tau değerleri, bu başlangıcın eğimi elde edilerek ve Clocklab yazılımı 49,50 ile uygun en küçük kareler hesaplanarak hesaplanmıştır.

İmmünohistokimya. Davranışın tamamlanmasından sonra, farelere servikal dislokasyon ile ötenazi uygulandı ve beyinleri çıkarıldı ve buz gibi izopentan içinde ani donduruldu. Dorsal kalça kampüsü boyunca yirmi mikrometrelik dilimler toplandı, slaytlar üzerinde çözdürüldü ve -80 derecede saklandı. Slaytlar yüzde 4 paraformaldehit (10-dak) ile sabitlendi, 0 içinde geçirgen hale getirildi.0%1 Triton X-100 0.1 M PBS (5-dak) içinde ve yüzde 8 normal keçi serumu (Jackson) ile 1 saat bloke edildi. Slaytlar, HDAC3'e (1:250, Abcam, klon Y415, ab32369) veya V5'e (1:1000, Abcam, ab9116) yönelik tavşan antikorunda veya GFP'ye (1:250, Aves Labs, #GFP1010). Ertesi gün, slaytlar yıkandı ve keçi anti-tavşan Alexa 488 (HDAC3 ve V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) veya keçi anti-tavuk Alexa 488 (GFP) ile oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edildi. ; 1:1000, ThermoFisher, #A-11039) karanlıkta. Slaytlar daha sonra PBST ile yıkandı ve bir floresan nissl boyası olan NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, #N21482) içinde 50 m süreyle inkübe edildi. Spesifik olmayan otofloresansı51 söndürmek için, dilimler daha sonra yüzde 0.01 Triton ile PBS içinde yıkandı, su içinde durulandı ve 50 mM amonyum asetat tamponu içinde 10 mM CuS04 içinde 10-dakika süreyle inkübe edildi. Dilimler tekrar suda durulandı, PBS içinde yıkandı ve VectaShield Antifade montaj ortamı (Vector Laboratories) ile kapatıldı.

Tüm görüntüler, VS110 tarayıcı yazılımı ile 20x apokromatik objektife (sayısal açıklık 0.75) sahip bir Olympus Scanner VS110 ile elde edildi. Tüm tedavi grupları, her slaytta temsil edildi ve bir slayttaki tüm görüntüler, doygun olmayan koşullar altında aynı maruz kalma süresiyle yakalandı. İmmün etiketleme yoğunluğu, CA1'deki hücre katmanının optik yoğunluğunu örnekleyerek ve aynı görüntüde bir arka plan floresan örneği çıkararak ImageJ ile nicelleştirildi. Tüm AAV deneyleri için, dorsal hipokampüsün CA1 alanında virüsü ifade edemeyen hayvanlar analizlerin dışında bırakıldı. Görüntüleme ve miktar tayini, deneysel koşullara kör olan deneyciler tarafından yapıldı.

Batı lekesi. PER1 yıkımını doğrulamak için, Per1 siRNA ve kontrol siRNA fareleri, testten 2 saat sonra feda edildi ve beyinler hızlı bir şekilde donduruldu. Beyinler koronal olarak kesildi ve 500 μm'lik dilimlerden 1 mm DH yumrukları toplandı. Zımbalar, bir Dounce homojenleştirici kullanılarak Halt proteaz ve fosfataz inhibitörü (Thermo Fisher) ile T-PER tamponu (Thermo Fisher) içinde homojenleştirildi. Protein lizatları, modifiye edilmiş bir Bradford tahlili (BioRad) kullanılarak ölçüldü ve 50 ug toplam protein lizatı, yüzde 7,5'lik bir NuPAGE Bis-Tris jelin (Thermo Fisher) her şeridine yüklendi. Jeller 50 dakika boyunca 200 voltta çalıştırıldı ve lekeler gece boyunca 4 derecede 15 V'ta nitroselüloz membranlar üzerine aktarıldı (Novexi, LC2001). Ertesi gün, membranlar blokaj tamponunda 1 saat süreyle inkübe edildi (yüzde 0.01 Tween 20 ile Tris tamponlu salin içinde yüzde 5 yağsız süt), yıkandı (TBS içinde yüzde 0.1 Tween 20) ve daha sonra birincil antikor (1:500, tavşan anti-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) primer antikor tamponunda (TBS içinde yüzde 0,1 Tween ile yüzde 3 BSA) 4 derecede gece boyunca. Zarlar daha sonra yıkandı ve tavşana karşı HRP-konjuge fare antikorunda (1:10,000, Jackson Laboratories, hafif zincire özgü, #211-032-171) 1 saat süreyle inkübe edildi. Zarlar, Pierce SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, 34077) kullanılarak yıkandı ve geliştirildi. Doğrusallığı doğrulamak için çoklu film pozları kullanıldı. Blotlar, 10 m boyunca Restore Western Blot Sıyırma Tamponu (Thermo Fisher #21059) ile yıkandı ve sıyrıldı, tekrar yıkandı ve daha sonra GAPDH'ye (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778) bir tavşan antikoruyla gece boyunca (4 derece) yeniden problandı. ). Tam uzunluktaki PER1 ve GAPDH lekeleri Ek Şekil 5'te gösterilmiştir. Göreceli optik yoğunluklar, deneysel koşullara kör bir deneyci tarafından ImageJ (ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri) kullanılarak taranan filmden hesaplanmıştır. Tüm değerler GAPDH ekspresyon seviyelerine normalleştirildi.

qRT-PCR. Doku, DH zımbalarından (yukarıda tarif edilmiştir) toplandı ve işlenene kadar -80 derecede donduruldu. RNA, bir RNeasy Minikit (Qiagen, #74104) kullanılarak izole edildi ve cDNA, Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kiti (Roche, 04379012001) kullanılarak oluşturuldu. Primerler ve problar, Roche Universal ProbeLibrary'den (Tablo S4) türetilmiştir ve Roche Light-Cycle 480 II makinesinde (Roche) çoğullama için kullanılmıştır. Tüm değerler Gapdh'ye normalleştirildi. Analizler ve istatistikler, Roche'un tescilli algoritmaları ve Pfaffl yöntemine dayalı REST 2009 yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 analizimize dahil edildi. Her grup için cDNA kitaplıkları TruSeq RNA Numune Hazırlama Kılavuzuna (Illumina) göre hazırlandı. Her fareden iki yüz elli nanogram toplam RNA, poli-T oligo-bağlı manyetik boncuklarla saflaştırıldı ve ısıyla parçalandı. Birinci ve ikinci zincir cDNA daha sonra sentezlendi ve saflaştırıldı. Uçlar körleştirildikten sonra, adaptör ligasyonu sırasında şablonun birleşmesini önlemek için 3' uç adenile edildi. Her grup için cDNA'nın uçlarına benzersiz bir adaptör seti eklendi ve kütüphaneler PCR ile büyütüldü. Kütüphanenin kalitesi Bioanalyzer tarafından değerlendirildi ve ticari bir dizileme kütüphanesinden (Illumina) hazırlanan standart bir eğri ile qRT-PCR kullanılarak nicelendirildi. Örnekler, sıralayıcının her bir akış hücresinde temsil edilen her davranış grubu ile çoğullandı. Her kitaplıktan 10 nM, dört multipleks kitaplıkta toplandı ve California Üniversitesi, Irvine'deki Genomik Yüksek Verimli Tesis tarafından yürütülen tek okumalı 50 bp'lik bir sıralama sırasında bir Illumina HiSeq 2500 cihazında sıralandı. Her kitaplık için elde edilen sıralama verileri, FastQ dosyaları üretmek için sonradan işlendi. Daha sonra veriler, Illumina CASAVA 1.8.2 yazılımının yanı sıra şirket içi yazılım kullanılarak demultiplekslendi ve filtrelendi. Düşük kaliteli okumalar (Illumina'nın standart kalite testlerinde başarısız oldu) ve PhiX kontrol genomuna başarıyla hizalanan kontrol okumaları analizlerden çıkarıldı. Kalan dizilerin kalitesi, dizileme çalışmasının temel çağırma adımı sırasında gerçek zamanlı olarak üretilen PHRED kalite puanları kullanılarak ayrıca değerlendirildi (Ek Şekil 3a).

Referans genom ve transkriptom ile hizalama. Her deneyden elde edilen okumalar, kısa okuma hizalayıcıları ELAND v2e (Illumina) ve Bowtie24 kullanılarak referans genom ve karşılık gelen transkriptom ile ayrı ayrı hizalandı. Her iki araç tarafından bilinen ekzonlara veya okumanın herhangi bir 25 bp fragmanında ikiden fazla uyumsuzlukla bağlantı bağlantılarına benzersiz bir şekilde hizalanan okumalar, transkriptom içine dahil edildi. Okumalar benzersiz bir şekilde hizalanmış, ancak okumanın herhangi bir 25 bp parçasında ikiden fazla uyumsuzluk olduğu için analizlerden çıkarıldı. Benzer şekilde, referans genomdaki çeşitli konumlarla eşleşen okumalar analizden çıkarıldı. Bu protokolü kullanarak referans genomuna ve transkriptoma atanan okuma yüzdesi, her bir replikat grubu için rapor edilir (Ek Şekil 3b). Bu, numune başına ortalama yaklaşık 30 milyon okuma ile sonuçlandı.

Lentiviral infüzyonu takiben pLVX ve CRISPR-SAM plazmitlerinin varlığını doğrulamak için, davranışı takiben grup başına üç hayvandan oluşan bir alt kümeden hipokampal numuneler üzerinde RNA dizilimi yaptık. Lentivirüslerle in vivo enfekte olmuş hücrelerin sayısı, RT-qPCR kullanılarak uygun transkriptlerin varlığını güvenilir bir şekilde tespit etmek için çok küçük olduğundan (Ek Şekil 6a, d), varlığı tespit etmek için daha hassas bir yöntem olarak RNA-seq kullandık. bu transkriptlerden. Sırasıyla orijinal mm10 fare genomuna ve mm10 fare genom açıklamasına plazmit yapılarının dizileri ve açıklamaları eklenerek genom montajı ve genom açıklamasının güncellenmiş bir versiyonu oluşturulmuştur. Tuxedo Suite54'teki okuma hizalama aracı TopHat kullanılarak, okumalar genomla eşlendi ve yalnızca endojen fare referans genomu ile karşılaştırıldığında plazmit transkriptlerine özgü olan isabetler, plazmit yapılarına "eşleştirilmiş okumalar" olarak kabul edildi. Eşleşen okumaların sayısı daha sonra her örnek için her yapı için nicelleştirildi.

Gen ifadesi ve diferansiyel analiz. Gen ekspresyon seviyeleri, her replikat için okuma hizalama sonuçlarından doğrudan hesaplandı. Standart RPKM değerleri55, ekson modelinin kilobaz başına okuma sayısı, milyon haritalanmış okuma başına), dizileme verilerinin kapsadığı her bir gen ve bu çalışmada kullanılan her bir kopya için çıkarıldı.

Diferansiyel transkripsiyonel analizler, OLM'den sonra yukarı veya aşağı regüle edilen genleri tanımlamak için her bir grup çiftinde (eğitimden sonra ana kafese karşı 60 m) Cyber ​​T56,57 kullanılarak yapıldı. Mevcut çalışma için eğitilen 18-aylık HDAC3 plus / plus ve HDAC3flox/flox farelerine ek olarak, {{10}}aylık C57 vahşi tip farelerden alınan RNA dizileme verileri aynı şekilde işlendi ( homecage ve OLM tarafından mevcut çalışma ile aynı şekilde eğitilmiştir) diferansiyel analizler için önceki bir çalışmadan20 kullanılmıştır. Her grup için hayvan sayısı (biyolojik kopyalar): Genç HDAC artı / artı HC: 6, Genç HDAC3 artı / artı OLM: 6, Eski HDAC3 artı / artı HC: 6, Eski HDAC3 artı / artı OLM: 6, Eski HDAC3flox/flox HC: 8, Eski HDAC3flox/flox OLM: 8. Teknik kopyalar kullanılmamıştır. Diferansiyel ifadeyi belirlemek için kullanılan p-değeri eşiği, tüm gruplar için 0,05'tir. Benjamini & Hochberg (BH) q değeri ile ölçülen Yanlış Keşif Oranı (FDR), 0.15'lik bir FDR eşiği ile çoklu testleri düzeltmek için kullanıldı. Bu 3 grup (genç vahşi tip, yaşlanan HDAC artı / artı veya yaşlanan HDAC3flox/flox) için deneyimden sonra (ev kafesine kıyasla) yukarı regüle edilen gen setleri, iki veya daha fazla grup için ortak olan genleri belirlemek için kesişti. Dokuya özgü ifade, Gen Ontolojisi terimleri58 ve KEGG yolları59,60 için her grubun zenginleştirilmesi, davranıştan sonra farklı şekilde ifade edilen genlere dayalı olarak DAVID61 kullanılarak değerlendirildi. Python için "matplotlib" ve R için "ggplot" kullanılarak veri görselleştirme yapıldı.

Kromatin immünopresipitasyon. ChIP, Millipore ChIP kit11,12,62'den alınan protokole dayalı olarak DH zımbalarında gerçekleştirildi. Doku yüzde 1 formaldehit (Sigma) ile çapraz bağlandı, parçalandı ve sonike edildi ve kromatin gece boyunca 2 ul anti-H4K8Ac (Millipore #17-10099) veya 4 ul anti- HDAC3 (Millipore #{{) ile immüno-çökeltildi. 13}}) veya eşdeğer miktarda Normal Tavşan Serumu (H4K8Ac negatif kontrol, Millipore) veya anti-fare IgG (HDAC3 negatif kontrol, Millipore). Yıkamadan sonra, kromatin boncuklardan ayrıştırıldı ve DNA'nın kolon saflaştırılmasından önce proteinaz K varlığında ters çapraz bağlandı. Her bir genin promotörleri için primer dizileri, Primer 3 programı tarafından tasarlandı (Tablo S4). Her hayvandan beş ul girdi, anti-H4K8Ac IgG/anti-HDAC3 IgG veya anti-tavşan/fare IgG immünopresipitasyon iki kopya halinde incelendi. ChIP-qPCR verilerini normalleştirmek için yüzde giriş yöntemini kullandık. Girdi örneği yüzde 100'e ayarlandı ve hem IP hem de IgG örnekleri, 100*AE^(ayarlanmış girdi – Ct(IP)) formülü kullanılarak bu girdinin yüzdesi olarak hesaplandı. Katlama zenginleştirme daha sonra ChIP'nin ortalama IgG'ye oranı olarak hesaplandı. Bir plaka içi standart eğri, amplifikasyon verimliliğini (AE) belirledi.

Dilim hazırlama ve kaydetme. Genç (yaklaşık 3-ay) ve yaşlanan (18-ay) farelere virüs stereotaksik olarak aşılandı. İlk deney için, genç ve yaşlı HDAC3 plus / plus ve HDAC3flox/flox fareleri DH'ye iki taraflı olarak AAV-CaMKII-Cre ile aşılandı. İkinci deney için, genç ve yaşlı vahşi tip C57 fareleri, bir yarımkürenin DH'sine AAV-HDAC3(Y298H) ve diğer yarımküreye AAV-EV kontrolü aşılandı. İnfüzyondan iki hafta sonra (optimum virüs ekspresyonuna izin vermek için)2, enine hipokampal dilimler (320 um), önceden ısıtılmış (31 ± 1 derece) yapay beyin omurilik sıvısı (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM) ile bir arayüz kayıt odasına yerleştirildi. KH2P04, 1.5 mM MgS04, 2.5 mM CaCl2, 26 mM NaHC03 ve 10 mM D-glukoz). Dilimlerin yüzeyi sıcak, nemlendirilmiş yüzde 95 O2/5 yüzde CO2'ye maruz bırakılırken dilimler dakikada 1.75–2 ml hızında sürekli olarak perfüze edildi. Kayıtlar en az 2 saatlik inkübasyondan sonra başladı.

Alan uyarıcı postsinaptik potansiyeller (fEPSP'ler), 2 M NaCl ile doldurulmuş tek bir cam pipet (2-3MΩ) kullanılarak CA1b stratum radiatum'dan kaydedildi. Stimülasyon darbeleri (0.05 Hz), CA1c'ye yerleştirilmiş iki kutuplu bir uyarıcı elektrot (bükülmüş nikrom tel, 65 um) kullanılarak Schaffer tamamlayıcı-komiser projeksiyonlarına iletildi. Akım yoğunluğu, maksimum fEPSP yanıtının yüzde 50'sini elde edecek şekilde ayarlandı. Stabil bir temel oluşturulduktan sonra, LTP, her patlamanın (100 Hz'de dört darbe) 200 ms aralıklarla (yani, teta frekansında) iletildiği beş teta patlamasından oluşan tek bir dizi ile indüklendi. Stimülasyon yoğunluğu TBS sırasında artmadı. Veriler NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Theta Burst) ile toplanmış ve sayısallaştırılmıştır.

İstatistiksel analiz. İstatistiksel analizler metin ve şekil açıklamalarında belirtildiği gibi Prism 6 (GraphPad) kullanılarak yapılmıştır. Analitik yaklaşımlarımız, daha önce yayınlanmış çalışmaya dayanmaktadır12,20,63,64. Örnek boyutlarını önceden belirlemek için hiçbir istatistiksel yöntem kullanılmamıştır, ancak örneklem boyutlarımız, önceki yayınlarda bildirilenler de dahil olmak üzere, alanda genel olarak kullanılanlara benzer12,20,64,65. Veri dağılımının normal olduğu varsayıldı ve gruplar arasında benzer varyans gözlemlendi, ancak bu resmi olarak test edilmedi. Bir deneyde karşılaştırılacak iki grup olduğunda, iki kuyruklu Student t testleri kullanıldı. İki faktör karşılaştırıldığında (yaş ve genotip veya seans ve grup gibi), veriler iki yönlü ANOVA'lar ve ardından Sidak'ın çoklu karşılaştırmalar sonrası hoc testleri ile analiz edildi. Tüm analizler iki uçludur ve anlamlılık için 0,05 değeri gereklidir. Tüm şekillerdeki hata çubukları SEM'i temsil eder. Tüm deneyler için grup ortalamasından ± 2SD değerler aykırı olarak kabul edildi ve analizlerden çıkarıldı.

Veri kullanılabilirliği. Bu çalışmanın bulgularını destekleyen veriler, makul talep üzerine ilgili yazardan temin edilebilir. RNA dizileme verileri, NCBI'nin Gene Expression Omnibus'unda depolanmıştır ve GEO Serisi erişim numarası GSE94832'den erişilebilir.

Referanslar

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Suprakiazmatik çekirdek ve hipokampustaki epigenetik değişiklikler yaşa bağlı bilişsel gerilemeye katkıda bulunur. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC Sirkadiyen ritimler ve hafıza oluşumu. Nat. Rev. Neurosci. 11, 577–588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL ve ark. Hipokampal MAPK aktivitesinin sirkadiyen salınımı ve cAmp: hafıza kalıcılığı için çıkarımlar. Nat. Nörobilim. 11, 1074-1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS Korku koşullu farelerde öğrenme ve hafızanın sirkadiyen modülasyonu. Davran. Beyin Araş. 133, 95-108 (2002).

5. Kondratova, AA & Kondratov, RV Yaşlanan beynin sirkadiyen saati ve patolojisi. Nat. Rev. Neurosci. 13, 325–335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH Period1, CREB kinaz pP90RSK'nin nükleer mekikliğini düzenleyerek fare hipokampüsündeki bellekle ilgili sinyalleşmenin sirkadiyen modülasyonunu sağlar. J. Neurochem. 138, 731–745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA & Sweatt, JD Yaşlanmayla ilişkili bilişsel işlev bozukluğunun epigenetik bir hipotezi. Ön Yaşlanma Neurosci. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. ve diğerleri. Değişen histon asetilasyonu, farelerde yaşa bağlı hafıza bozukluğu ile ilişkilidir. Bilim 328, 753–756 (2010).

9. Snigdha, S. ve ark. H3K9me3 inhibisyonu hafızayı geliştirir, omurga oluşumunu destekler ve yaşlı hipokampusta BDNF seviyelerini arttırır. J. Neurosci. 36, 3611–3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, Halkla İlişkiler Bilişsel yaşlanmaya epigenetik katkılar: karmaşık zihin ve yaşam süresi. Mem öğrenin. 21, 569-574 (2014).

11. Malvaez, M. ve diğerleri. HDAC3-seçici inhibitör, kokain arama davranışının yok olmasını kalıcı bir şekilde artırır. Proc. Natl Acad. bilim ABD 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL ve ark. Bağlam ve işitsel korku, amigdalanın lateral ve bazal alt çekirdeklerindeki HDAC3 aktivitesi tarafından farklı şekilde düzenlenir. Nöropsikofarmakoloji 42, 1284– 1294 (2017).

13. McQuown, SC ve diğerleri. HDAC3, uzun süreli bellek oluşumunun kritik bir negatif düzenleyicisidir. J. Neurosci. 31, 764-774 (2011).

14. Bieszczad, KM ve ark. RGFP966 yoluyla histon deasetilaz inhibisyonu, duyusal kortikal plastisite ve bellek oluşumunun özgüllüğü üzerindeki frenleri serbest bırakır.J. Nörobilim. 35, 13124-13132 (2015).

15. Lahm, A. ve ark. Omurgalı sınıfı IIa histon deasetilazların gizli katalitik aktivitesinin çözülmesi. Proc. Natl Acad. bilim ABD 104, 17335–17340 (2007).

16. Sun, Z. ve ark. HDAC3'ün transkripsiyon ve metabolizmadaki deasetilazdan bağımsız işlevi, nükleer reseptör koruyucusu gerektirir. Mol. Hücre 52, 769-782(2013).

17. Alaghband, Y. ve diğerleri. HDAC3'ün hipokampustaki deasetilaz alanı ve hafızanın oluşumu ve yok edilmesinde medial prefrontal korteks için farklı roller. Nörobiyol. Öğrenmek. Mem. 145, 94-104 (2017).

18. Nott, A. ve ark. Histon deasetilaz 3, FOXO ve sosyal davranışı düzenlemek için MeCP2 ile birleşir. Nat. Nörobilim. 19, 1497-1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR Histon deasetilaz 3, uygun beyin gelişimi için gereklidir. J. Biol. Kimya 289, 34569–34582(2014).

20. Vogel-Ciernia, A. ve ark. Nörona özgü kromatin düzenleyici alt birim BAF53b, sinaptik plastisite ve hafıza için gereklidir. Nat. Nörobilim. 16, 552–561 (2013).

21. Alberini, CM Uzun süreli bellek ve sinaptik plastisitede transkripsiyon faktörleri. Fizyol. Rev. 89, 121–145 (2009).

22. Barnes, CA Uzun süreli güçlenme ve yaşlanan beyin. Philos. Trans. R. Soc. Londra. B 358, 765-772 (2003).

23. Speir, ML ve ark. UCSC Genom Tarayıcı veritabanı: 2016 güncellemesi. Nükleik Asitler Araş. 44, D717–D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Kısa DNA dizilerinin insan genomuna ultra hızlı ve hafıza açısından verimli hizalanması. Genom Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB ve diğerleri. Hipokampal ekspresyon analizleri, yaşlı sıçanlarda ani-erken, nöroenerjetik ve miyelinojenik yolların bilişsel bozulma ile seçici ilişkisini ortaya koymaktadır. J. Neurosci. 27, 3098-3110 (2007).

26. McNulty, SE ve ark. Nr4a1 ve Nr4a2 için nesne konumu ve nesne tanıma uzun süreli bellekte farklı roller. Mem öğrenin. 19, 588–592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Farelerde uyku yoksunluğu ve yaşlanmanın uzun süreli ve uzak bellek üzerindeki etkileri. Mem öğrenin. 22, 197–202 (2015).

28. Rawashdeh, O. et al. PERIOD1, hipokampal ritimleri ve bellek işlemeyi gündüz ile koordine eder. Hipokampus 24, 712-723 (2014).

29. Jilg, A. ve ark. Fare hipokampal saat gen ekspresyonunun zamansal dinamikleri, bellek işlemeyi destekler. Hipokampus 20, 377-388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL Hipokampus içindeki sirkadiyen salınımlar, hafıza oluşumunu ve kalıcılığı destekler. Ön Mol. Nörobilim. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK & McGaugh, JL Uzamsal öğrenmeden sonra sıçan hipokampüsünde deneyime bağlı gen ekspresyonu: Ani-erken genler Arc, c-fos ve zif268'in karşılaştırılması. J. Neurosci. 21, 5089–5098 (2001).

32. Kouzarides, T. Kromatin modifikasyonları ve işlevleri. Hücre 128, 693-705(2007).

33. Konermann, S. et al. Tasarlanmış bir CRISPR-Cas9 kompleksi tarafından genom ölçeğinde transkripsiyonel aktivasyon. Doğa 517, 583–588 (2015).

34. Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. Histon deasetilaz 3 inhibisyonu, nükleer faktör kappa B. Sci'nin aktivasyonu yoluyla yaşlanmada sinaptik etiketlemeyi ve yakalamayı yeniden kurar. 5, 16616 (2015).

35. Kramar, EA ve ark. Aralıklı öğrenmenin etkinliği için sinaptik kanıt. Proc. Natl Acad. bilim ABD 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM ve diğerleri. CBP'nin hipokampal fokal nakavt edilmesi, belirli histon modifikasyonlarını, uzun süreli güçlenmeyi ve uzun süreli belleği etkiler. Nöropsikofarmakoloji 36, 1545– 1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL Histon deasetilaz 3'ün seçici inhibisyonu tarafından indüklenen medial-perforan yol-dentat granül hücre sinapslarında artan uzun süreli güçlenme, Fragile X zeka geriliği proteini gerektirir. Nörobiyol. Öğrenmek. Mem. 114, 193– 197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB ve bellek. Annu. Rev. Neurosci. 21, 127-148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. CREB'nin belleğin oluşumunda ve geliştirilmesinde pozitif düzenleyici olarak işlevsel rolleri. Beyin Araş. Boğa. 105, 17–24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD & Reines, D. Kırılgan X RNA bağlayıcı proteini kodlayan gen, nükleer solunum faktörü 2 ve CREB transkripsiyon faktörleri ailesi tarafından kontrol edilir. Nükleik Asitler Araş. 34, 1205–1215 (2006).

41. Wang, H. ve diğerleri. CREB'nin, singulat kortekste grup I metabotropik glutamat reseptörleri tarafından FMRP'nin düzenlenmesindeki rolleri. Mol. Beyin 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monaco, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Period1 geninde hedeflenen bir mutasyona sahip farelerde değişmiş davranış ritimleri ve saat geni ifadesi. EMBO J. 20, 3967–3974 (2001).

43. Halder, R. et al. Plastisite genlerindeki DNA metilasyon değişiklikleri, hafızanın oluşumuna ve korunmasına eşlik eder. Nat. Nörobilim. 19, 102–110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ & Sweatt, JD Hipokampusta deneyime bağlı epigenomik yeniden yapılanma. Mem öğrenin. 24, 278–288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. Bir saat geni, periyot, Drosophila'da uzun süreli hafıza oluşumunda önemli bir rol oynar. Proc. Natl Acad. bilim ABD 101, 16058– 16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. Kokain duyarlılığı ve ödülü, sirkadiyen genlerin ve ritmin etkisi altındadır. Proc. Natl Acad. bilim ABD 99, 9026–9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR Hipokampustaki MAP (mitojenle aktive olan protein) kinaz ve adenilil siklaz aktivitelerinin günlük salınımı, suprakiazmatik çekirdeğe bağlıdır. J. Neurosci. 31, 10640–10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Farelerde nesne konumu ve nesne tanıma belleğinin incelenmesi. Kör. Protokol Nörobilim. 69, 1–17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. et al. Ventromedial hipotalamustaki sirkadiyen saat, döngüsel enerji harcamasını kontrol eder. Hücre Metab. 23, 467-478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Farelerde sirkadiyen ritimleri fenotipleme. Kör. Protokol Fare Biol. 5, 271–281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Floresanla işaretlenmiş dokuda lipofuskin benzeri otofloresansın azaltılması. J. Histochem. sitokim. 47, 719-730 (1999).

52. Pfaff, MW Gerçek zamanlı RT-PCR'de bağıl niceleme için yeni bir matematiksel model. Nükleik Asitler Araş. 29, e45 (2001).

53. Pfaffl, MW, Horgan, GW & Dempfle, L. Gerçek zamanlı PCR'de nispi ekspresyon sonuçlarının grup bazında karşılaştırması ve istatistiksel analizi için rölatif ekspresyon yazılım aracı (REST). Nükleik Asitler Araş. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. et al. TopHat ve Cuffinks ile RNA-seq deneylerinin diferansiyel gen ve transkript ekspresyon analizi. Nat. Protokol 7, 562–578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Memeli transkriptomlarının RNA-Seq. Nat. Yöntem 5, 621–628 (2008).

56. Kayala, MA & Baldi, P. Cyber-T web sunucusu: yüksek verimli verilerin diferansiyel analizi. Nükleik Asitler Araş. 40, W553–W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD Mikrodizi ekspresyon verilerinin analizi için bir Bayes çerçevesi: düzenlileştirilmiş t-testi ve gen değişikliklerinin istatistiksel çıkarımları. Biyoinformatik 17, 509–519 (2001).