Bölüm 2|Üriner Eksfoliye Edilmiş Hücrelerde Glikojen Sentaz Kinaz 3b Hiperaktivitesi, Diyabetik Böbrek Hastalığının İlerlemesini Öngörüyor

1. bölüm için buraya tıklayın

Daha fazla bilgi için lütfen iletişime geçin:emily.li@wecistanche.com

TARTIŞMA

Amerika Birleşik Devletleri'nde ve diğer Batı ülkelerinde DKD, ilerleyici hastalıkların önde gelen etiyolojisi olmaya devam etmektedir.kronik böbrek hastalığıve henüz kesin bir tedavisi bulunmayan hazine ve sağlık hizmetleri sistemlerine ağır bir yük getirmektedir.5 Uzun zamandır diyabetli tüm hastaların DN geliştirmeyeceği kabul edilmiştir.5 Çalışılan kohorta bağlı olarak, DN'nin diyabetik hastaların yüzde 30 ila yüzde 50'sini etkiler. DKD geliştirme riski taşıyan diyabetik hastaları belirlemek için mevcut klinik uygulama tarafından benimsenen önlemler büyük ölçüde retinopati için göz muayeneleri ve albüminüri için idrar tahlili ile sınırlıdır.5 Bununla birlikte, birleşen epidemiyolojik kanıtlar, ekstrarenal mikro vaskülopati veya albüminürinin sonraki progresyonla önemli ölçüde uyumsuz olduğunu göstermektedir. DKD.12,13,26,27 Bu nedenle, DN riski taşıyan diyabetik hastaların kesin sınıflandırması için yeni bir biyobelirteç geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır. Bu çalışma, ilk kez, GSK3b'nin parankimde aşırı eksprese edildiğini ve hiperaktif olduğunu bildirmektedir.böbrekile ilişkili hem deneysel hem de klinik DN'deki hücrelerböbrek hastalığı ilerlemesi. Ayrıca, üriner pul pul dökülmüş hücrelerdeki GSK3b hiperaktivitesi, muhtemelen DN'nin ilerlemesini öngörebilir.

Cistanche tubulosa böbrek hastalığını önler, numuneyi almak için buraya tıklayın

Yüksek düzeyde korunmuş, redoksa duyarlı bir serin/treonin-protein kinaz olan GSK3b, insülin sinyallemesinde merkezi olarak yer alır ve ayrıca aşağıdakilerle ilgili patofizyolojik süreçler için çok önemli olan bir dizi başka hücresel sinyal yolunda yer alır.böbrekincinme, onarım ve rejenerasyon. Karaciğer ve iskelet kası gibi insüline duyarlı dokularda, GSK3b bazal koşullar altında aktiftir ve glikojen sentazın aktivitesini bastırır.19,28 İnsülin, GSK3b'yi serin 9'da inhibitör fosforilasyon yoluyla hızla etkisiz hale getirir ve glikojen biyosenteziyle sonuçlanır. Giderek artan kanıtlar, GSK3b düzensizliğinin tip 2 diabetes mellitus ile ilişkili olduğunu göstermektedir.19,29-31 Gerçekten de, diyabetik hastaların kaslarında31-33 ve obez diyabetik farelerin yağ dokularında GSK3b aşırı ekspresyonunu ve hiperaktivitesini gösteren veriler vardır.34 Ayrıca , farelerin iskelet kaslarında GSK3b'nin transgenik aşırı ekspresyonu bozulmuş glukoz toleransına, insülin direncine ve hiperinsülinemiye neden olur.29,35 Tersine, iskelet kaslarında GSK3b'si olmayan farelerde gelişmiş glukoz toleransı görülmüştür.36 Tutarlı bir şekilde, lityum gibi GSK3 inhibitörleri, hücre dizilerinde ve dokularda insülin etkisini taklit eder.37 Ayrıca, obez diyabetik farelerde, GSK3 inhibitörleri insülin duyarlılığını ve glukoz homeostazını iyileştirdi.38böbrekgeleneksel olarak insülin etkisinin hedef organı olarak kabul edilmemiştir. Bununla birlikte, son zamanlarda ikna edici kanıtlar, insülin sinyallemesininböbrekhücreler, özellikle podositlerde, glomerüler veböbrekhomeostaz.39–41 İnsülin eksikliği veya direnci nedeniyle podositlerdeki kusurlu insülin sinyali, DN'de gözlenen birçok patolojik lezyon için muhtemelen çok önemli bir başlatıcıdır. Ayrıca klinik çalışmalar, diyabeti olmayan normotansif hastalarda bile insülin direncinin albüminürinin başlangıcı ve ciddiyeti ile ilişkili olduğunu göstermiştir, bu da insülin direncinin başlı başına albüminüriye neden olabileceğini düşündürmektedir.42 Benzer şekilde, podosit spesifik insülin direncine sahip farelerde, glomerüler podositlerde insülin reseptörünün koşullu nakavtı, hiperglisemi veya diyabet olmamasına rağmen DN'yi tekrarlayan albüminüri ve glomerüler lezyonlar geliştirdi.41 Tersine, diyabetik hayvanlarda, insülin duyarlılaştırıcılar glisemik kontrolden bağımsız olarak DN'nin ilerlemesini yavaşlatabilir.43 Bu bulgular, insülin sinyallemesinin kan glukoz düzeylerinden bağımsız olarak podosit fonksiyonunu düzenlediğini göstermektedir. Bununla birlikte, insülin sinyal yolunun anahtar dönüştürücüsü olarak, GSK3b'nin DN'nin patogenezindeki ve ilerlemesindeki rolü büyük ölçüde anlaşılmamıştır.

İçindeböbrek, GSK3b ağırlıklı olarak podositlerde ve daha az ölçüde glomerulus20,21'deki mezanjiyal ve endotelyal hücrelerde eksprese edilir ve renal tübüler hücreler tarafından geniş ölçüde eksprese edilir. GSK3b'nin çoklu podosit topatik sinyal yollarını entegre ederek podosit otonom hasarına aracılık ettiğini gösteren bizim ve diğer gruplarımızdan veriler vardır.17,20,44,45 GSK3b'nin tutarsızlığı, genetik veya farmakolojik blokajı, podosit hasarına karşı koruma sağlayabilir ve hayvan modellerinde proteinüriyi azaltabilir diyabetik olmayan çeşitli glomerülopatiler.21 Ayrıca, ilerleyicikronikböbrekhastalık, GSK3b'nin renal tübüler ve interstisyel hasarın bir modülatörü olduğu bulundu. Bununla birlikte, GSK3b'nin DN'ye dahil olup olmadığı ve nasıl dahil olduğu belirsiz ve yoğun bir şekilde tartışmalı olmuştur, ancak bu çalışma, GSK3b aktivasyonunun DN'de arttığını göstermiştir.böbrekve üriner pul pul dökülmüş hücrelerde DKD'nin gelişimi veya ilerlemesi ile ilişkili olabilir. Örneğin, streptozotosin ile indüklenen diyabetli sıçanlarda, Lin ve ark.46, indirubin-30 -oksimde adenosin trifosfat-kompetitif inhibitör (20 Z,30 E)-6- Bromo tarafından GSK3b'nin inhibisyonunun ( BIO) proteinüriyi azalttı ve hipergliseminin düzeltilmesinin yokluğunda DN'nin glomerüler lezyonlarını iyileştirdi, bu da GSK3b'nin DN'de zararlı bir rol oynadığını düşündürdü. Ayrıca, streptozotosin ile indüklenen diyabetli sıçanlarda Paeng ve ark.22, BIO'yu kullanarak benzer bulgular elde etmiş ve diyabetik koşullar altında podositlerdeki artmış GSK3b aktivitesinin podosit apoptozu ve DN'de kayıp ile ilişkili olduğu sonucuna varmıştır. Bu, GSK3b'nin yüksek glikoz ortamına maruz kaldıktan sonra podosit farklılaşmasına ve yaralanmaya aracılık ettiği bulunan başka bir in vitro çalışma ile uyumludur.böbrekincinme. Çalışmalarında, streptozotosin ile indüklenen diyabetik fareler, GSK3b'yi aktive edebilen bir nitrik oksit donörü olan sodyum nitroprussid ile tedavi edildi. Glomerüllerde albüminüri, böbrek hipertrofisi ve hücre dışı matriks birikiminin, hipertansiyon veya hiperglisemide düzelme olmadığında düzeldiğini bulmuşlardır. Bununla birlikte, bu bulgular, kendiliğinden albüminüri ve podosit hasarı geliştiren, yapısal olarak aktif GSK3'e sahip, gen hedefli nakavt farelerden alınan verilerle keskin bir şekilde çelişmektedir.49 Çelişkili bulguları uzlaştırmak için, kimyasal inhibitörler veya aktivatörler kullanılarak oluşturulan verilerin yorumlanmasında dikkatli olunmalıdır. GSK3b'nin. BIO'nun GSK3b'nin oldukça seçici bir küçük moleküllü inhibitörü olduğu defalarca doğrulanmış olmasına rağmen, sodyum nitroprussid, GSK3b'nin spesifik bir aktivatörü değildir, ancak güçlü bir hemodinamik etkiye sahip olduğu bilinmektedir50, bu da albüminüriyi azaltıcı ve renokoruyucu etkisini diğer hastalarda karıştırabilir. diyabetik fareler. Birlikte ele alındığında, bazı çelişkili verilere rağmen, geçerli kanıtlar GSK3b'nin muhtemelen aşağıdakilerle ilişkili olduğunu destekleme eğilimindedir.böbrekincinmeve DN'de proteinüri. Mevcut çalışmanın birkaç sınırlılığından bahsetmek gerekir. İlk olarak, klinik öncesi veriler sadece DB/DB murin modelleriyle sınırlıydı. GSK3b'nin rolünün genelleştirilebilirliğini belirlemek içindiyabetik böbrek hasarı, tip 1 DN modelleri de dahil olmak üzere diğer DN modellerindeki bulguları doğrulamak gerekir. İkincisi, buradaki klinik gözlemler, sınırlı örneklem büyüklüğüne ve nispeten kısa bir takip süresine sahip diyabetik hastalardan oluşan geriye dönük kohortlardan elde edilmiştir. Kuşkusuz, gözlemlerimizi doğrulamak ve DKD'nin sonucunu tahmin etmede idrarla pul pul dökülen hücrelerde GSK3b'nin gücünü doğrulamak için büyük ölçekli, prospektif, randomize, çok merkezli çalışmalara ihtiyaç vardır.

Yüksek düzeyde korunmuş, redoksa duyarlı bir serin/treonin-protein kinaz olan GSK3b, insülin sinyallemesinde merkezi olarak yer alır ve ayrıca aşağıdakilerle ilgili patofizyolojik süreçler için çok önemli olan bir dizi başka hücresel sinyal yolunda yer alır.böbrekincinme, onarım ve rejenerasyon. Karaciğer ve iskelet kası gibi insüline duyarlı dokularda, GSK3b bazal koşullar altında aktiftir ve glikojen sentazın aktivitesini bastırır.19,28 İnsülin, GSK3b'yi serin 9'da inhibitör fosforilasyon yoluyla hızla etkisiz hale getirir ve glikojen biyosenteziyle sonuçlanır. Giderek artan kanıtlar, GSK3b düzensizliğinin tip 2 diabetes mellitus ile ilişkili olduğunu göstermektedir.19,29-31 Gerçekten de, diyabetik hastaların kaslarında31-33 ve obez diyabetik farelerin yağ dokularında GSK3b aşırı ekspresyonunu ve hiperaktivitesini gösteren veriler vardır.34 Ayrıca , farelerin iskelet kaslarında GSK3b'nin transgenik aşırı ekspresyonu bozulmuş glukoz toleransına, insülin direncine ve hiperinsülinemiye neden olur.29,35 Tersine, iskelet kaslarında GSK3b'si olmayan farelerde gelişmiş glukoz toleransı görülmüştür.36 Tutarlı bir şekilde, lityum gibi GSK3 inhibitörleri, insülini taklit etmek

hücre çizgileri ve dokularda etki.37 Ayrıca, obez diyabetik farelerde, GSK3 inhibitörleri insülin duyarlılığını ve glukoz homeostazını iyileştirdi.38 Böbrek, geleneksel olarak insülin etkisinin hedef organı olarak kabul edilmedi. Bununla birlikte, yakın zamanda ikna edici kanıtlar, böbrek hücrelerinde, özellikle podositlerde insülin sinyalleşmesinin, glomerüler ve böbrek homeostazını sürdürmede kilit bir rol oynadığını göstermiştir.39-41 İnsülin eksikliği veya direnci nedeniyle podositlerdeki hatalı insülin sinyali, muhtemelen çok önemli bir başlatıcıdır. DN'de gözlenen birçok patolojik lezyon için. Ayrıca klinik çalışmalar, diyabeti olmayan normotansif hastalarda bile insülin direncinin albüminürinin başlangıcı ve ciddiyeti ile ilişkili olduğunu göstermiştir, bu da insülin direncinin başlı başına albüminüriye neden olabileceğini düşündürmektedir.42 Benzer şekilde, podosit spesifik insülin direncine sahip farelerde, glomerüler podositlerde insülin reseptörünün koşullu nakavtı, hiperglisemi veya diyabet olmamasına rağmen DN'yi tekrarlayan albüminüri ve glomerüler lezyonlar geliştirdi.41 Tersine, diyabetik hayvanlarda, insülin duyarlılaştırıcılar glisemik kontrolden bağımsız olarak DN'nin ilerlemesini yavaşlatabilir.43 Bu bulgular, insülin sinyallemesinin kan glukoz düzeylerinden bağımsız olarak podosit fonksiyonunu düzenlediğini göstermektedir. Bununla birlikte, insülin sinyal yolunun anahtar dönüştürücüsü olarak, GSK3b'nin DN'nin patogenezindeki ve ilerlemesindeki rolü büyük ölçüde anlaşılmamıştır.

Böbrekte, GSK3b ağırlıklı olarak podositlerde ve daha az ölçüde glomerüldeki mesanjiyal ve endotelyal hücrelerde eksprese edilir20,21 ve renal tübüler hücreler tarafından geniş ölçüde eksprese edilir. Bizim ve diğer gruplarımızdan GSK3b'nin çoklu podosit patik sinyal yollarını entegre ederek podosit otonom hasarına aracılık ettiğini gösteren veriler vardır.17,20,44,45 GSK3b'nin tutarsızlığı, genetik veya farmakolojik blokajı podosit hasarına karşı koruma sağlayabilir ve hayvan modellerinde proteinüriyi azaltabilir. çeşitli diyabetik olmayan glomerülopatiler.21 Ayrıca, ilerleyici kronikböbrekhastalık, GSK3b'nin renal tübüler ve interstisyel hasarın bir modülatörü olduğu bulundu. Bununla birlikte, GSK3b'nin DN'ye dahil olup olmadığı ve nasıl dahil olduğu belirsizdir ve bu çalışma böbrekte ve üriner pul pul dökülmüş hücrelerde artmış GSK3b aktivasyonunun DKD'nin gelişimi veya ilerlemesi ile ilişkili olabileceğini gösterse de, belirsiz ve yoğun bir şekilde tartışmalı olmuştur. Örneğin, streptozotosin ile indüklenen diyabetli sıçanlarda, Lin ve ark.46, indirubin-30 -oksimde adenosin trifosfat-kompetitif inhibitör (20 Z,30 E)-6- Bromo tarafından GSK3b'nin inhibisyonunun ( BIO) proteinüriyi azalttı ve hipergliseminin düzeltilmesinin yokluğunda DN'nin glomerüler lezyonlarını iyileştirdi, bu da GSK3b'nin DN'de zararlı bir rol oynadığını düşündürdü. Ayrıca, streptozotosin ile indüklenen diyabetli sıçanlarda Paeng ve ark.22, BIO'yu kullanarak benzer bulgular elde etmiş ve diyabetik koşullar altında podositlerdeki artmış GSK3b aktivitesinin podosit apoptozu ve DN'de kayıp ile ilişkili olduğu sonucuna varmıştır. Bu, GSK3b'nin yüksek glikoz ortamına maruz kaldıktan sonra podosit farklılaşmasına ve yaralanmaya aracılık ettiği bulunan başka bir in vitro çalışma ile uyumludur.böbrekincinme. Çalışmalarında, streptozotosin ile indüklenen diyabetik fareler, GSK3b'yi aktive edebilen bir nitrik oksit donörü olan sodyum nitroprussid ile tedavi edildi. Glomerüllerde albüminüri, böbrek hipertrofisi ve hücre dışı matriks birikiminin, hipertansiyon veya hiperglisemide düzelme olmadığında düzeldiğini bulmuşlardır. Bununla birlikte, bu bulgular, kendiliğinden albüminüri ve podosit hasarı geliştiren, yapısal olarak aktif GSK3'e sahip, gen hedefli nakavt farelerden alınan verilerle keskin bir şekilde çelişmektedir.49 Çelişkili bulguları uzlaştırmak için, kimyasal inhibitörler veya aktivatörler kullanılarak oluşturulan verilerin yorumlanmasında dikkatli olunmalıdır. GSK3b'nin. BIO'nun GSK3b'nin oldukça seçici bir küçük moleküllü inhibitörü olduğu defalarca doğrulanmış olmasına rağmen, sodyum nitroprussid, GSK3b'nin spesifik bir aktivatörü değildir, ancak güçlü bir hemodinamik etkiye sahip olduğu bilinmektedir50, bu da albüminüriyi azaltıcı ve renokoruyucu etkisini diğer hastalarda karıştırabilir. diyabetik fareler. Birlikte ele alındığında, bazı çelişkili verilere rağmen, geçerli kanıtlar GSK3b'nin muhtemelen aşağıdakilerle ilişkili olduğunu destekleme eğilimindedir.böbrekincinmeve DN'de proteinüri. Birkaç sınırlama

mevcut çalışmaya değinmek gerekir. İlk olarak, klinik öncesi veriler sadece dB/dB murin modelleriyle sınırlıydı. GSK3b'nin rolünün genelleştirilebilirliğini belirlemek içindiyabetik böbrek hasarı, tip 1 DN modelleri de dahil olmak üzere diğer DN modellerindeki bulguları doğrulamak gerekir. İkincisi, buradaki klinik gözlemler, sınırlı örneklem büyüklüğüne ve nispeten kısa bir takip süresine sahip diyabetik hastalardan oluşan geriye dönük kohortlardan elde edilmiştir. Kuşkusuz, gözlemlerimizi doğrulamak ve DKD'nin sonucunu tahmin etmede idrarla pul pul dökülen hücrelerde GSK3b'nin gücünü doğrulamak için büyük ölçekli, prospektif, randomize, çok merkezli çalışmalara ihtiyaç vardır.

Özetle, çalışmalarımız GSK3b'nin renal ekspresyonunun ve aktivitesinin deneysel ve klinik DN'de güçlendirildiğini göstermiştir. Üriner pul pul dökülmüş hücrelerdeki GSK3b aktivitesi, DN'nin ilerlemesini tahmin etmek için yeni bir biyobelirteç olarak hizmet edebilir. Verilerimiz, üriner pul pul dökülmüş hücrelerde GSK3b'nin DN'nin prognostik bir biyobelirteç olarak hizmet edebileceği değerin büyük ölçekli, derinlemesine incelenmesinin yolunu açabilir.

YÖNTEMLER

Hayvan çalışmaları

Hayvan çalışmaları, Kurumsal Hayvan Bakım ve Komitesi tarafından onaylanmıştır ve ABD Tarım Bakanlığı yönetmeliklerine ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının İnsan Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygundur. 6 haftalık erkek DB/DB fareleri ve kontrol db/m yavruları Nanjing Üniversitesi Model Hayvan Araştırma Merkezi'nden (Nanjing, Çin) satın alındı ​​ve Zhengzhou Üniversitesi Merkez Hayvan Tesisinde barındırıldı. Tüm fareler ad libitum ile beslendi ve belirtilen yaşlarda 8 ila 10 fare öldürüldü. Belirtilen zaman noktalarında idrar ve kan örnekleri alındı. Öldürdükten sonra, daha fazla inceleme için böbrekler toplandı. İdrar albümin seviyeleri, bir fare albümin enzimine bağlı immünosorbent tahlil niceleme kiti (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) kullanılarak ölçüldü. İdrar kreatinin seviyeleri, bir kreatinin tahlil kiti (BioAssay Systems, Hayward, CA) kullanılarak belirlendi.

Hücre kültürü

21 ve 25. pasajlar arasında şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş fare podositleri, daha önce tarif edildiği gibi izin verilen koşullar altında yüzde 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Institute 1640 ortamında kültürlendi.22 Podositlerin alt kültürleri, farklılaşmayı indüklemek için 14 gün boyunca izin vermeyen koşullara tabi tutuldu ve daha sonra 5 mM glikoz içeren normal bir ortam/kültür ortamına, glikoz (25 mM) ve dönüştürücü büyüme faktörü bl'den (2 ng/ml) oluşan bir diyabetik ortama veya 48 için 20 mM mannitol içeren yüksek ozmolaliteli bir kontrol ortamına maruz bırakıldı. saat. Murin proksimal tübüler epitel hücreleri ve fare glomerüler mezanjiyal hücreleri, yüzde 5 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle's ortamı/F12'sinde tutuldu. Hücreler, 24 saat boyunca yüzde 5 cenin sığır serumu içeren ortamda yüzde w70 birleştiği yerde kaplandı ve daha sonra 24 saat daha serum açlığına tabi tutuldu, ardından 5 mM glikoz içeren normal bir ortam/kültür ortamına maruz bırakıldı, yüksek şeker içeren diyabetik bir ortam. glukoz (25 mM) ve dönüştürücü büyüme faktörü b1 (2 ng/ml) veya 48 saat boyunca 5 mM glukoz ve 20 mM mannitol içeren yüksek ozmolaliteli bir kontrol ortamı. Hücre canlılığı, Tripan mavisi dışlama ile değerlendirildi. Belirtilen zaman noktalarında hücreler sabitlendi veya daha fazla araştırma için hücre lizatları toplandı.

Vektörlerin geçici transfeksiyonu

GSK3b'nin boş vektörü veya hemagglutinin (HA)– etiketli yapısal olarak aktif (S9A) mutantını (S9A-GSK3b-HA/ pcDNA3) kodlayan vektörler Dr. Gail VW Johnson (Birmingham, AL) tarafından sağlandı ve kültürlenmiş podositlere transfekte edildi, daha önce tarif edildiği gibi Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) kullanılarak mezangial hücreler ve tübüler epitelyal hücreler.44 Transfeksiyon etkinliği, HA için 12 saatte immünofloresan boyama veya immünoblotlama ile doğrulandı. Hücreler daha sonra toplandı ve Western blot analizi veya diğer deneyler için hazırlandı.

RNAi

3 fareden oluşan bir havuz GSK3b'ye özgü küçük, enterferans yapan RNA dupleksleri—50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACTt-30 ve 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt-30 — murin GSK3b geninin tam kodlama dizisine göre tasarlanmış ve sentezlenmiştir (GenBank erişim no.BC060743.1). Ek olarak, fareler, sıçanlar veya insanlardan alınan bilinen herhangi bir gen dizisine dizi benzerliği olmayan, karıştırılmış küçük, enterferans yapan bir RNA dizisi (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUTt-30), RNAi için bir kontrol olarak kullanıldı. Lipofektamin (Invitrogen, Carlsbad, CA) aracılı gen susturmanın etkinliği, GSK3b için immünoblot analizi ile değerlendirildi. RNAi'den 24 saat sonra kültürlenmiş podositlerde, mezanjiyal hücrelerde ve tübüler epitelyal hücrelerde GSK3b protein ekspresyonunun tatmin edici bir şekilde baskılanması gözlemlendi. Hücreler daha sonra, hücreler başka deneyler için işlenmeden önce 48 saat boyunca normal bir ortam/kültür ortamına, bir diyabetik ortama veya yüksek ozmolaliteli bir kontrol ortamına tabi tutuldu.

Klinik çalışmalar

Bu çalışmanın klinik kısmı, 1975 Helsinki Bildirgesi'nin etik kurallarına uygundur ve Zhengzhou Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesinin Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. İnsan araştırma katılımcıları bu çalışma için özel olarak işe alınmamıştır. Tüm klinik veriler, geriye dönük çizelge incelemesi ve arşivlenmiş doku bölümlerinin veya depolanmış idrar örneklerinin incelenmesiyle toplanmıştır. Aşırı veya atılan böbrek biyopsi örneklerinin yanı sıra fraksiyonlanmış idrar örnekleri, Zhengzhou Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Nefroloji Enstitüsü'nde rutin olarak bankaya yatırılmıştır. DN'nin çeşitli aşamalarındaki hastalardan arşivlenmiş tanımlanamayan formalinle sabitlenmiş parafine gömülü böbrek biyopsisi dokuları inceleme için rastgele seçilmiştir. Vasküler anomaliler nedeniyle transplantasyon için atılan böbreklerden veya preimplantasyon biyopsi dokularından histomorfolojik lezyonu olmayan ek böbrek örnekleri alındı ​​ve normal kontroller olarak kullanıldı. Retrospektif kohort çalışması için, 2010'dan beri bankada fraksiyone idrar örnekleriyle takip edilen tip 2 diyabetli toplam 127 hasta, bu çalışmaya dahil edilmek üzere geriye dönük olarak tarandı. Çalışılan hastalar 29 ile 80 yaşları arasındaydı ve Amerikan Diyabet Derneği kriterlerine göre tip 2 diyabet tanısı aldı. Dışlama kriterleri, takip kaybı, yetersiz bilgi,böbrekişlev bozukluğu, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 yıl. Rutin takip sırasında cinsiyet, yaş, komorbiditeler, ilaçlar, diyabet süresi, kan basıncı, glisemik seviye, serum kreatinin seviyesi, idrar tahlili verileri, BAE ve eGFR dahil olmak üzere klinik parametrelerin yanı sıra demografik veriler belgelendi. 5 yıllık takipten sonraki klinik sonuç, çeşitli klinik aşamalar boyunca albüminürinin şiddetinin artmasıyla belirtildiği gibi, eGFR'de yüzde 25'lik bir azalma veya albüminürinin ilerlemesi olarak tanımlanan böbrek yetmezliğinin ilerlemesinin varlığı veya yokluğuydu. DN, yani normoalbuminüri, mikroalbuminüri, makroalbuminüri veya açık proteinüri. Tüm hastalar yazılı bilgilendirilmiş onam verdi.

Böbrek morfolojisi değerlendirmesi ve immünohistokimya analizi

Parafine gömülü formalinle sabitlenmiş fare böbrek doku blokları 3-mm'lik kesitler halinde kesildi. Genel histoloji için, kesitler periyodik asit-Schiff boyaması için işlendi. GSK3b ve p-GSK3b için immünohistokimyasal boyama, daha önce tarif edildiği gibi bir VECTASTAIN ABC kiti (Vector Laboratories, Burlingame, CA) kullanılarak yapıldı.20 Negatif kontrol olarak, birincil antikor aynı türden immün olmayan serum ile değiştirildi; lekelenme olmadı. Tüm kesitlerin morfolojik özellikleri tek bir gözlemci tarafından bir renal patoloğun yardımıyla kör olarak değerlendirildi.

immünofloresan boyama

Kültürlenmiş hücreler veya donmuş kriyostat bölümleri sabitlendi ve birincil antikorlarla boyandı ve ardından Alexa Fluor-konjuge ikincil antikorlar (Invitrogen) uygulandı. Negatif bir kontrol olarak, birincil antikorlar, aynı türden preimmün IgG ile değiştirildi; lekelenme olmadı. Son olarak, kesitler 40,6-diamidino-2-fenilindol veya propidyum iyodür ile zıt boyandı ve VECTASHIELD yerleştirme ortamı (Vector Laboratories) ile monte edildi. FL floresan mikroskobu için, florokromun değişken bozunması nedeniyle artefaktları dışlamak için tüm bölümler aynı anda analiz edildi. Kesitler, Spot II dijital kamera (Olympus, Tokyo, Japonya) ile donatılmış bir Olympus FL floresan mikroskobu kullanılarak incelendi. Çift renkli boyama için, boya girişimini önlemek için görüntüler sırayla elde edildi. ImageJ yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) görüntülerin sonradan işlenmesi, örneğin ölçeklendirme, birleştirme ve kollokalizasyon analizi için kullanıldı.

bilgisayarlı morfometri

İmmünohistokimya boyamasının görüntüleri, bir mikroskoba (Olympus BX41, Olympus) ve bir bilgisayara bağlı yüksek çözünürlüklü, şarj bağlantılı bir cihaz dijital kameradan oluşan bilgisayarlı bir görüntü analiz sistemi kullanılarak yakalandı ve sayısallaştırıldı. Görüntüler 1024 768 piksel (uzaysal çözünürlük, 0.24 mm/piksel) piksel çözünürlüğünde görüntülendi. İnsan böbrek dokularının immünohistokimya boyama görüntüleri için, görüntü segmentasyonu, eşik oluşturma ve sinyal yoğunluğu ölçümleri için ImageJ yazılımı kullanıldı. Gerektiğinde manuel düzeltmeler yapıldı. Genel olarak, morfometrik analiz için 10 glomerül veya 10 rastgele tubulointerstisyel alan örneklendi ve nihai veriler, kontrol grubuna göre entegre piksel yoğunluğunun değeri olarak ifade edildi.

Western immünoblot analizi

Kültürlenmiş hücreler parçalandı;böbrekDokularveya izole edilmiş renal glomerüller, proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş radyoimmünopresipitasyon deney tamponunda homojenleştirildi ve numuneler, immünoblot analizi için işlendi. İdrardaki sınırlı sayıda pul pul dökülmüş hücrenin immünoblot analizi için, Western blot protokolü, yüksek performanslı NuPAGE Bis-Tris Gels (Invitrogen) ve yüksek kaliteli transfer membranları kullanılarak daha önce tarif edildiği gibi değiştirildi.25 Rafine edilmiş immünoblotlama, 1000 kadar az hücrede orta derecede eksprese edilmiş proteinleri tespit eder. GSK3b, fibronektin, kolajen IV, aktin ve gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH)'ye karşı antikorlar, Santa Cruz Biotechnology'den (Santa Cruz, CA) satın alındı; sinaptopodine karşı olanlar PROGEN Biotechnik GmbH'den (Heidelberg, Almanya) satın alındı; ve ZO-1 ve p-GSK3b'ye karşı olanlar, Cell Signaling Technology'den (Danvers, MA) elde edildi.

istatistiksel analiz

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 karşılaştırma. Kategorik veriler gruplar arasında ki-kare testi kullanılarak karşılaştırıldı. 2 parametre arasındaki olası ilişkileri incelemek için lineer regresyon analizi uygulandı. İlgili değişkenler ve böbrek yetmezliğinin ilerleme riski arasındaki ilişkileri değerlendirmek için tek değişkenli Cox orantılı tehlikeler regresyon analizleri yapıldı, ardından potansiyel karıştırıcılara ilişkin çok değişkenli analizler yapıldı. Diyabetik hastalarda böbrek yetmezliğinin ilerlemesini öngörmede belirli değişkenlerin gücünü analiz etmek için ROC eğrisi analizi yapıldı ve ROC eğrilerinin altındaki alanlar ölçüldü. BAE gibi normal olarak dağıtılmamış değişkenler, Cox orantı tehlikeleri regresyon analizleri ROC eğrisi analizleri için normalliğe ulaşmak için logaritma ile dönüştürülmüştür. Tüm istatistiksel analizler, PSS versiyon 22 (IBM Corporation, Armonk, NY) kullanılarak yapıldı. P değerleri<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

AÇIKLAMA

Tüm yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemiştir.

TEŞEKKÜRLER

Bu çalışmanın bir kısmı KidneyWeek 2016: American Society of Nephrology Annual Meeting, 15-20 Kasım 2016, Chicago, IL'de sözlü sunum olarak sunuldu. RG, Sağlık Vakfı tarafından kısmen desteklenmiştir. XL, okul dışı eğitim almak için bir araştırma bursu tarafından desteklendi. ZL, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından U1604284, 81770672 ve 81873612 tarafından desteklenmiştir. Finansörlerin bu çalışmanın tasarımında ve yürütülmesinde, verilerin toplanmasında ve yorumlanmasında veya makalenin hazırlanmasında ve onaylanmasında hiçbir rolü yoktur.

YAZAR KATKILARI

RG kavramsal fikirleri tasarladı. XL, ZL ve RG, çalışma tasarımına katkıda bulundu. XL, PW, BC, YG, AYG ve BF hücre kültürü deneylerini gerçekleştirdi. XL ve ZL, hayvan deneylerini gerçekleştirdi ve diyabetik hastalardan verileri topladı. XL, LJW, DKM, LDD, ZL ve sonuçların tartışılmasına ve yorumlanmasına katkıda bulunmuştur. taslağın yazılmasına öncülük etti. XL, BC ve BF, el yazması düzenlemeye katkıda bulundu. Tüm yazarlar, bu çalışmanın tüm konseptinin ve mülkiyetinin RG'ye ait olduğu konusunda hemfikirdir. Tüm yazarlar nihai makaleyi onayladı.

EK MATERYAL

Ek Yöntemler.

Tablo S1. Diyabetik nefropatinin histolojik sınıflarına göre sınıflandırılan diyabetik nefropatili hastaların ve kontrol deneklerinin özellikleri. Tablo S2. DKD belirtisi olmayan erken evre diyabetik hastalardan oluşan retrospektif kohortun temel demografik, klinik ve laboratuvar verileri. Tablo S3. Erken evre tip 2 diyabetli hastaların demografik, klinik ve laboratuvar verileri, 5 yıllık takipten sonra böbrek sonuçlarına göre sınıflandırılmıştır. Şekil S1. GSK3b'nin gelişmiş böbrek aktivitesi, hastalığın gelişimini ve ciddiyetini tahmin eder.şeker hastasıböbrekhastalıkdb/db farelerde. Erkek db/db ve db/m fareleri 4-13 haftalıkken izlendi. (A) 4 ve 7 haftalıkken aç bırakılmamış farelerden kan örneği alındı ​​ve plazma glukoz seviyeleri test edildi. *P < 0.007="" haftalıkken="" db/m="" farelere="" karşı="" 1.="" n="" ¼="" 15–18.="" (b)="" spot="" idrar="" 4,="" 7,="" 10="" ve="" 13="" haftalıkken="" örneklendi="" ve="" üriner="" albümin-kreatinin="" oranlarının="" (uacr'ler)="" belirlenmesi="" için="" üriner="" albümin="" ve="" idrar="" kreatinin="" testine="" tabi="" tutuldu.="" *="" 10="" haftalıkken="" db/m="" farelere="" karşı="" p="">< 0.001="" (n="15-18);" #p="">< 0,001,="" 13="" haftalıkken="" db/m="" farelere="" karşı.="" n="" ¼="" 15–18.="" (c)="" tüm="" fareler="" 7="" haftalıkken="" açık="" böbrek="" biyopsisi="" aldı="" ve="" biyopsi="" örnekleri,="" p-gsk3b,="" gsk3b="" ve="" gapdh="" için="" immünoblot="" analizi="" için="" işlendi.="" (d)="" immünoblotlar="" dansitometrik="" analize="" tabi="" tutuldu.="" gsk3b="" ve="" p-gsk3b'nin="" nispi="" bolluğu,="" kontrol="" db/m="" farelerine="" kıyasla="" kat="" değişiklikleri="" olarak="" ilgili="" molekül/gapdh'nin="" dansitometrik="" oranları="" olarak="" belirlendi.="" gsk3b'nin="" nispi="" aktivitesi,="" kontrol="" db/m="" farelerinin="" katları="" olarak="" p="" gsk3b'nin="" gsk3b'ye="" oranları="" olarak="" hesaplandı.="" (e)="" lineer="" regresyon="" analizi,="" db/db="" farelerde="" 7="" haftalık="" renal="" gsk3b="" aktivitesi="" ile="" albüminüri="" gelişimi="" ve="" şiddeti="" arasında="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" bir="" pozitif="" korelasyon="">şeker hastasıböbrekhastalık13 haftalıkken. R=0.699; P ¼ 0.0{{20}}1. (F) Alıcı işletim karakteristik eğrisi analizi, diyabetin erken evrelerinde (7 haftalık) renal GSK3b aktivitesinin, db/db farelerde 13 haftalıkken albüminüri ve DKD gelişimini öngörmede mükemmel doğruluk ve güç sağladığını göstermiştir. Şekil S2. İnsülin direnci ve yüksek ortam glikozu, böbrek hücrelerinde GSK3b'yi sinerjistik olarak aktive eder. (A) Kültürlenmiş murin podositleri, (B) idrar glomerüler mezangial hücreler (MMC'ler) ve (C) renal tübüler epitel hücreleri (TEC'ler), karıştırılmış siRNA oligonükleotitleri (siCon) veya b izoformuna özgü siRNA oligonükleotitleri (siIRb) ile transfekte edildi. İn vitro insülin direnci durumunu modellemek için insülin reseptörü (IRB). Hücreler daha sonra 48 saat boyunca normal glikoz içeren normal ortama (NG) veya yüksek glikoz içeren diyabetik ortama (HG) maruz bırakıldı. Hücre lizatları toplandı ve IRB, p-GSK3b, GSK3b ve GAPDH için immünoblot analizine ve ardından lekelerin dansitometrik analizine tabi tutuldu. *Aynı ortama maruz kalan siCon ile tedavi edilen hücrelerde IRB ekspresyonuna karşı P < 0.01,="" #p="">< 0.05="" siirb="" +="" ng="" veya="" sicon="" +="" hg="" grubunda="" (n="" ¼="" 3)="" aynı="" protein="" ekspresyonuna="" karşı,="" &p="">< 0,05'e="" karşı="" ikinci="" ±="" hg="" veya="" siirb="" +="" ng="" grubundaki="" aynı="" protein="" ekspresyonu="" (n="3)." şekil="" s3.="" sağlıklı="" canlı="" donörlerden="" ve="" diyabetik="" nefropatili="" hastalardan="" elde="" edilen="" insan="" böbrek="" örneklerinde="" gsk3b="" mrna'nın="" ekspresyon="" seviyeleri.="" veriler,="" ju="" ckd="" glom="" veri="" kümesi51="" temelinde="" www.nephroseq.org'dan="" türetildi="" ve="" log2="" medyan="" merkezli="" yoğunluk="" olarak="" ifade="" edildi.="" şekil="" s4.="" gsk3b'nin="" erken="" evre="" diyabet="" hastalarından="" toplanan="" üriner="" pul="" pul="" dökülmüş="" hücrelerdeki="" arttırılmış="" aktivitesi,="" diyabetik="" böbrek="" hastalığının="" gelişimini="" öngörmektedir.="" (a,="" b)="" erken="" evre="" diyabetik="" hastalardan="" (pts)="" ve="" sağlıklı="" kontrollerden="" (ctrls)="" toplanan="" üriner="" pul="" pul="" dökülmüş="" hücrelerde="" gsk3b="" ve="" aktive="" edilmiş="" gsk3b'nin="" saptanması.="" üriner="" pul="" pul="" dökülmüş="" hücreler="" toplandı="" ve="" parçalandı.="" hücre="" lizatları,="" gsk3b,="" p-gsk3b="" ve="" gapdh="" için="" immünoblot="" analizi="" için="" işlendi.="" (c)="" immünoblotlar="" dansitometrik="" analize="" tabi="" tutuldu.="" gsk3b="" ve="" p-gsk3b'nin="" nispi="" bolluğu,="" kontrollere="" (ctrls)="" kıyasla="" kat="" değişiklikleri="" olarak="" ilgili="" molekül/gapdh'nin="" dansitometrik="" oranları="" olarak="" belirlendi.="" gsk3b'nin="" nispi="" aktivitesi,="" normal="" kontrolün="" katları="" (ctrls)="" olarak="" p-gsk3b'nin="" gsk3b'ye="" oranları="" olarak="" hesaplandı.="" (d)="" alıcı="" çalışma="" karakteristik="" eğrisi="" analizi,="" erken="" evre="" diyabetik="" hastalardan="" toplanan="" üriner="" pul="" pul="" dökülmüş="" hücrelerdeki="" nispi="" gsk3b="" aktivitesinin="" (p-gsk3b/gsk3b="" oranı),="" aşağıdakilerin="" gelişimini="" tahmin="" etmede="" mükemmel="" doğruluk="" sağladığını="">diyabetik böbrek hastalığı5 yıl içinde, eğrinin altındaki alan (AUC) 0.886 olur.

REFERANSLAR

1. Umanath K, Lewis JB. Diyabetik Nefropati Güncellemesi: Temel Müfredat 2018. Am J Böbrek Dis. 2018;71:884-895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J, et al. Amerika Birleşik Devletleri'nde diyabetle ilgili komplikasyonlardaki değişiklikler, 1990-2010. N Engl J Med. 2014;370:1514–1523.

3. Haller H, Ito S, Izzo JL Jr, et al. Olmesartan, tip 2 diyabette mikroalbüminürinin geciktirilmesi veya önlenmesi için. N Engl J Med. 2011;364:907-917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Diyabetik nefropatinin patojenik mekanizmaları. J Am Soc Nephrol. 2005;16(ek 1):S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlik I. Diyabetik nefropatinin klinik görünümü ve doğal seyri. Katkıda bulunan Nefrol. 2011;170:19–27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA, et al. 10-Tip 2 diyabette yoğun glikoz kontrolünün yıllık takibi. N Engl J Med. 2008;359:1577–1589.

7. Perkins BA, Ficociello LH, Ostrander BE, et al. Tip 1 diyabette mikroalbüminüri ve erken ilerleyici böbrek fonksiyonu riski azalır. J Am Soc Nephrol. 2007;18:1353-1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM, et al. Diyabetli kişilerde normoalbüminürik CKD'nin son dönem böbrek hastalığına ilerleme riski: CRIC (Kronik Böbrek Yetmezliği Kohortu) Çalışması. J Böbrek Dis. 2018;72:653-661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Diyabetik nefropati riskinin erken belirleyicilerine duyulan ihtiyaç: albümin atılım hızı yeterli mi? Diyabet. 2000;49:1399–1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Normoalbuminürik tip 1 diyabetik hastalarda düşük glomerüler filtrasyon hızı: daha ileri glomerüler lezyonların bir göstergesi. Diyabet. 2003;52:1036-1040.

11. Krolewski A.Ş. Progresif böbrek düşüşü: tip 1 diyabette yeni diyabetik nefropati paradigması. Diyabet bakımı. 2015;38:954-962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Proteinürik olmayan diyabetik nefropati. J Clin Med. 2015;4:1761–1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE, et al. Tip 2 diyabette nefropatinin gelişimi ve ilerlemesi: Birleşik Krallık Prospektif Diyabet Çalışması (UKPDS 64). Böbrek İnt. 2003;63:225–232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L, et al. Erken diyabetik nefropatinin değerlendirilmesinde üriner biyobelirteçler. J Diyabet Araş. 2016;2016: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Y, et al. Üriner IgG4 ve Smad1, diyabetik nefropatinin erken evrelerinde renal yapısal ve fonksiyonel değişiklikler için özel biyobelirteçlerdir. Diyabet. 2018;67:986-993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima M, et al. Ekzositoz aracılı idrar tam uzunlukta megalin atılımı, diyabetik nefropatinin patogenezi ile bağlantılıdır. Diyabet. 2017;66:1391–1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z, et al. Glikojen sentaz kinaz 3b, paxillin aktivitesini modüle ederek podosit hareketliliğini ve fokal yapışma cirosunu belirler: düşük doz lityumun podositopatide koruyucu etkisi için çıkarımlar. J Pathol'um. 2014;184:2742–2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. Glikojen sentaz kinaz-3: özellikler, işlevler ve düzenleme. Kimya Rev. 2001;101:2527–2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. Glikojen sentaz kinaz-3 (GSK3): düzenleme, eylemler ve hastalıklar. Farmakol Ter. 2015;148:114–131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L, et al. GSK3'ün b izoformu, proteinürik glomerülopatide podosit otonom hasarına aracılık eder. J Pathol. 2016;239:23.