BÖLÜM Ⅰ: Sinbiyotik Lactobacillus Bulgaricus 6c3 Suşunun, İnülin ve Fruktooligosakkaritin Uygulanması İndoksil Sülfat Konsantrasyonlarını ve Böbrek Hasarını Azaltır
Mar 23, 2022
ali.ma@wecistanche.com
AlonsoJerez-Morales,JoseS.Merino,Sindy T.Diaz-Castillo & et al.
1. Giriş
Kronik böbrek hastalığı(CKD) kalıcı bir değişiklik olarak kabul edilir.böbrekyapısı, işlevi veya en ciddi durumlarda her ikisi de. KBH, bireyin sağlığını ve yaşam kalitesini doğrudan etkiler [1,2]. Fizyolojik düzeyde, CKD'nin neden olduğu değişiklikler sıklıkla gözlenir, artan serum kreatinin seviyeleri, sistatin Kor üreik nitrojen [2]. Yoğunlaştırılmış sürveyans ve popülasyondaki farkındalık, örneğin ABD nüfusunun yüzde 15'inin bu patolojiden etkilendiğini belirlemeye ulaşan KBH tanılarını artırmıştır [3]. Yukarıda bahsedilen metabolitlerin etkilerinin yanı sıra hastalığın ilerlemesi, kardiyovasküler ve gastrointestinal sistemler dahil olmak üzere vücudun birçok sisteminde ciddi bir etkiye sahiptir; bu metabolitlerin varlığı, öncekilerde artan mortalite ile bağlantılıdır. ve ikincisinde asimilasyon, hareketlilik ve geçirgenliği etkiler [4,5]. Gastrointestinal değişiklikler, normal mikrobiyotanın bileşimini ve metabolik fonksiyonlarını etkileyen ve bağırsak disbiyozuna neden olabilen sistemik bir enflamasyonun sürdürülmesine katkıda bulunan bağırsakta metabolitlerin emiliminin artmasına neden olur [6].
Böbrek için cistanche yan etkileri ve Cistanche ürünü için tıklayın
KBH ile bağırsak disbiyozu arasındaki ilişki sadece diyetteki değişikliklerle değil, ayrıca artan amonyum konsantrasyonuna ikincil olarak lümen pH'sının artmasıyla da açıklanabilir [7]. Son dönem KBH hastaları, sağlıklı bireylerle karşılaştırıldığında dışkılarında çeşitli bakteri taksonlarının bolluğunda belirgin farklılıklara sahiptir [8]. Özellikle bakteri cinsi düzeyinde, KBH hastalarında Enterorhabdus, Blautia, Ruminococcus, Parasutterella, Bacteroides, Clostridium (sensu stricto), Escherichia, Shigella ve Allobaculum'da artış ve Akkermansia, Bifidobacterium, Clostridium IV, Lactobacillus, Lactobacillus'ta azalma görülür. , Leuconostoc, Alkaliphilus ve Pseudomonas [9-11]. Ya zayıf renal depurasyon ya da intestinal disbiyoz nedeniyle, toksik metabolitler üreten patojenleri metabolize edebilen ve inhibe edebilen bakteri cinslerinde azalma olur ve bu da onların artmasına neden olur [12]. Wong et al. [8], ilerlemiş CKD'den mustarip hastalarda, üreaz, ürikaz gibi enzimlere sahip bakteri gruplarının ve p-kresol ve indol üretenlerin arttığını gösterdi.
Aşağıdakiler dahil olmak üzere kanda üremik retansiyon metabolitlerinin (URM'ler) birikmesiindoksil sülfat(IS), p-kresil sülfat (pCS), trietilamin ve trimetilamin N-oksit (TMAO)[5], CKD'nin hızlandırıcıları olarak kabul edilir [13]. DIR-DİR(indoksil sülfat)En iyi bilinen üremik indol, proksimal kıvrımlı tübüller tarafından salgılanır.böbrekve bakteriyel triptofanaz tarafından triptofanın metabolizmasından kaynaklanır. Hayvan modellerinden elde edilen kanıtlar, IS'nin(indoksil sülfat)böbrek fonksiyonunu etkileyebilir ve tübül hücrelerine zarar verebilir, endotel hücrelerinde oksidatif stres oluşturarak onarım mekanizmalarını inhibe edebilir ve metalloproteinazların (TIMP) doku inhibitörü TGF-1'nin gen ekspresyonunu arttırdığı için interstisyel tübüler fibrozisi destekleyebilir. -1)ve kolajen [14]. Bununla birlikte, bağırsak mikrobiyotasının dengesizliği ve buna eşlik eden toksik metabolitlerin üretimi değiştirilebilir. Belirli probiyotikler ve prebiyotiklerle takviyenin, belirli üremik toksinlerin üretimini azaltabileceği ve normal mikrobiyotayı eski haline getirebileceği açıklanmıştır [5]. Örneğin, meta-analiz çalışmaları, probiyotik suşlarla takviye alan KBH hastalarının anti-inflamatuar sitokinlerini arttırdığı ve üremik toksin düzeylerini azalttığı sonucuna varmıştır [15,16]. Bazı çalışmalar, probiyotikler ve prebiyotiklerin bir kombinasyonu olan sinbiyotiklerin uygulanmasının, olumlu sonuçlarla KBH'nin ilerlemesini azaltma yeteneğine sahip olduğunu bildirmiştir [12]. Mevcut çalışma bağlamında, inülin tipi fruktanlar, gösterdikleri için ilgili prebiyotiklerdir. CKD'nin ilerlemesini azaltma [17] ve pCS ve IS gibi URM'leri azaltma kapasiteleri(indoksil sülfat)[18]. Panza et al. (2017), evre 2-5 KBH olan hastalarda probiyotik L.acidophlilus ve Bifidobacterium longum artı fruktooligosakkaritler (FOS) uygulamış ve tedavi edilmeyen hastalarda önemli ölçüde daha fazla PCS olduğunu ve(indoksil sülfat)kanda sinbiyotik tedavi alan hastalardan daha fazladır [19]. Bu çalışmada, önce probiyotik suşların IS'yi azaltma kapasitesini değerlendirdik.(indoksil sülfat)En umut verici olanı seçmek için in vitro. Daha sonra, bu suş, varsayılan bir sinbiyotik elde etmek için prebiyotikler inülin ve fruktooligosakkaritler (FOS) ile birleştirildi. Bu prebiyotikler, pCS ve IS'yi azaltabileceklerini gösterdikleri için seçilmiştir.(indoksil sülfat)kandaki konsantrasyon [17,18]. Son olarak, varsayılan sinbiyotiğin etkinliği in vivo olarak test edildi ve kan IS'yi değerlendirdi.(indoksil sülfat)ve kreatinin seviyeleri veböbrekve bir sıçan modeli (Sprague-Dawley sıçanları) kullanılarak kalp hasarıböbrekeksik (nefrektomize) ve tedavi edilmemiş hayvanlar.
2. Sonuçlar
2.1.IS'yi Azaltabilecek Suşların İzolasyonu(indoksil sülfat)Laboratuvar ortamında
36 süt ürünü örneğinden 84 suş, diferansiyel ortam olarak kullanılan bromofenol mavisi (MRS-BFB) ile takviye edilmiş MRS agarda izole edildi. Bu ortam, laktik asit bakterilerinin ayırt edilmesini sağlar. pH 3'te koloniler sarı renklenecek ve pH 5'e yakın olduğunda mavi renk alacaktır [19]. İzole edilen 84 suşun tümü, IS azalmasına aracılık etme yeteneklerini belirlemek için in vitro test edildi.(indoksil sülfat). Bunun için suşlar, 2.8 mM IS ile takviye edilmiş MRS broth içinde kültürlendi.(indoksil sülfat)48 saat boyunca ve ardından IS(indoksil sülfat)yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile ölçülmüştür. lc2, 6c3 ve VIc2 suşları önemli ölçüde azaltabilmiştir (p<0.05) the="" concentration="" of="" the="" compound="" (table="" 1).="" furthermore,="" the="" three="" strains="" were="" cultured="" together="" for="" 48="" h="" in="" the="" presence="" of="">(indoksil sülfat)IŞİD'i azaltmak için sinerjik hareket edip etmediklerini değerlendirmek(indoksil sülfat). Her üç suş da IS varlığında birlikte kültürlendiğinde(indoksil sülfat), IS konsantrasyonu(indoksil sülfat)aynı zamanda önemli ölçüde azaltıldı, ancak tek başına suşlar tarafından elde edilenden daha azdı, bu da sinerjistik aktivite olasılığını ortadan kaldırdı(Tablo1).
Tablo 1.In vitro azalma, eğerindoksil sülfat(IS), bakteri suşlarının aracılık ettiği yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile değerlendirilir.
2.2. Seçilmiş Suşların Tanımlanması
IS'yi azaltma yetenekleri nedeniyle seçilen üç suş(indoksil sülfat)DNA'nın PCR amplifikasyonundan sonra 16S rRNA dizilimi ile tanımlandı. Tür 1c2, moleküler analizde Streptococcus thermophilus için LacZ primerleri ile amplifiye edilen bir Gram pozitif zincir oluşturan koktu. 6c3 ve VIc2 suşlarının her ikisi de Gram pozitif basildi ve Lactobacillus cinsini tanımlamak için LbG primerleri ile amplifiye edildi. 16SrRNA dizi analizi, lc2 soyunu Streptococcus thermophilus(yüzde 97.3 benzerlik; Erişim Numarası: AY188354,1), 6c3 soyunu Lactobacillus bulgaricus(yüzde 99.7 benzerlik; Erişim Numarası: CR954253) ve VIc2 soyunu Lactobacillus acidophilus (yüzde 97.3 benzerlik) olarak tanımlamaya izin verdi. Yüzde 99,5 benzerlik; Erişim Numarası: AY773947.1). Sinbiyotik hazırlamak ve aşağıdaki testleri yürütmek için üç suştan sadece biri seçildi. Streptococcus thermophilus 1c2 suşu, düşük büyüme oranı gösterdiği için atıldı. Kalan iki suştan Lactobacillus bul-garicus 6c3 suşu seçildi çünkü Lactobacillus acidophilus VIIc2 suşundan daha iyi probiyotik işlevsellik ve güvenlik özellikleri gösterdi.
2.3. Sinbiyotiklerin Kan Kreatinin ve IS Üzerindeki Etkisi(indoksil sülfat)Seviyeler
Probiyotik L. bulgaricus 6c3, probiyotik 10 derece CFU/g liyofilize ürünün konsantrasyonu olan prebiyotikler Inuline ve FOS ile birlikte liyofilize edildi. Nefrektomize sinbiyotik ile tedavi edilen Sprague-Dawley sıçanları (Lac) grubuna içme suyunda günlük on gram sinbiyotik uygulandı. Nefrektomi uygulanmış tedavi edilmemiş grup (Nef) ve nefrektomi uygulanmamış kontrol grubu sin-biyotik almadı. Serum kreatinin ve IS(indoksil sülfat)sıçanların seviyeleri, tahlilin başında (nefrektomiden bir hafta sonra) ve tahlilin sonunda HPLC ile ölçüldü. Ayrıca tüm gruplardaki hayvanların hematokritleri kaydedildi. Testin sonunda serum kreatinin düzeylerinin varyasyonu önemli ölçüde farklıydı (p<0.05) in="" the="" nef="" and="" lac="" groups,increasing="" 127%and="" 121%,="" respectively,="" when="" compared="" to="" their="" initial="" values(figure="" 1).="" the="" control="" group="" showed="" a="" non-significant="" creatinine="" increase="" of="" only="" 2%.="" the="" increase="" of="" creatinine="" serum="" levels="" in="" the="" nef="" and="" lac="" groups="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" control="" group="" but="" not="" significantly="" different="" between="" the="" nef="" and="" lac="" groups.="" nevertheless,="" all="" three="" groups="" maintained="" their="" creatinine="" levels="" within="" de="" normal="" limits="" for="" these="" rats.="" on="" the="" other="" hand,="" serum="">(indoksil sülfat)seviyeleri, sadece sinbiyotik uygulanmayan nefrektomize (böbrek yetmezliği) hayvanlara karşılık gelen Nef grubunda önemli ölçüde arttı (yüzde 38.8)(p<0.05).>(indoksil sülfat)seviyeleri kontrol grubunda anlamlı olmayan yüzde 0,5'lik bir artış ve Lac grubunda anlamlı olmayan yüzde 0.8'lik bir düşüş gösterdi(Şekil 2). Nefrektomize hayvan grupları karşılaştırıldığında, sinbiyotik (Nef) tüketmeyen grup, önemli ölçüde daha yüksek bir IS seviyesi gösterdi.(indoksil sülfat)sinbiyotik (Lac) tüketen grupla karşılaştırıldığında. Lac grubu ile kontrol grubu arasında anlamlı bir fark yoktu. Kreatinin ve IS arasındaki olası bir ilişkiyi araştıran verilerin analizi(indoksil sülfat)seviyeleri, bu korelasyonun mevcut olmadığını gösterdi (Ek Malzemeler: Şekiller S1-S3). Son olarak, hematokrit sonuçları üç grup arasında önemli bir farklılık göstermedi (Şekil 3).
Şekil 1. (a) 16 haftalık sinbiyotik uygulamasının başında ve sonunda Sprague-Dawley sıçanlarının serum kreatinin seviyeleri. (b) Yüzde 95 Tukey eşzamanlı güven aralıkları ile nihai kreatinin konsantrasyonları için ortalamaların farklılıkları (Bir aralık sıfır içermiyorsa, karşılık gelen ortalamalar önemli ölçüde farklıdır). Nef: sinbiyotik almayan nefrektomize sıçanlar, Lac: sinbiyotik alan nefrektomize sıçanlar, Kontrol: sham-nefrektomize sıçanlar.
Şekil 2.(a) Serumindoksil sülfat(IS) 16 haftalık sinbiyotik uygulamasının başında ve sonunda Sprague-Dawley sıçanlarının seviyeleri. (b) Nihai IS için ortalamaların farklılıkları(indoksil sülfat)yüzde 95 Tukey eşzamanlı güven aralıkları ile konsantrasyonlar(Bir aralık sıfır içermiyorsa, karşılık gelen ortalamalar önemli ölçüde farklıdır). Nef: sinbiyotik almayan nefrektomize sıçanlar, Lac: sinbiyotik alan nefrektomize sıçanlar, Kontrol:sham-nefrektomize sıçanlar.
2.4.Histolojik Analiz Sibiyotik Uygulamasının KBH'nin İlerlemesini Azalttığını Gösterdi
Deneyin sonunda farelere ötenazi uygulanarak soldan numune alındı.böbreklerve histolojik analiz için işlenecek kalpler. Fibrotik alan, hasarlı (yani fibrotik) alan yüzdesini hesaplamak için Image-Pro Plus 30 (Media Cybernetics, Rockville, MD, ABD) bilgi aracı kullanılarak Masson'un trikrom (MT) boyamasıyla belirlendi. (Tablo 2) ve iki foton uyarma mikroskobu ile, iki foton emisyonu ile kollajeni tespit eden ve kollajenin ikinci bir harmonik üretmesine neden olan bir yöntem, konfokal mikroskopi ile organizasyona yakın belirli bir görüntü elde edilerek görselleştirilebilir ve kollajenin doku içindeki dağılımı. MT boyası ile değerlendirilen böbreklerin fibrotik alanlarını karşılaştırırken, snbiyotik uygulanan snbiyotik uygulanan snbiyotik uygulanan snbiyotik alanların Nef grubunda yüzde 25, Lac grubunda ise sadece yüzde 12 daha büyük olduğunu gözlemlemek mümkün oldu. nefrektomize kontrol hayvanları. Bu boyama prosedürü ile gözlenen lezyonlar, Nef ve Lac gruplarının hayvanlarının Bowman kapsülünün parietal tabakasında ve proksimal ve distal kıvrımlı tübüllerin bazal membranında yer aldı. Sinbiyotik uygulanmayan hayvanlar da dahil olmak üzere Nef grubu durumunda, fibrotik doku gelişimi ile birlikte kıvrımlı tübüllerin hücrelerinin sitoplazmasında bir kayıp gözlendi. Böbrek dokuları iki foton eksitasyon mikroskobu ile analiz edildiğinde, ağ tipi bir konformasyona sahip tüm numunelerde kollajen gözlendi. Nef ve Lac grupları, sadece bir fibrotik alanın bulunduğu kontrol grubuna göre daha fazla lezyon gösterdi (Resim 4). İki foton eksitasyon mikroskobu altında gözlemlendiğinde hiçbir örnekte renal korpüsküllerde lezyon bulunmadı.
Tablo 2.Masson'un trikrom boyamasında fibrotik alan yüzdesiböbrekhistolojik bölümler. Sonuçlar ortalama artı standart hata olarak ifade edilir.
 |  |
| Figür 3.16 haftalık sinbiyotik uygulamasının sonunda Sprague-Dawley sıçanlarının hematokrit değerleri. Nef: sinbiyotik almayan nefrektomize sıçanlar, Lac: sinbiyotik alan nefrektomize sıçanlar, Kontrol:sham-nefrektomize sıçanlar. | Şekil 4.Sprague-Dawley sıçanlarının böbreklerinin histolojik kesitleri.(AC):Masson'un nefronların trikrom boyası. Fibrotik alanlar mavi renkte (oklar) görülmektedir.(DF): iki foton uyarma mikroskopisi ile aynı doku gözlemlenmiştir. Fibrotik doku yeşil renkte görülür. Nef: sinbiyotik almayan nefrektomize sıçanlar, Lac: sinbiyotik alan nefrektomize sıçanlar, Kontrol:sham-nefrektomize sıçanlar. Ölçek çubuğu∶ AC） mikrografları için 100 μum ve （DF） mikrografları için 50 μm. |
2.5.Sinbiyotik Uygulaması Kardik Fibrozisi Azaltmadı
Kalpte, MT boyası, nefrektomize sıçanların dokusunda fibrotik alanların varlığını gösterirken, bu alanlar kontrol hayvanlarında yoktu. Sıçanlarda CKD'nin indüklenmesi, nefrektomize sıçanlarda sinbiyotik tedavinin uygulanmasıyla önlenemeyen kardiyak fibrozise neden olur (Şekil 5).
Şekil 5.Sprague-Dawley sıçanlarının kalbinin Masson'un trikrom(MT) boyaması.Fibrotik alanlar mavi (oklar) ile boyanmıştır. Nef: sinbiyotik almayan nefrektomize sıçanlar, Lac: sinbiyotik alan nefrektomize sıçanlar. Kontrol:sahte nefrektomi uygulanmış sıçanlar. Ölçek çubuğu 100 um.
