Bölüm 1: 3-Hidroksifenilasetik Asit: Kan Basıncını Düşüren Bir Flavonoid Metaboliti

İletişim:tina.xiang@wecistanche.com

Soyut: Düzenli olarak polifenolden zengin gıda alımının önlenmesi de dahil olmak üzere çok çeşitli faydalı sağlık etkileri ile ilişkilendirilmiştir.kardiyovasküler hastalıklar. Ancak, ebeveynflavonoidler çoğunlukla düşük biyoyararlanıma sahiptir ve bu nedenle metabolitlerinin biyoaktif olduğu varsayılmıştır. Bu metabolitlerden biri olan 3-hidroksifenil asetik asidin (3-HPAA), bağırsak mikrobiyotası tarafından oluşturulan, daha önce ex vivo vazorelaksan etkiler gösterdiği bildirilmişti. Bu çalışmanın amacı, bu etkiye in vivo olarak daha fazla ışık tutmak ve etki mekanizmasını aydınlatmaktı. 3-HPAA, spontan hipertansif sıçanlara hem bolus hem de infüzyon olarak iv uygulandığında arteriyel kan basıncında doza bağlı bir düşüşe neden oldu. Buna karşılık, kalp hızında önemli bir değişiklik gözlenmedi. Laboratuar hayvanlarına olan ihtiyacı azaltmak için bir mezbahadan alınan domuz kalplerinin kullanıldığı ex vivo deneylerde, 3-HPAA, kısmen endotel bütünlüğüne bağlı bir mekanizma yoluyla önceden kasılmış domuz koroner arter segmentlerini gevşetmiştir. Bu gevşeme, endotelyal nitrik oksit sentaz inhibisyonundan sonra önemli ölçüde bozulmuştur. Buna karşılık, SKCa veya IKCa kanallarının veya muskarinik reseptörlerin blokajı, 3-HPAA gevşemesini etkilemedi. Benzer şekilde, 3-HPAA'nın siklooksijenaz veya L tipi kalsiyum kanalları üzerinde hiçbir etkisi gözlenmedi. Böylece, 3-HPAA azalırtansiyondamar gevşemesi yoluyla in vivo ve bu mekanizma, endotel tabakası tarafından nitrik oksit salınımına dayalı olabilir.

anahtar kelimeler: flavonoidler; bağırsak mikrobiyotası;metabolit;3-hidroksifenilasetik asit;kan basıncı;vazorelaxation; koroner; arter; fare; domuz

1. Giriş

Kardiyovasküler hastalık, dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve tahmini ölüm sayısı yılda 18 milyona yaklaşmaktadır. Koroner arter hastalığı ve inme, bu ölümcül kardiyovasküler olayların yaklaşık yüzde 85'ine katkıda bulunur [1]. Küresel mortalite ve morbidite, kardiyovasküler risklerin önlenmesine yönelik kılavuzların uygulanmasını teşvik etmiştir [2]. Devam eden tedavi ile kalıcı yüksek arteriyel kan basıncının saptanması ana stratejiler arasındadır[34]. Gerçekten de, hipertansiyon kardiyovasküler hastalıklar için önemli bir risk faktörü olarak sınıflandırılmaktadır. Çoğunlukla artan sistemik vasküler dirençten kaynaklanır ve bu genellikle vasküler homeostazı bozan vaskülatürdeki çeşitli yapısal ve fonksiyonel değişikliklerle ilişkilidir. Özellikle, tek bir endotelyal hücre tabakası tarafından oluşturulan kan damarlarının tunika intiması işlevsizdir. Ek olarak, vasküler düz kas hücreleri genellikle daha fazla kasılmış ve endotelden türetilen gevşetici faktörlere daha az duyarlı görünmektedir [5].

Çeşitli çalışmalar, polifenolden zengin bir diyetin kardiyovasküler hastalıklara karşı koruyucu etkilerine dair kanıtlar sağlamıştır. Gerçekten de, zengin kaynaklar olan meyveler, sebzeler, kuruyemişler, çikolata veya çaydan zengin bir diyet.flavonoidler, kardiyovasküler hastalık riskinde bir azalma ile ilişkilendirilmiştir [6]. Antioksidan, antienflamatuar, antiplatelet ve antimikrobiyal özelliklere ek olarak,flavonoidlerayrıca önemli vazodilatör özelliklere sahiptir [7,8]. Bununla birlikte, dünya çapında flavonoid alımı oldukça değişkendir ve bir kez alındığında, bu bileşikler gastrointestinal sistem ile karmaşık bir şekilde etkileşime girer. Kısaca flavonoidler bitkilerde çoğunluklaglikozitler. Diyet şeklinde uygulandıktan sonra sindirim sırasında hidrolize olurlar ve bu da ince bağırsakta aglikon formunun salınmasını sağlar. Aglikonlar, sırayla, ince bağırsağın epitelinde ve daha sonra karaciğerde metabolizmaya uğrayabilir. Bu, tekrar tekrar doğrulanmış olan ana flavonoidlerin çok zayıf bir biyoyararlanımı ile sonuçlanır [9,10]. Bununla birlikte, emilmeyen fraksiyon ince bağırsaktan distal bağırsağa geçer ve burada kolonik mikrobiyota tarafından parçalanır ve daha sonra emilecek olan fenil propiyonik, fenilasetik, benzoik asitler ve hidroksi benzenler dahil olmak üzere küçük fenolik bileşiklerin üretimine yol açar. 9]. Son birkaç on yılda, diyet flavonoidlerinin koruyucu etkilerinin, ana formlarından ziyade metabolitlerine atfedildiğinin netleşmesi dikkat çekicidir [10-12]. Bununla birlikte, Booth ve meslektaşları 1950'lerin başlarında bile 3,4-dihidroksifenilasetik (DHPA), 3-hidroksifenil asetik (3-HPAA) ve homovanilik asitler gibi çeşitli flavonoid metabolitlerin varlığını belgelediler. ağızdan alındıktan sonra farklı hayvan türlerinin idrarındakuersetin[13]; flavonoidlerin küçük fenolik metabolitlerinin biyolojik etkisi üzerine araştırmalar çok daha yenidir. Spesifik olarak, son yıllarda, flavonoidlerin metabolik akıbeti üzerine araştırmalar ve bunların mikrop türevli metabolitlerinin biyoaktivitelerini bildiren çalışmalar, sahada sıcak ve yoğun bir şekilde araştırılan bir konu haline geldi. Araştırma grubumuz, DHPA,4-metil katekol ve 3-(3-hidroksifenil) propiyonik asit dahil olmak üzere çeşitli mikrobiyal metabolitlerin, gevşemiş sıçan aortunun muhtemelen fizyolojik olarak ulaşılabilir konsantrasyonlar olduğunu göstermiştir [14,15] ]. Bildiğimiz kadarıyla 3-HPAA, en az araştırılan metabolitlerden biridir. Flavonoller (glikozid rutini ile kersetin, kaempferol), izoflavonlar ve flavanoller (hem oligomerik prosiyanidinler hem de monomerik birimleri, kateşin ve epikateşin) gibi farklı flavonoid sınıfları dahil olmak üzere bir dizi fenolik bileşiğin bir metaboliti olduğu belgelenmiştir. 1) [16-20].

3-HPAA, düz kas hücrelerini ex vivo gevşettiğinden [14], bu çalışma, bu metabolitin in vivo olarak arteriyel kan basıncında bir düşüşe neden olup olmadığını test etmeyi ve bir dizi mekanik deneyde etki mekanizmasını saptamayı amaçladı. .

2. Malzemeler ve Yöntemler

2.1. Hayvanlar

İn vivo deneyler, Çek Bilimler Akademisi, Prag, Çek Cumhuriyeti'nden elde edilen spontan hipertansif sıçanlar (SHR) üzerinde gerçekleştirildi. Hayvanlar Eczacılık Fakültesi hayvan tesisinde yetiştirildi ve 12 saat karanlık/aydınlık döngüsü ile 23-25 derece sabit sıcaklıkta tutuldu. Sıçanlara standart bir diyet ve ad libitum musluk suyu verildi. Çalışma (kayıt No.4937 2019-9), ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygun olarak Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (8. baskı, revize edilmiştir). 2011, ISBN-13:978-0-309-15400-0).

2.2.Kimyasallar

Pentobarbital, sodyum nitroprussid, dimetil sülfoksit (DMSO), L-Nw-nitro arginin metil ester(L-NAME), atropin, TRAM-34/1-[(2-klorofenil)difenilmetil] -1H-pirazol, indometasin, nifedipin, bradikinin, KCl, CaCl ve UCL-1684/6,12,19, 20,25,26-heksahidro-5,27 :13,18:21,24-trieteno-11,7-meteno-7H-dibenzo[b,m][1,5,12,16]tetraazasiklotrikosin{{ 29}},13-dium trifloroasetat hidrat, Sigma-Aldrich'ten (Steinheim, Almanya) satın alındı. Bay K8644, Axon Medchem BV'den(Groningen, Hollanda) temin edilmiştir. Test edilen metabolit 3-HPAA, Toronto Research Chemicals'dan (Toronto, ON, Kanada) satın alınmıştır. NaCl, NaHCO3 ve D-glukoz, PENTA sro (Prag, Çek Cumhuriyeti) tarafından sağlandı. MgSO4.7H2O, Erba Lachema sro'dan (Brno, Çek Cumhuriyeti) ve KH2PO4, Dr. Kulich Pharma sro'dan (Hradec Kralové, Çek Cumhuriyeti) satın alındı. Cumhuriyet). Salin, Baxter Czech spol'den satın alındı. sro(Prag, Çek Cumhuriyeti) ve Zentiva'dan (Prag, Çek Cumhuriyeti) heparin.

Sodyum nitroprussid, L-NAME ve atropin damıtılmış suda çözüldü. TRAM-34（1 mM） ve UCL-1684（100 μM） stok çözeltileri, sırasıyla yüzde 20 ve yüzde 10 DMSO ile takviye edilmiş su çözeltileri olarak hazırlandı. Yüzde 10 DMSO/su içinde bir indometasin (1 mM) stok çözeltisi de hazırlandı ve Bay K8644(10 mM) ve nifedipin (10 mM) saf DMSO içinde çözüldü. Doku odasındaki son DMSO konsantrasyonu her zaman<0.2%.the krebs="" solution="" contains="" the="" following="" (mm):="" nacl119,="" kcl4.7,="" cacl2="" 1.25,kh2po41.18,="" mgso4.7h2o1.17,="" nahco325,="" and="" d-glucose="">

2.3.In Vivo Deneyleri

On iki SHR sıçanına (ortalama ağırlık 356 ± 21 g, anestezi altında kan basıncı 211±64/152±45 mmHg, kalp hızı 381 ± 37 bpm) ip pentobarbital (50 mg. kg-) ile anestezi uygulandı. Basınç dönüştürücü MLTO380/D, sol ana karotid artere bağlandı ve kalp atış hızıyla birlikte arteriyel kan basıncı, LabChart 7 yazılımına (ADInstruments, Sidney, Avustralya) bağlı bir Power Lab cihazı kullanılarak kaydedildi. Sol safen vene bolus veya infüzyon iv uygulaması için kanüle edildi Ameliyattan sonra, her sıçanın deneyden önce 15 dakika boyunca stabilize olmasına izin verildi. 3-HPAA, salin içinde çözüldü ve iki protokol altında uygulandı:(1) 0 ile değişen tek bir bolus doz olarak.001 ila 10 mg kg{{18 }}(uygulanan hacim her zaman 0.1 mL idi, n=8); veya (2) 50μL infüzyon hızında 0.05, 0.25,1 ve 5 mg.kg-1.min-1 （n=4） dozlarında dört ardışık 5 dakikalık infüzyon olarak "Genie" Kent şırınga pompasını kullanarak dakikada （Kent Scientific Corporation, Torrington, CT, ABD)(Şekil 2a). Her iki protokolde de bir sonraki doz her zaman kan basıncı en az 5 dakika stabil olduktan sonra verildi. Bir kontrol olarak, her bir hayvana, 3-HPAA'nın ilk uygulaması gerçekleştirilmeden önce aynı koşullar altında salin uygulandı. Ölçümden sonra her sıçan iv KCl(1 mL, 1 mol.L-) ile öldürülmüştür. Deney sırasında vücut sıcaklığı, bir ısıtma plakası kullanılarak 36.5±0.5 derecede tutuldu.

2.4.Ex Vivo Deneyleri

2.4.1.Doku Hazırlama

Ex vivo deneyler, domuz koroner arter halka segmentleri üzerinde gerçekleştirilmiştir (Şekil 2b). Domuz kalpleri (n= 11) yerel bir mezbahadan alındı. Domuzlar, standart üreme ve veteriner kontrolü altındaki, tüketime yönelik her iki cinsiyetten sağlıklı hayvanlardı. Kalpler, hayvanın kesilmesinden yaklaşık 4 saat sonra deney için işlendi. Kalpler Krebs solüsyonuna daldırıldı ve sol sirkumfleks koroner arter hemen kesildi, tekrar Krebs solüsyonuna daldırıldı ve yapışık yağ, bağ dokusu ve kandan temizlendi. Daha sonra saflaştırılan koroner arter, yaklaşık 3 mm uzunluğunda silindirik halkalar halinde kesildi. Bazı mekanik deneyler için, endotel tabakası, lümen yüzeyi forseps ile hafifçe ovuşturularak mekanik olarak parçalandı. Halkalar, 37 derecede oksijenli koşullar altında (yüzde 95 O ve yüzde 5 C02) Krebs çözeltisi ile doldurulmuş doku banyolarında tutuldu. Her arter halkası, biri bir tutucuya sabitlenmiş ve ikincisi SPEL Advanced Kymograph Software, v3.2(Experimetria Ltd., Budapeşte, Macaristan) ile donatılmış bir dönüştürücüye ve bilgisayara bağlı olan iki paslanmaz çelik tel kanca arasına asıldı. Bu düzenleme, izometrik gerilimin ölçülmesini sağlar. Preparatlar, 40 dakika boyunca 2 g'lık bir gerilimde dengelendi, bu sırada Krebs çözeltisi her 10 dakikada bir değiştirildi. Bundan sonra, gerilim 1 g'ye (temel çizgi) ayarlandı, her doku banyosu 5 mL Krebs çözeltisi ile dolduruldu ve aşağıdaki canlılık testi yapıldı: koroner halkalar KCl ile büzüldü (banyo içindeki nihai konsantrasyon 40 mM idi) ve platoya ulaşıldığında, sağlam endotel veya soyulmuş halkaları doğrulamak için bradikinin (300 nM) eklendi. Daha sonra koroner halkalar birkaç kez Krebs solüsyonu ile yıkandı.

2.4.2. 3-HPAA'nın Domuz Koroner Arterinde Vazodilatör Aktivitesinin Teyidi

Damar gevşetici aktivite, KCl ile önceden sözleşmeli (40 mM) arteriyel halkalar üzerinde ölçülmüştür (Şekil 2b). Platoya ulaşıldıktan sonra,3-HPAA, 100 μM ila 1 mM arasında değişen konsantrasyonlarda banyoya kümülatif olarak ilave edildi.3-HPAA, Krebs solüsyonunda hazırlandı. Test edilen bileşik içermeyen Krebs çözeltisi, aynı prosedür kullanılarak kontrol olarak bazı koroner halkalara ilave edildi. Her doz, önceki dozun neden olduğu gevşetici tepkinin stabilizasyonundan sonra uygulandı ve prosedürün sonunda tüm deneylerde maksimum gevşemeyi sağlamak için sodyum nitroprussid （100 μM） kullanıldı.

2.4.3. Mekanik Deneyler

Aşağıdaki deneylerde, 3-HPAA'nın vazodilatör etki mekanizması, nitrik oksit (NO) sentaz inhibitörü, L-NAME（100 μM）; bir muskarinik reseptör antagonisti, atropin （50 μM）; bir siklooksijenaz （COX） inhibitörü, indometasin （10 μM）; veya orta ve küçük iletkenlikli Ca2 artı aktif Kt kanal inhibitörleri, sırasıyla TRAM-34（10 μM） ve UCL-1684 （1 μM） (Şekil 2b). Atropin veya inhibitörler her zaman KCl (40 mM) ilavesinden 30 dakika önce eklenmiştir. Daha sonra, ayrı bir deneyde, vasküler Cay1.2 Ca2 artı kanallarının (L-tipi) 3-HPAA ile indüklenen vazorelaksasyona katılımı, endotelyumdan soyulmuş koroner halkaların 15 mM KCl ile ön işleme tabi tutulması ve ardından inkübasyon yoluyla araştırıldı. 30 dakika boyunca 1 mM konsantrasyonda 3-HPAA ile. Daha sonra, bir L-tipi kalsiyum kanal aktivatörü Bay K8644, bir kasılma tepkisini indüklemek için karanlıkta kümülatif olarak （100 pM-10μM） uygulandı. Maksimum kasılmayı indüklemek için KCl(80 mM) kullanıldı. Karşılık gelen araç hacmiyle (Krebs solüsyonu) kuluçkaya yatırılan halkalar, negatif kontroller olarak kullanıldı. Ek olarak, bilinen L tipi kalsiyum kanalı inhibitörü nifedipin (150 nM) ile inkübe edilen halkalar, pozitif kontroller olarak kullanıldı. Araştırılan hedef proteinler ve mekanik deneylerde kullanılan ligandlar Tablo 1'de özetlenmiştir.

2.5. Veri analizi

Veri analizi için GraphPad Prism 7.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, ABD) kullanıldı. İn vivo deneyler için, 3-HPAA'nın bireysel bolus dozları ile kontrol (salin) arasındaki farklar, tek yönlü bir ANOVA ve ardından Dunnett post hoc testi kullanılarak karşılaştırıldı. İnfüzyonlar için iki yönlü bir ANOVA ve ardından Dunnett post hoc testi kullanıldı. Mekanik ex vivo deneyler için sonuçlar, eşleştirilmemiş bir t-testi kullanılarak karşılaştırıldı. Bay K8644 ile yapılan deneyler için, iki yönlü ANOVA ve ardından çoklu karşılaştırmalar için bir Dunnett testi kullanıldı. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilmiştir.

3. Sonuçlar

3.1.SHR'de 3-HPAA'nın İn Vivo Kan Basıncı ve Kalp Atış Hızı Üzerindeki Etkisi

3.1.1. Tek Bolus Yönetimi

{{0}}HPAA'nın 0 ile değişen dozlarda bolus uygulamasından sonra ortalama, sistolik ve diyastolik kan basınçlarında önemli bir düşüş gözlendi.01 ila 10mg.kg-' (Şekil 3 ve S1). Sistolik kan basıncındaki düşüş, 0.1 mg'lık bir dozdan belirgindi. kg-I(Şekil 3a), diyastolik kan basıncı 10 kat daha düşük dozdan (0.01 mg. kg-') bile önemli ölçüde düşerken(Şekil 3b).Aynı deneyde, kalp hızı üzerinde herhangi bir etki bulunmadı. 3-HPAA dozları (Şekil S2).

3.1.2. İnfüzyon Uygulaması

3-HPAA'nın 5 dakikalık kalıcı infüzyonları, ortalama, sistolik ve diyastolik kan basınçlarında bir düşüşe neden oldu (Tam sonuçlar Şekil S3'te). Etki doza bağımlıydı ve maksimum yakl. yüzde 50 . En yüksek iki doz olan 1 ve 5 mg·kg-1.min-I(Şekil 4) ile önemli değişiklikler meydana geldi. Ek olarak, bu durumda kalp hızında önemli bir değişiklik bulunmadı (Şekil S4).

3.2. 3-HPAA'nın Domuz Koroner Arteri Üzerinde Vazodilatör Özelliklerinin Teyidi

Ex vivo deneylerde, 3-HPAA, doza bağlı bir şekilde domuz koroner arterinin vazodilatasyonuna neden oldu(Şekil 5). İlk doz dışında vazodilatasyon gözlendi. Ancak sonuçlar sadece en yüksek konsantrasyon (1 mM) için anlamlıydı. Aynı konsantrasyon, ex vivo daha ileri mekanik testler için kullanıldı.

3.3. 3-Ex Vivo Çalışmalı HPAA'nın Domuz Koroner Arteri Üzerinde Vasküler Etkilerinin Mekanizması

3-HPAA'nın neden olduğu vazodilatasyonun altında yatan mekanizmaları araştırmak için, KCl ile önceden sözleşmeli endotel sağlam ve endotelden soyulmuş domuz koroner arter halkaları üzerindeki etkilerini karşılaştırdık. Endotelin çıkarılması vazodilatör etkiyi azalttı (Şekil 6b). Bu bulgudan sonra, endotelyal NO'nun katılımı test edildi. Bir eNOS inhibitörü, L-NAME (100 uM) ile ön tedavi, 3-HPAA'nın neden olduğu vazodilatasyonda da önemli bir düşüşle sonuçlandı (Şekil 6c). Buna karşılık, koroner halkaların muskarinik reseptör antagonisti atropin (50 uM) ile veya IKCa veya SKCa kanal blokerleri, TRAM-34（10 μM） ve UCL-1684（1 μM） ile benzer ön tedavisi, sırasıyla veya COX inhibitörü ile indometasin （10 μM）, 3-HPAA tarafından üretilen vazodilatasyonda herhangi bir değişikliğe neden olmadı(Şekil 6d-g). Son olarak, 3-HPAA'nın vasküler düz kas hücreleri üzerindeki Cay1.2 kalsiyum kanallarının (L-tipi) inhibisyonu yoluyla etki edip edemeyeceğini araştırmaya karar verdik. Halkaların 3-HIPAA(1 mM) ile ön tedavisi Bay K8644（100 pM-10 μM）（Şekil 7）'nin kümülatif dozlarının neden olduğu kasılma üzerinde önemli bir etkiye sahip değildi, bilinen Cav1.2 kalsiyum kanalı (L-tipi) inhibitörü nifedipin (150 nM) ile inkübasyon, kasılmaları önemli ölçüde azalttı (pozitif kontrol).

2. bölüm daha fazla bilgi için bağlantıya tıklayın
https://www.xjcistanche.com/news/part2-3-hidroksifenilasetik-asit-a-kan-pre-54725696.html