PartⅠ: Tübüler Mitokondriyal AKT1, İskemi Reperfüzyon Yaralanması Sırasında Aktive Edilir ve Kronik Böbrek Hastalığına Yatkınlıkta Kritik Bir Role Sahiptir.
Apr 03, 2023
Soyut
Renal tübüler disfonksiyon, akut böbrek hasarına ve kronik böbrek hastalığına dönüşmesine neden olabilir. Tübüler mitokondri böbrek yetmezliği patofizyolojisi ile ilişkili olmasına rağmen, mekanizma belirsizdir. Burada, iskemi-reperfüzyon hasarının renal tübüllerde akut translokasyonu ve mitokondriyal protein kinaz B'nin (AKT1 olarak da bilinir) aktivasyonunu indüklediğini gösteriyoruz. Mitokondriyal AKT1 sinyalinin akut böbrek hasarı ve müteakip kronik böbrek hastalığının gelişimini önleyebileceğini varsaydık. Bu öngörüyü test etmek için, mitokondri hedefli baskın negatif AKT1 veya yapısal olarak aktif AKT1'in ekspresyonunu indükleyen iki yeni renal tübüle özgü transgenik fare suşu oluşturmak için Cre-Lox stratejisini kullandık. mitokondri hedefli baskın AKT1-negatif farelerde, mitokondriyal AKT1'in inhibisyonu, azotemiyi, tübüler hasarı, renal fibrozisi, glomerülosklerozu ve iskemi-reperfüzyon hasarından sonra hayatta kalmayı olumsuz olarak şiddetlendirdi. Buna karşılık, mitokondri hedefli yapısal olarak aktif AKT1 farelerinde, güçlendirilmiş tübüler mitokondriyal AKT1 sinyali böbrek hasarını azalttı, böbrek fonksiyonunu korudu ve iskemi-reperfüzyon hasarından sonra sağkalımı önemli ölçüde iyileştirdi (sırasıyla yüzde 76,9'a karşı yüzde 20,8). Mitokondriyal AKT1 inhibe edildiğinde, böbrek tübüllerinde bağlanmamış mitokondriyal solunum ve oksidatif streste bir artış bulundu, bu da böbrek yetmezliği patofizyolojisinde mitokondriyal işlev bozukluğunun rolünü destekliyor. Bu nedenle çalışmamız, tübüler mitokondriyal AKT1 sinyal yolunun, böbrek hasarını daha iyi önlemek ve tedavi etmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için yeni bir hedef olabileceğini düşündürmektedir.
Çeviri Bildirimi
Akut böbrek hasarı (ABH) ve ardından kronik böbrek hastalığının (KBH) gelişmesi önemli sağlık sorunlarıdır. Bir transgenik fare modeli geliştirdik ve AKI ve KBH'de proksimal renal tübüler mitokondrilerin AKT aktivasyonunun rolünü belirledik. Renal korumanın bu kurtarma mekanizması, AKI ve KBH'yi daha iyi önlemek ve tedavi etmek için yeni stratejiler geliştirmek için yeni bir hedef olabilir. Gelecekteki çalışmalar, mitokondriyal AKT sinyal yolunun insan böbrek hasarına dahil olduğunu doğrulamalı ve mitokondriyal AKT1 yolunun ilaç hedeflerini araştırmalıdır.
anahtar kelimeler
Mitokondriyal Akt1; İskemi Refüzyon Yaralanması; Akut böbrek hasarı; Kronik böbrek hastalığı;Cistanche özü.
Almak için buraya tıklayınBöbrekler için Cistanche faydaları
giriiş
Akut böbrek hasarı (ABH) ve ardından kronik böbrek hastalığının (KBH) gelişmesi önemli sağlık sorunlarıdır. Şu anda, bu hastalık durumları için spesifik tıbbi tedaviler, kısmen böbrek hasarının altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılmaması nedeniyle sınırlıdır. Böbrek vücuttaki en çok enerji gerektiren organlardan biridir ve aktif taşımayı kolaylaştırmak, uygun elektrokimyasal gradyanları sürdürmek ve sıvı homeostazını düzenlemek için gerekli olan mitokondri, oksidatif fosforilasyon yoluyla hücresel ATP üretiminin birincil kaynağıdır. ATP üretimindeki ve mitokondriyal disfonksiyondaki bozukluklar, artan reaktif oksijen türleri (ROS) üretimine yol açabilir, bu da renal hücre fonksiyonunu bozar ve hücre ölümüne neden olur. Böbrek hastalığı olan hastalarda ve akut ve kronik böbrek hasarına sahip hayvan modellerinde mitokondriyal hasar ve işlev bozukluğu bildirilmiş olsa da, mitokondrinin böbrek hasarındaki patofizyolojik rolü hakkındaki bilgiler eksiktir.
Geliştirilmiş mitokondriyal fonksiyon, iskemi-reperfüzyon hasarını (IRI) önleyebilir. IRI'nin iskemik fazı sırasında, oksijen tükenmesi mitokondriyal solunum zincirinde elektron transferini inhibe eder ve ATP üretimini azaltır. Sonraki sodyum iyonları akışı ve protonların akışı, normal pH'ın geri kazanılmasına yardımcı olur ve hücre içi hacmi eski haline getirerek hücrenin hayatta kalmasını destekleyebilir mitokondriyal transmembran elektrokimyasal gradyanlar ve apoptotik yolların aktivasyonu Bu hücre içi değişiklikler, ilk iskemik hasardan sonra hayatta kalan hücreler için zararlı olabilir.
AKI hastanede yatan hastalarda daha yaygındır ve yeni KBH'nin başlamasını hızlandırabilir, mevcut KBH'yi şiddetlendirebilir ve böbrek ölümüne yol açabilir ABH'den KBH'ye geçişin altında yatan mekanizmalar belirsizdir. Son hayvan çalışmaları, renal tübüler disfonksiyonun ABH'den KBH'ye ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını ve insanlarda ABH'den KBH'ye geçişi yansıttığını göstermektedir. Böbrek hasarını düzenleyen sinyal yolaklarını anlamak, böbrek hasarını hafifletmek ve ABH'nin KBH'ye ilerlemesini önlemek için yeni terapötik hedefler belirlememize olanak sağlayacaktır.
Böbrek hasarı sırasında sitoplazmik sinyal yolları ile mitokondriyal fonksiyon arasındaki bağlantı büyük ölçüde bilinmemektedir. Mitokondriyal fonksiyon, sitoplazmik sinyalleme, diğer organeller ve nükleer yolaklarla yakından bağlantılıdır Laboratuvarımız, oksidatif fosforilasyon komplekslerini düzenleyerek, oksidatif fosforilasyonun etkinliğini artırarak kardiyomiyositleri IRI hasarından korumada önemli bir adım olarak AKT1'in mitokondriye aktivasyonunu ve translokasyonunu tanımlamıştır. ROS'u azaltmak Bununla birlikte, IRI'nin aktifleştirilmiş AKT1'in sitoplazmadan böbrek tübüllerindeki mitokondriye translokasyonunu tetikleyip tetikleyemeyeceği bilinmemektedir. Böbrek hasarına yanıt olarak böbrek tübüllerinde mitokondriyal AKT1 aktive edilebilirse, mitokondriyal AKT1'in akut böbrek hasarı (AKI) ve kronik böbrek hastalığı (KBH) gelişimindeki patofizyolojik rolünü değerlendirmek önemli olacaktır. Burada, mitokondriyal AKT1 sinyalini in vivo olarak modüle eden iki indüklenebilir renal tübüle özgü transgenik fare modeli kullandık ve IRI sırasında AKI ve sonraki CKD gelişimine karşı renal tübüler mitokondriyal AKT1 aktivasyonunun koruyucu rolünü gösterdik.
Cistanche takviyeleri
Sonuçlar
IRI üzerine Renal Tübüllerde Mitokondriyal AKT1'in aktivasyonu
İlk önce IRI'nin renal mitokondride AKT1'i aktive edip etmediğini araştırdık. Bu amaçla, sol renal arteri 30 dakika boyunca bağlayarak ve ardından kontralateral nefrektomi (Nx) yaparak bir renal IRI modeli oluşturduk. İskemik fazı sonlandırmak için sol renal arter ligasyonu tersine çevrildi, reperfüzyon yapıldı ve belirtilen zaman aralığında sol böbrek toplandı.
Renal tübüllerde zenginleştirilmiş renal korteks izole edildi ve mitokondri alt fraksiyonlama ile hazırlandı. Reperfüzyon üzerine mitokondriyal pAKT1 ve AKT1'in bolluğu arttı, bu da aktif AKT1'in mitokondriye translokasyonunu düşündürür (Şekil 1A). Bu, mitokondriyal AKT1'in reperfüzyondan 30-60 dakika sonra önemli ölçüde yükseldiği (Şekil 1A ve B) (n= 11-15) sahte olarak çalıştırılan kontroller veya rezeke edilmiş böbrek kontrolleri ile karşılaştırıldığında miyokardiyumda gözlemlediklerimize benzer. Mitokondriyal pAKT1 de arttı. Bu sonuçlar, IRI kaynaklı aktivasyonun ve AKT1'in renal mitokondriye translokasyonunun olduğunu göstermektedir. IHC boyaması, AKT1'in IRI'den sonra renal tübüllerde fosforilasyonunu doğruladı (Şekil 1C). pAKT1 için arka plan boyama, sahte olarak çalıştırılan kontrollerin renal tübüllerinde minimum düzeydeydi, oysa pAKT1, IRI'den sonra renal tübüllerde önemli ölçüde yükseldi (Şekil 1C ve 1D). Tübüller dışında hiçbir böbrek bölgesinde pAKT1 görülmedi. pAKT1'in tübüllerdeki hücre altı lokalizasyonunu doğrulamak için pAKT1, mitokondriyal belirteçlerle kombinasyon halinde boyandı. IRI'de renal tübüler hücrelerde pAKT1 ve mitokondrinin önemli ortak lokalizasyonu gözlendi (Şekil 1E). Birlikte, bu sonuçlar IRI translokasyonunu ve AKT1'in mitokondriye aktivasyonunu önerir.
Şekil 1. Renal mitokondride AKT1'in iskemi reperfüzyonu kaynaklı akut translokasyonu ve aktivasyonu.
Mitokondride baskın bir negatif AKT'nin indüklenebilir renal tübüle özgü ekspresyonu ile transgenik farelerin üretilmesi
IRI sırasında renal tübüler mitokondriyal AKT1 aktivasyonunun böbreği AKI'den ve müteakip KBH gelişiminden koruduğu hipotezini test etmek için, baskın-negatif AKT1'in tübüler-spesifik mitokondriyal hedeflemesinin tamoksifen (TAM) ile indüklenen ifadesini sağlayan bir transgenik fare modeli oluşturduk. Baskın negatif AKT1 (mdnAKT) ve mitokondriyal hedefleme dizileri, N terminaline eklendi. AKT1 transgenlerinin tamoksifenin koşullu ifadesine pCALNL aracılık etti (bakınız Malzemeler ve Yöntemler). Genom içindeki transgen dizilerinin rasgele entegrasyonuyla ilişkili kafa karıştırıcı etkileri dışlamak için, transgenin tek bir kopyası, bir kromozom üzerindeki Gt(ROSA) 26 veya lokusunda hedeflenen transgenlerle ES hücrelerinde homolog rekombinasyon yoluyla dahil edildi. İki genli fareler (KMDAKT), mdnAKT farelerinin tam kaynaklı olarak hemizigoz KSP-CreERT2 fareleri ile çaprazlanmasıyla elde edildi; burada tam kaynaklı Cre aktivitesi, renal tübüler hücreye özgü kalmodulin 16 promotörleri tarafından yönlendirildi. tam enjeksiyon, Cre aktivitesini, izole edilmiş mitokondriyi ve immünoblotlama için SDS-PAGE ile ayrılmış mitokondriyal proteinleri indükledi. Sonuçlar, TAM'ın mutant AKT1 ekspresyonunu başarıyla indüklediğini gösterdi. Mutant protein, KMDAKT farelerinde, KSPCreERT2 farelerinde ve vahşi tip farelerde (mısır yağı enjeksiyonu) saptanamadı.
Böbreğe özgü ekspresyonu doğrulamak için, TAM enjeksiyonundan sonra farklı dokulardan mitokondriyal proteinler çıkarıldı. etiketli mutant AKT1, yalnızca böbrekte ifade edildi. Böbrek bölümleri, immünofloresan görüntüleme için anti-his-tag antikorları ve mitokondriyal Mitotracker ile boyandı. Sonuçlar, tüm AKT1 mutantlarının His-tag antikoru ile boyandığını ve mitokondride lokalize olduğunu gösterdi. Glomerüllerde AKT1 mutasyonu saptanmadı. Mitokondriyal AKT1'in enzimatik aktivitesi, tam işleme tabi tutulmuş KMDAKT tübüllerinin mitokondrilerinde önemli bir negatif rolü doğrulamak için rekombinant GSK3 kullanılarak analiz edildi. Renal tübül mitokondriyal AKT1, IRI tarafından aktive edildiğinden, IRI'den sonra tam tedavi edilmiş farelerden ve mısır yağı ile tedavi edilmiş farelerden izole edilen mitokondride AKT1'in enzimatik aktivitesini karşılaştırdık. Sonuçlar, renal mitokondriyal AKT1 aktivitesinin, TAM ile tedavi edilen KMDAKT farelerinde önemli ölçüde inhibe edildiğini gösterdi. Bu nedenle, bu transgenik fare çizgisi, AKT1'in tübüler mitokondrideki rolünü incelemek için iyi bir modeldir.
Cistanche faydaları
Renal tübül mitokondriyal AKT'nin in vivo olarak ağırlaştırılmış IRI'yi inhibisyonu
Tek taraflı renal iskemide IRI indüklendi. Son deney dizisinde, fosforile edilmiş AKT1, proksimal renal tübüllerin mitokondrilerinde zar zor saptanabildi. Mısır yağı enjekte edilmiş ve tam enjekte edilmiş KMDAKT farelerinde böbrek histolojisi, kan üre nitrojeni (BUN) ve serum kreatinininde (Cr) önemli bir fark gözlenmedi; IRI indüksiyonundan önce. Mitokondriyal AKT1'in IRI sırasında koruyucu bir rol oynayıp oynamadığını araştırmak için mısır yağı farelerinde veya TAM-KMDAKT farelerinde AKI'yi indüklemek için tek taraflı IRI kullanıldı. IRI indüksiyonundan hemen sonra elde edilen BUN veya Cr seviyelerinde fark yoktu, ancak TAM-KMDAKT farelerinde hem BUN hem de Cr seviyeleri 45 gün sonra önemli ölçüde yükseldi. Bu sonuçlar, IRI sırasında renal tübüllerde mitokondriyal AKT1'in bloke aktivasyonunun, böbrek fonksiyon bozukluğunun geç gelişimini şiddetlendirdiğini göstermektedir. H&E lekeli böbrek bölümlerinin histolojik analizi, TAM-KMDAKT farelerinde böbrek hasarının şiddetlendiğini gösterdi. Jablonski'nin renal tübüler yaralanma skoru, tübüler fırça kenarının kaybı, tübüler lizis ve tübüler lümende daha fazla birikinti ile daha yüksekti (p=0.018). TAM veya Cre rekombinazın etkisini dışlamak için TAM enjekte edilmiş KSP/CreERT2 farelerini de analiz ettik ve Jablonski puanları, IRI'den sonraki 7. günde mısır yağı KMdakt ve TAM-KSP/CreERT2 farelerinde benzerdi (Şekil 3D) (p{{ 19}}.7613). Bu veriler, bulgularımızın TAM veya Cre rekombinazın etkileriyle karıştırılmadığını göstermektedir. IRI'den sonra TAM-KMDAKT farelerinde, Masson trikrom boyaması daha yüksek fibrotik alan (yüzde) (p<0.001) gösterdi, buna intralüminal silendirler ve birikintiler içeren düzensiz tübüler yapılar eşlik etti. col1a ifadesi, Masson trikrom boyaması ile uyumlu olarak arttı. tGF ekspresyonu artmadı, bu da mitokondriyal AKT1'in enflamatuar yanıtı düzenlemediğini düşündürüyor. IRI'den sonra, TAM-KMDAKT grubunda tübüler hasar belirteci KIM -1 ifadesi arttı, bu da TAM-KMDAKT grubunda böbrek hasarının arttığını doğruladı (p=0.002).
Renal hücre apoptozisini değerlendirmek için TUNEL boyaması kullanıldı. TAM-KMDAKT farelerinin tübüllerinde (p{{0}}.0054) ve glomerüllerinde (p<0.001) apoptotik hücre sayısı, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında önemli ölçüde arttı. IRI sırasında tübüler mitokondriyal AKT1'in inhibisyonunun tübüler hücre ölümünü ve glomerüler hasarı şiddetlendirdiği ileri sürülmektedir. Bununla uyumlu olarak, TAM-KMDAKT renal tübüler epitel hücrelerinde hem kaspaz 9'un (promotör) hem de kaspaz 3'ün (yürütücü) aktivasyonu önemli ölçüde arttı. Kronik glomerüler değişiklikleri daha fazla araştırmak için, glomerülosklerozu ölçmek için böbrek kesitlerinde periyodik asit-Schiff (PAS) boyama analizi yapıldı. IRI'den 7 gün sonra glomerülosklerozda bir fark görülmese de (p=0.2634), IRI'den 45 gün sonra TAM-KMDAKT farelerinde daha fazla glomerüloskleroz bulundu (p<0.001). Bu bulgu, renal tübüler mitokondriyal AKT sinyal yolunun, KBH gelişimi sırasında glomerüler skar oluşumunu düzenleyebileceğini düşündürmektedir. Kaplan-Meier hayatta kalma analizi, tübüler mitokondriyal AKT'nin inhibisyonunun IRI sonucu üzerindeki etkisini gösterdi. Kontrollere kıyasla TAM-KMDAKT farelerinde IRI'den sonra sağkalım azaldı (p=0.0013).
TAM-KMDAKT farelerinin hayatta kalma oranı, IRI'den sonraki 7 gün içinde kontrollerinkinden önemli ölçüde düşüktü, ancak bu dönemde TAM- ve mısır yağı-KMDAKT farelerinin BUN/Cr seviyeleri benzerdi. TAM ile tedavi edilen farelerde bildirilen BUN/Cr değişiklikleri, ölü farelerden alınan BUN/Cr verilerinin bulunmaması nedeniyle hafife alınmış olabilir. Ek olarak, TAM-KMDAKT farelerinde daha yüksek mortalite, sadece BUN/Cr değişikliklerinden ziyade uzak organ disfonksiyonundan (akciğer, kalp, beyin) kaynaklanabilir.
Tübüler mitokondriyal AKT1'in rolü dişi KMDAKT farelerinde de değerlendirildi. serum BUN/Cr ve renal histoloji, IRI'den 45 gün sonra TAM-KMDAKT dişi farelerde nispeten daha yüksekti. Önemli bir cinsiyet etkisi gözlenmedi.
Bitkisel Cistanche
REFERANSLAR
1. Yang JY, Deng W, Chen Y ve diğerleri. Diyabetik miyokardda mitokondriyal Akt1'in bozulmuş translokasyonu ve aktivasyonu mitokondriyal oksidatif fosforilasyon Kompleksi V aktivitesini hafifletti. J Mol Hücreli Kardiol. 2013;59:167–175.
2. Wang Z, Ying Z, Bosy-Westphal A ve ark. Yetişkinlik boyunca ana organ ve dokuların spesifik metabolik hızları: dinlenme enerji harcamasının mekanik modeli ile değerlendirme. Ben J Clin Nutr. 2010;92(6):1369–77.
3. Li SY, Susztak K. Böbrek Hastalığında Peroksizom Proliferatörü ile Aktive Edilen Reseptör Gama Koaktivatörü 1alfa'nın (PGC{3}}alfa) Rolü. Semin Nefrol. 2018;38(2):121–6.
4. Portilla D, Dai G, McClure T ve ark. Sisplatin kaynaklı akut böbrek yetmezliğinde PPARalfa ve koaktivatörü PGC-1 değişiklikleri. böbrek uluslararası 2002;62(4):1208–18.
5. Forbes JM. Böbrek Fonksiyonunda Mitokondri-Güç Oyuncuları? Trendler Endokrinol Metab. 2016;27(7):441–4425.
6. Szeto HH, Liu S, Soong Y ve ark. İskemik koşullar altında mitokondriyal biyoenerjetiğin iyileştirilmesi böbrekte sıcak iskemi toleransını arttırır. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308(1):F11– F21.6.
7. Kalogeris T, Baines CP, Krenz M, et al. İskemi/reperfüzyon hasarının hücre biyolojisi. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;298:229–317.
8. Gracia-Sancho J, Casillas-Ramirez A, Peralta C. Karaciğeri iskemi/reperfüzyon hasarından korumada moleküler yollar: 2015 güncellemesi. Clin Sci (Londra). 2015;129(4):345–62.
9. Bkz. EJ, Jayasinghe K, Glassford N, et al. Akut böbrek hasarından sonra uzun vadeli olumsuz sonuç riski: konsensüs maruziyet tanımlarını kullanan kohort çalışmalarının sistematik bir incelemesi ve meta-analizi. böbrek uluslararası 2019;95(1):160–72.
10. Szeto HH, Liu S, Soong Y ve ark. Akut İskemiden Sonra Mitokondri Koruması, IL-1beta ve IL-18'nin Uzun Süreli Yükselişini Önler ve KBH'yi Tutuklar. J Am Soc Nefrol. 2017;28(5):1437–49.
11. Tran MT, Zsengeller ZK, Berg AH, et al. PGC1alpha, oksidatif metabolizmayı böbrek korumasına bağlayan NAD biyosentezini yönlendirir. Doğa. 2016;531(7595):528–32.
12. Tait GB, Yeşil DR. Mitokondri ve hücre sinyali. J Hücre Bilimi 2012;125(Pt 4):807–815.
13. Deng W, Leu HB, Chen Y ve ark. Protein kinaz B (PKB/AKT1), mitokondriyal proteinlerle sinyal kompleksleri oluşturdu ve iskemi-reperfüzyon hasarı sırasında kültürlenmiş kardiyomiyositlerde glikolitik enerji işlev bozukluğunu önledi. Endokrinoloji. 2014;155(5):1618–28.
14. Kanegae Y, Lee G, Sato Y ve diğerleri. Bölgeye özgü Cre rekombinazı eksprese eden rekombinant adenovirüs kullanılarak memeli hücrelerinde verimli gen aktivasyonu. Nükleik Asitler Res. 1995;23(19):3816–21.
15. Matsuda T, Cepko CL. İn vivo elektroporasyon tarafından tanıtılan transgenlerin kontrollü ifadesi. Proc Natl Acad Sci ABD A. 2007 1 16;104(3):1027–32.
16. Lee SA, Cozzi M, Bush EL, et al. Akut Böbrek Hasarında Uzak Organ Disfonksiyonu: Bir Gözden Geçirme. Ben J Böbrek Dis. 2018;72(6):846–856.
Hugo YH Lin1,2,3,4, Nefis Chen1, Yu-Han Chen1, Albert P. Ta1,2, Hsiao-Chen Lee1,5, Grant R.MacGregor6, Nosratola D. Vaziri1,2, Ping H. Wang1,2,7
1. UC Irvine Diyabet Merkezi ve Tıp Bölümü, California Üniversitesi, Irvine, California
2. California Üniversitesi, Irvine, California, Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü
3. Tıp Bölümü, Kaohsiung Tıp Üniversitesi, Kaohsiung, Tayvan
4. Dahiliye Bölümü, Kaohsiung Belediye Ta-Tung Hastanesi, Tayvan
5. Plastik Cerrahi Bölümü, Kaohsiung Tıp Üniversitesi, Kaohsiung, Tayvan
6. Gelişim ve Hücre Biyolojisi Bölümü, California Üniversitesi, Irvine, California
7. City of Hope Ulusal Tıp Merkezi, Diyabet, Endokrinoloji ve Metabolizma Bölümü, Duarte, California