İkinci Bölüm|Jia-Jian-Di-Huang-Yin-Zi Kaynatma Dopaminerjik Nöronlar ve Mikroçevreleri Üzerinde Nöroprotektif Etkiler Gösterir

İkinci Bölüm|Cistanche gibi Çin bitkisel ilaçları nasıl sinir koruyucu bir etki yapar ve hafızayı geliştirir?

BİRİNCİ BÖLÜM İÇİN TIKLAYIN

Daha fazla bilgi için lütfen ali.ma@wecistanche.com ile iletişime geçin.

Hafıza için Cistanche özü tozu ve takviyesi için tıklayın

Tartışma

PD'nin mevcut tedavileri esas olarak klinik semptomları hafifletmeyi amaçlar. Potansiyel müdahale yöntemlerinden biri olarak, nörotrofik faktörler, nöronları besleyerek akson rejenerasyonunu teşvik etme rolünü oynar18. azalmanörotrofikfaktörler dopaminerjik nöronların dejenerasyonunu indükleyebilir. Bilim adamları, çeşitli ifadeleri gözlemlemek için 72-79 yaşları arasındaki PD ve PD olmayan hastaların beyin dokularını immüno-lekelediler.nörotrofikfaktörler. Hemen hemen tüm faktörler bir dereceye kadar azaltıldı ve GDNF kaybı en göze çarpan oldu19. Ek olarak, GDNF putamen enjeksiyonu20 ile hastaların motor semptomlarını hafifletti ve dopaminerjik nöronların in vitro21 hayatta kalmasını destekledi. Bu çalışmada, JJDHYZ kaynatma işleminin nörotrofik etkilerini değerlendirmek için BDNF ve GDNF'yi seçtik ve yüksek dozda JJDHYZ'nin GDNF'yi yukarı düzenlemede rol oynadığını gözlemledik. Aslında,nöroprotektif etkilerPD fareler üzerindeki JJDHYZ'in oranı bundan daha fazlaydı. Merkezi sinir sistemi, yüksek oksijen tüketimi, yüksek reaktif oksijen üretimi ve artan nörotoksik metal demirlerinin birikmesi nedeniyle oksidatif strese özellikle duyarlıdır22. Fiziksel olarak, süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx) ve katalaz (CAT) gibi antioksidan enzimler serbest radikalleri katalize eder. Bununla birlikte, dopaminin oto-oksidasyonu ve enzimatik metabolizması, nörotoksik serbest radikallerin ve aşırı oksijen türlerinin üretimine yol açar. Biriken serbest radikaller oksidatif stresi tetikleyerek hücrelerdeki biyolojik moleküllere zarar verir ve hücre ölümüne neden olur23. Ölüm sonrası çalışmalar, doğal antioksidan savunmayı zayıflatan ve nigral nöronların dejenerasyonunu tetikleyen SNPC'de GSH'nin azalmasını ve GSSG'nin artışını ortaya çıkarmıştır24. Hayvan modellerinde, MPTP olarak nörotoksin, serbest radikallerin oluşumunu indükler ve antioksidan enzimlerin yükünü ağırlaştırır25. Bu çalışmamızda MPTP'nin GSH, CAT ekspresyonlarını inhibe ettiğini ve MDA konsantrasyonunu iyileştirdiğini gözlemledik. JJDHYZ, MDA oluşumunu engelledi, özellikle yüksek dozda antioksidan GSH kaybını kurtardı. PD ile ilgili derinlemesine çalışma ile,sinir iltihabıdopaminerjik nöronların seçici kaybıyla da ilişkili olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle mikroglia ve astrositlerin aktivasyonuna terapötik müdahale etkili stratejilerden biri olacaktır. Mikroglia, istilacı patojenlere karşı ilk savunma hattını oluşturan ve CNS yaralanmalarına hızla yanıt veren önemli bağışıklık monitörleridir. Otopsi vakalarının substantia nigra ve striatumunda aşırı mikroglia ve astrositler gözlenmiştir26. Aktive edilmiş mikroglia ve astrositler ROS27 üretir ve proinflamatuar sitokinleri, kemokinleri ve diğer proteinazları28 serbest bırakır. Ailesel veya sporadik PD29'lu hastaların beyin omurilik sıvısında IL-1, IL-2, IL-6 ve TNF- seviyeleri artar. MPTP ve 6-OHDA ile indüklenen hayvan modellerinde de benzer gözlemler rapor edilmiştir. Bu salgılanan faktörler, nöronal ortamda değişimleri teşvik eder ve nöronal ölüme yatkınlığı arttırır30,31. SN'de aktive edilmiş astrositleri tespit etmek için GFAP'yi TH ile iki katına çıkardık. Bu arada, mikroglia'yı etiketlemek için iki biyobelirteç kullandık. İyi bilinen biyobelirteç Iba-1'nın yanı sıra, transmembran protein 119 (Tmem119) adlı diğer yeni hücre yüzeyi, mikrogliaya özgü belirteç kullanıldı32. Sonuçlar, önemli bir TH-pozitif kaybı gösterdi.

model grubundaki artan sayıda glial hücre ile birlikte hücreler (Şekil 3). JJDHYZ-H tedavisi DA kaybını engelledinöronlarve yıkıcısinir iltihabı.

Yukarıda bahsedilen sonuçlar aracılığıyla, öncelikle JJDHYZ'in PD fareleri üzerinde nöroprotektif etkileri olduğu sonucunu çıkarıyoruz. Ancak mekanizmalar hala belirsizdi. Dopaminerjik nöronların hayatta kalması mikroçevreye bağlı olduğundan, aralarındaki potansiyel bağlantılarnöronlarve NVU bizi en çok cezbetti, bu nedenle JJDHYZ'nin NVU üzerindeki düzenlenmiş etkilerini daha da araştırdık.

NVU esas olarak endotel hücreleri, perisitler, astrositler, mikroglia ve vasküler düz kas hücreleri dahil olmak üzere nöronlardan ve nöronal olmayan hücrelerden oluşur. BBB anahtar bileşendir. İlk olarak, BBB'deki ultrastrüktürel değişiklikleri TEM ile gözlemledik. Normal mikrodamarlar, sürekli bazal lamina, astrositik uç ayaklar ve bir transmisyon elektron mikroskobu altında açıkça görülebilen normal endotelyal hücrelerden oluşuyordu. Bununla birlikte, MPTP ile indüklenen modelde, normal yapılar, bunun yerine şişmiş endotel hücreleri ve astrositik uç ayaklar, yenilmiş kapiler lümenler ve ödem ile olmuştur (Şekil 4B). JJDHYZ-H, astrositik uç ayakların şişmesini hafifletti. Sürekli bazal membranlı ve endotel bütünlüğü olan mikrodamarlar da gözlendi (Şekil 4C). Anjiyogenez, PD33'ün patofizyolojisinde yer alan önemli bir mekanizmadır. PD ve parkinson primatları olan hastaların SNPC'sinde ölüm sonrası artan sayıda endotelyal hücre çekirdeği ve kan damarı bildirilmiştir. CD31'deki artış, kan-beyin bariyerinin bozulması vesinir iltihabı11,34,35. Örneğin, TNF nakavtlı MPTP ile indüklenen fareler, BBB36'nın bozulmasını önlemek için daha olasıydı. Burada, bu tedaviyi derinlemesine araştırmak için BBB, nöronlar ve glial hücreleri bir arada inceledik. Mikrodamarlar bir anti-CD31 antikoru ile etiketlendi ve model grubunda daha fazla CD31-pozitif mikrodamar bulundu (Şekil 6, P<0.05), which="" is="" in="" accordance="" with="" the="" reports="" of="" angiogenesis="" in="">

Mikrodamarlar, damarların içindeki ve dışındaki madde alışverişini düzenler ve CNS'yi korumak için doğal bir bariyer oluşturur. Sıkıca bağlı olan sıkı bağlantı proteinleri, hücre boşluğundan eksojen maddelerin girişini kısıtlamak için yüksek seçiciliğe sahiptir. İmmün boyama yoluyla SNPC'de okludin ve claudin-5 ifadesini tespit ettik (Şekil 5). MPTP, bu iki sıkı bağlantı proteinini tüketirken, JJDHYZ-H ile tedavi edilen farelerdeki proteinler, normal gruptakilerden önemli ölçüde farklı değildi. Sıkı bağlantılara ek olarak, MMP'lerin değişimleri de BBB38'in işlevini etkiler. Bu çinko bağımlı enzimler, sıkı bağlantı protein değişikliklerinin anahtar aracılarıdır ve NVU39'daki bazal lamina dahil olmak üzere hücre dışı matris üzerinde proteolitik aktivite sergilerler. Nöroinflamatuar koşullar altında, MMP3 ve MMP9 ilk olarak inflamatuar hasara yanıt olarak salgılanır ve MMP2, CNS40'ta konakçı yaralanması üzerine aktive olan bir zimojen formunda salgılanır. Bu MMP'lerin üçü de sıkı bağlantı proteinlerini parçalar. Occludin, MMP'ler tarafından saldırıya açıktır, MMP-2 ve MMP-9 iskemik hakaretten sonra claudin'i-5 bozar41. MMP'ler ayrıca, BBB yıkımına katkıda bulunan bir iskemik hasardan sonra fibronektin, laminin ve heparan sülfat gibi bazal lamina proteinlerini de düşürür42,43. Birkaç rapor, MMP'lerin apoptoza dahil olduğunu iddia etti. Ölü DA nöronları, mikroglial aktivasyonu daha da indükleyen in vitro MMP3'ü serbest bırakır44. MMP2, MMP3 ve MMP9'u floresanla boyadık ve bu MMP'lerin üçünün de ekspresyonlarının model grubunda arttığını belirledik (Şekil 7). JJDHYZ-H, muhtemelen MMP'lerin aktivasyonunu inhibe ederek, claudin-5 ve oklüzyon ifadesini sürdürdü.

Bağışıklık faktörlerinin mikro çevresel değişikliklerini incelemek için yayınlanmış makalelerden her biri mikroglia ve astrositlerle yakından ilişkili 29 faktör seçtik. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, model grubunda CCL2, CCL4 ve IL-23 aşağı regüle edildi. JJDHYZ yüksek dozda MPTP'nin CCL2, CCL4 ve IL üzerindeki inhibitör etkilerini tersine çevirdi-23 (Şekil 8). MPTP tarafından indüklenen bir akut PD modelinde artan CCL2-mRNA ekspresyonu rapor edilmiştir ve CCL2 ayrıca CCL4 ekspresyonunu indükleyebilir; bununla birlikte, SNpc nöronal kaybı, CCL2-nakavt farelerde45 önemli ölçüde azalmaz. PD'de CCL2'nin rolü hala belirsizdir. IL-23 miyeloid hücreler tarafından üretilir ve immün aracılı hastalıklarda hedefe yönelik tedaviler için anahtar sitokinlerden biri olarak kabul edilir46,47. Daha önceki raporlara dayanarak, CCL2 ve CCL4'ün, hastalık modellerinde inflamasyonu teşvik ettiği düşünülüyordu.Alzheimer hastalığı, IL23 ise iltihabı inhibe eder. Bu paradoksal mınöroprotektif etkilerJJDHYZ'in? PD'de bu sitokinlerin rolü belirsiz olduğundan, altta yatan mekanizmaların araştırılması gerekir. JJDHYZ'in CCL2, CCL4 ve IL23'ü yukarı regüle etmesinin nedeni hala araştırılıyor ve sonuçları gelecekte paylaşacağız.

Malzemeler ve yöntemler

Etik beyanı.

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitülerinden Laboratuar Hayvanlarının Bakım ve Kullanım Kılavuzuna göre yapılmıştır. Fudan Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Komitesi tüm prosedürleri onayladı.

Hayvanlar. 22-25 g ağırlığında (8-10 haftalık) erkek c57BL/6 fareleri, yüzde 60 nemli ve 12-saat aydınlık/karanlık döngüsüne sahip, sıcaklık kontrollü bir ortamda (sabit sıcaklık 22±3 derece) barındırıldı. . Yiyecek ve su ad libitum olarak mevcuttu.

JJDHYZ'in hazırlanması.

Te JJDHYZ kaynatma yedi ham bitkiden oluşur: Radix Rehmanniae, Fructus Corni, Radix Morinda Officinalis, Herba Cistanches, Radix Angelicae Sinensis, Radix Asparagi ve Radix Paeoniae Alba 1:0.6:1 oranında: 1:1:1:1 (bitkilerle ilgili ayrıntılar Tablo 2'de görülebilir). Tüm bitkisel bileşenler, Fudan Üniversitesi, Zhongshan Hastanesinden satın alındı. Tüm ham otlar önce 30 dakika damıtılmış suya daldırıldı ve 1 saat kaynatıldı ve süspansiyon toplandı. Daha sonra bitkisel kalıntılara distile su ilave edilmiş ve işlem iki kez tekrarlanmıştır. Toplanan süspansiyona, yüzde 75 alkol (h/h) nihai konsantrasyonuna kadar susuz alkol ilave edildi. Tortular, süspansiyonu toplamak için 24 saat boyunca yüzde 75 etil alkolde ıslatıldı. Tortulardan elde edilen süspansiyon ve sıvı karıştırıldı ve 2,{15}} g'de 20 dakika santrifüjlendi. Alkol, döner bir buharlaştırıcı ile tamamen uçucu hale getirildi. JJDHYZ kaynatma işleminin nihai konsantrasyonu, 1 g/ml (a/h) idi.

JJDHYZ'nin kimyasal bileşikleri.

Te JJDHYZ, rubiadin (PubChem CID: 124062), paeoniforin (PubChem CID: 442534), albiforin (Pubchem CID: 24868421), ferulik asit (Pubchem CID: 445858), catalpol (Pubchem CID: 91520), verbascose (Pub1434 CID) içerir. ), sistanosid D (PubChem CID: 5315930), echinaco tarafı (PubChem CID: 5281771), rehmanniosit A ​​(PubChem CID: 6325881), rehmanniosit D (PubChem CID: 92044472) ve ursolik asit (PubChem CID: 64945).

Çalışma tasarımı.

C57BL/6 farelerine 14 gün boyunca oral olarak salin, JJDHYZ veya selegilin uygulandı ve ardından intraperitoneal salin veya MPTP enjeksiyonu (5 gün boyunca 30mg/kg/gün) uygulandı. Fareler rastgele aşağıdaki altı gruba ayrıldı: (1) kontrol grubu: tuzlu su enjeksiyonu artı tuzlu gastrointestinal uygulama; (2) MPTP grubu: MPTP enjeksiyonu artı salin; (3) JJDHYZ-düşük dozaj grubu (JJDHYZ-L): MPTP enjeksiyonu artı JJDHYZ 8.5 g/kg/gün; (4) JJDHYZ-orta dozaj grubu (JJDHYZ-M): MPTP enjeksiyonu artı JJDHYZ 17 g/kg/gün; (5) JJDHYZ-yüksek dozaj grubu (JJDHYZ-H): MPTP enjeksiyonu artı JJDHYZ 34 g/kg/gün; ve (6) selegilin grubu: MPTP enjeksiyonu artı selegilin 1.0 mg/kg/gün48. MPTP tozu ve selegilin, salin içinde çözündürüldü.

İmmünohistokimya.

SNpc'nin bölümleri (Bregma'dan −3.64mm~−2.92mm) her fareden elde edildi. Kesitlerin mumu alındı, hidratlandı ve fosfat tamponlu salin (PBS) (5dk x 3) ile yıkandı ve daha sonra sitrik asit tamponunda (pH 6,0) ​​antijen alımı gerçekleştirildi. Endojen peroksidaz aktivitesi, yüzde 3'lük bir hidrojen peroksit-metanol tamponu ile bloke edildi. 1 saat oda sıcaklığında yüzde 10 keçi serumu ile inkübasyonun ardından, kesitler bir anti-okludin antikoru (ab168986, Abcam) ile 4 derecede gece boyunca inkübe edildi. Daha sonra, bir yaban turpu peroksit (HRP) ikincil antikoru (keçi anti-tavşan, A0208, Beyotime) kullanılarak immün etiketlemeye devam edildi. İmmünopozitif hücreler, fare başına SN bölgesinin 5 slaytından sayıldı ve ortalaması alındı. Grup başına 3 hayvan kullanıldı. Tüm pozitif hücre sayıları, Image-Pro Plus 6.0 yazılımı (Media Cybernetics, ABD) kullanılarak 40 büyütme altında SNpc'de sayıldı.

İmmünofloresan.

SNpc'nin donmuş bölümleri, 20 dakika boyunca aseton içinde sabitlendi, metanol içinde yüzde 3 hidrojen peroksit ile muamele edildi ve daha sonra yüzde 10'luk bir keçi serumu bloke etme çözeltisi ile inkübe edildi. Daha sonra kesitler, aşağıdaki hedef proteinlere karşı antikorlarla 4 derecede gece boyunca inkübe edildi: BDNF (ab108319, Abcam), GDNF (ab18956, Abcam), Iba-1 (#019–19741, uyandı, Japonya), Tmem119 (ab209064, Abcam), claudin-5 (ab15106, Abcam), MMP2 (ab92536, Abcam), MMP3 (ab53015, Abcam) ve MMP9 (ab76003, Abcam). İkincil antikor olarak bir Cy3-konjuge keçi anti-tavşan antikoru (A0516, Beyotime) kullanıldı. Çekirdekler DAPI (C1005, Beyotime) ile zıt boyandı. Pozitif boyanmış hücrelerin görüntüleri, bir floresan mikroskobu (Olympus BX51, Japonya) kullanılarak yakalandı. Kantifikasyon yöntemi immünohistokimya ile aynıydı.

Kantitatif RT-PCR analizi.

SNpc dokularından toplam RNA, üreticinin talimatlarına göre TRIzol reaktifi (T9424, Sigma) kullanılarak ekstre edildi. mRNA'nın konsantrasyonu ve kalitesi spektrofotometrik olarak belirlendi. Ters transkripsiyon reaksiyonları, bir SYBR Premix Ex Taq II Kiti (RR820, Takara) kullanılarak Applied Biosystems 7500 Real-time PCR Detection System üzerinde PrimeScript RT reaktif kiti (RR047, Takara) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. GAPDH, GDNF ve BDNF için aşağıdaki primerler kullanıldı: GAPDH: 5′-GGT TGT CTC CTG CGA CTT CA-3′ ve 3′-CCT CAT TCT TTG GGA CCT GGT-5′; BDNF: 5′-GAG GTC TGA CGA CGA CAT CA-3′ ve 3′-GTC AGT TCA CGG AA A CCT CG-5′; ve GDNF:5′-CAA TGG ATT CAT ACC CTG-3′ ve 3′-TCC AGA TAA TGT AGG TCG T-5′. Tüm numuneler üç kopya halinde değerlendirildi ve 2−ΔΔCT nispi niceleme için ortalama değerler kullanıldı.

Western blot analizi.

Western blot analizi, daha önce bildirildiği gibi yapıldı49. Te SNpc dokuları buz gibi soğuk bir plaka üzerine çıkarıldı, fosfataz inhibitörleri ile bağlantılı RIPA ve PMSF içeren bir karışımla lize edildi ve daha sonra 4 derecede 20 dakika boyunca 13.500 rpm'de santrifüjlendi. Eşdeğer miktarda protein, SDS-PAGE jelleri ve PVDF membranları kullanılarak ayrıldı. Zarlar, 1 saat boyunca oda sıcaklığında yüzde 5 yağsız süt ile bloke edildi ve daha sonra gece boyunca GDNF (1:1,000) ve BDNF (1:1,000)'e karşı birincil antikorlarla inkübe edildi. . Daha sonra, membranlar tavşanlara karşı HRP ile konjuge bir antikor ile inkübe edildi (seyreltme 1:1,000). İmmünoreaktif bantlar, geliştirilmiş kemilüminesans (P0018, Beyotime) kullanılarak saptandı ve Image J yazılımı kullanılarak nicelendirildi.

Enzim bağlantılı immünosorbent tahlil ölçümü.

Lipid peroksidasyonu son ürünü MDA (Katalog #K739, BioVision, ABD) ve antioksidatif enzimler SOD (Katalog#K335, BioVison), CAT (Katalog #K773, BioVision) ve GSH (Katalog #K261, BioVision) kullanılarak tespit edildi. Üreticinin talimatlarına göre ELISA kitleri.

BBB'nin ultrastrüktürel değişiklikleri.

Farelere derin anestezi uygulandı ve ardından soğuk PBS ile transkardiyal olarak perfüze edildi. SNpc dokuları çıkarıldı ve 1-mm3 segmentlere ayrıldı. Numuneler, 2 saat boyunca yüzde 2.5 glutaraldehit ve yüzde 1 osmiyum ile sonradan sabitlendi, ardından dereceli bir etanol serisinde dehidrasyon ve reçine gömme işlemi yapıldı. Ultra ince kesitler bir mikrotom kullanılarak dilimlendi, yüzde 3 uranil asetat-kurşun sitrat ile boyandı ve ardından bir TEM (PHILIPS CM-120) ile gözlemlendi.

BBB geçirgenliğinin değerlendirilmesi. BBB

geçirgenlik, daha önce tarif edildiği gibi, kuyruk damarı enjeksiyonundan sonra Evans Blue'nun (E2129, Sigma) beyne sızmasıyla değerlendirildi50. Kısaca, normal tuzlu su içinde yüzde 2 Evans Blue, hayvanlara ötenazi uygulanmadan 1 saat önce enjekte edildi. Farelere derin anestezi uygulandı ve transkardiyal olarak normal tuzlu su ile perfüze edildi. SNpc dokuları parçalandı ve formamid (100mg/ml) içinde 60 derecede 24 saat kuluçkalandı, ardından 1,{8}} rpm'de 5 dakika santrifüjlendi. Süpernatanlar toplandı ve dokuların absorpsiyonu, Evans Blue'nun standart eğrisine dayalı olarak 620 nm dalga boyunda bir lüminesans spektrometresi kullanılarak saptandı.

İstatistiksel analiz.

Veriler, tek yönlü bir varyans analizi (ANOVA) kullanan SPSS 22.0 yazılımı ve post hocleast anlamlı fark (LSD) testi kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar, çoklu grup karşılaştırmaları için ortalama±standart hata olarak ifade edildi. Farklar, yalnızca P değeri 0.05'ten küçük olduğunda istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi (P<>