Bölüm 2: Ephedra Fragilis'ten Biyoaktif Bileşikler: Ekstraksiyon Optimizasyonu, Kimyasal Karakterizasyon, Antioksidan ve AntiGlikasyon Aktiviteleri
Mar 26, 2022
Daha fazla bilgi için. İletişimtina.xiang@wecistanche.com
2.7.Antiglikasyon Aktivitesi
2.7.1.UV-Görünür Analiz
UV-vis spektrumu, protein konformasyonel değişiklikleri ve kompleks oluşumu tespit etmek için yaygın olarak kullanılan hızlı, tutarlı ve basit bir tekniktir. CEE/fraksiyonların varlığında veya yokluğunda 15 gün boyunca inkübe edilen doğal ve glikolize BSA'nın absorpsiyon spektrumları ve ayrıcakuersetin(pozitif kontrol) Şekil 3A'da sunulmaktadır.
Doğal BSA'nın, çoğunlukla tirozin, triptofan ve fenilalanin dahil olmak üzere aromatik amino asitlere bağlı olarak 入2s0 nm'de karakteristik bir pik sergilediği açıkça gösterilmiştir [47].
Glikoz ile modifikasyon üzerine, λ280 nm'deki absorbans, doğal BSA'dan yüzde 60.57 daha fazla hiperkromik olmuştur. 入2s0 nm'de artan absorpsiyon yoğunluğu, normal fizyolojik fonksiyonunu etkileyebilen protein sarmalının glikasyon kaynaklı açılmasına bağlanabilir.
Treatment with CEE/fractions reduced significantly the absorbance at入2so nm compared to glycated BSA, and this reduction varied markedly between fractions according to the solvent polarity. Overall, descending antiglycation activity was portrayed as EAF>WBF>DMF>CCE>WF>1.82,1.71,1.57,1.35,1.28 ve glikolize BSA'dan 1.13-kat daha düşük olan HE. Bununla birlikte, bu aktivite, diğerlerinden belirgin şekilde daha düşüktü.kuersetinpozitif kontrol olarak kullanılır (glikolize BSA'dan 2.24-kat daha düşük). Bu nedenle, absorpsiyon çalışmalarından, E.fragilis kaynaklı EAF'nin protein glikasyonu tarafından indüklenen BSA açılmasına karşı koruyucu bir etkiye sahip olduğu açıkça sonucuna varılabilir.
2.7.2. BSA-Glu Modelinde Protein Glikasyonunun İnhibisyonu
AGE'ler, 入370 nm'de uyarıldığında λ440 nm'de floresan karakteristikleri olan heterojen bir bileşik grubudur. CEE'nin ve E. fragilis'ten gelen çeşitli fraksiyonlarının AGE oluşumunu inhibe etme yeteneği, BSA-glukoz tahlili kullanılarak değerlendirildi ve sonuçlar Şekil 3B'de sunuldu.
Şekil 3B'den kanıtlandığı gibi, test edilen tüm numunelerin AGEs inhibisyon oranı, konsantrasyonların artmasıyla birlikte yukarı doğru bir eğilim sergilemiştir. 1 mg/mL'de CCE, HE, DME EAE, WBF, WF ve kersetin, AGE oluşumunu inkübasyondan sonra sırasıyla yüzde 53,26,39,83,54,82,76,68,69.0 yüzde 9,48,83 ve 97,84 oranında inhibe etti 15 gün boyunca. EAF(ICs =0.375±0.034 mg/mL) tüm fraksiyonlar arasında en etkili AGEs inhibitörüydü ve bunu IC5 ile WBF, DMF, CCE ve WF izledi 0.595 ± {{30}} 0 değerleri.047, 0.857 ± 0.018, 0.951 ± 0.099 ve 1.044± Sırasıyla 0.032 mg/mL. HF, 1.212±0.063 mg/mL ICso değeri ile en zayıf aktiviteyi göstermiştir.
YüksekantiglikasyonEAF'nin potansiyeli, AGE oluşumunun çok iyi inhibitörleri olarak tanımlanan yüksek miktarda fenolik ve flavonoid içeriğine bağlı olabilir [48]. Liquidambar formosana Hance yaprağı ekstresinin EAF'sinin daha yüksek antiglikasyonu da Zhang ve diğerleri tarafından rapor edilmiştir. [31] diklorometan, n-bütanol ve su fraksiyonları ile karşılaştırıldığında.
Tablo 5'te verildiği gibi, AGEs inhibisyonu, hem TF(r=0.950;p) ile pozitif bir şekilde güçlü bir şekilde ilişkiliydi.<0.01)and tp(r=""><0.01)contents, which="" were="" in="" line="" with="" previously="" reported="" studies="" [2,29].="" the="" ages="" inhibition="" was="" also="" correlated="" in="" a="" positive="" way="" to="" dpph",abts,h2o2,reducing="" power,="" tac,andβ-carotene="" assays="" withr="">
r=0.914,r=0.983, r=0.975,r=0.923 ve r=0.963 (p<0.01),respectively. these="" reflected="" that="" ages="" inhibition="" is="" linked="" to="" the="" efficiency="" of="" primary="" antioxidants="" [6].="" kaewseejan="" and="" siriamornpun="" [29]="" also="" reported="" that="" phenolic="" compounds="" prevented="" the="" formation="" of="" ages="" through="" its="">serbest radikallerin temizlenmesiveantioksidankapasiteler.
2.7.3. Glikasyonun İndüklediği Protein Oksidasyonu Üzerindeki Etkiler
Proteinlerin glikasyonu (Maillard reaksiyonu), indirgeyici şekerin proteinlerin bir amino grubuna (esas olarak lizin ve arginin kalıntıları) kovalent bağlanmasıyla başlayan bir reaksiyondur, bu da kararsız ve geri dönüşümlü bir ürünün, yani daha sonra Amadori yeniden düzenlemesine maruz kalan Schiff bazının üretilmesine yol açar. Daha kararlı ketamin adı verilen Amadori ürünleri oluşturmak için. Daha sonra, Amadori ürünleri karbonillenmiş proteinler üretmek için bir endiol reaksiyonuna girer [48]. Bu ketaminin bozulması,serbest radikallerörneğin oksidatif ve hücresel hasara neden olarak Fenton reaksiyonu yoluyla HO'ya dönüşen süperoksit radikalleri gibi [49].
Protein oxidation is accompanied by carbonyl protein formation and loss of protein thiols, which are often employed as protein oxidation indicators[50]. As given in Figure 3C, the level of carbonyl content in native BSA was 1.16±0.04 nmol/mg protein, which was increased to more than 3.62-fold (4.21 ± 0.10 nmol/mg protein) upon glycation. The treatment with CEE and its various fractions reduced the level of carbonyl content with the increase of samples concentrations ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Furthermore, the inhibition effect of quercetin on the formation of carbonyl proteins was stronger than that of all fractions at every concentration point. When the concentration was 1 mg/mL, CEE, HF, DMF, EAF, WBF, WF, and quercetin decreased the level of carbonyl content by 42.29, 17.37,58.68,73.44,69.17,28.84,and 98.68%, respectively, compared to native BSA. Overall descending, the inhibition of carbonyl content formation was portrayed as Q>EAF>WBF >DMF > CCE> WF >HF.
CEE/fraksiyonların glikasyon kaynaklı protein tiyol oksidasyonu üzerindeki etkileri Şekil 3D'de sunulmaktadır. Doğal BSA'da, protein tiyol seviyesi 1.06± 0 idi.086nmol/mg protein, bu üç kattan fazla azaldı(0 .34± 0.021 nmol/mg protein) glikasyonlu protein içinde. CEE/fraksiyonların varlığında, tiyol grubunun seviyesi, 0.1 ila 1 mg/mL arasında değişen doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde arttı. Ayrıca, protein tiyol seviyesi aşağıdaki sırayla arttı: HF<><><><>
EAF, glikasyon aracılı protein oksidasyonuna karşı diğer fraksiyonlardan (dietil eter ve su fraksiyonları) daha etkili olduğu için Teucrium polium bitkisinde de benzer sonuçlar gözlendi[51]. Golshahi ve Bahramikia [52] da çalışmalarında, Trachyspermum copticum tıbbi bitkisinin parçalanmasında artan polariteye sahip (dietil eter ve su) çeşitli çözücüler kullanıldığında benzer sonuçlar bildirmiştir. Bu yazarlara göre, EAF, glikasyon aracılı protein oksidasyonuna karşı en güçlü koruyucu etkiye sahiptir ve bunu uzak bir şekilde dietil eter ve su olanlar izlemektedir. Bu, verilerin önerdiği gibi protein karbonil oluşumunu azaltarak ve protein tiyollerini oksidasyondan koruyarak glikoksidasyon prosesleri altında meydana geldiğine inanılan, proteinde hipergliseminin neden olduğu oksidatif hasarlara karşı önleyici bir etkiye sahip olabilen bu tür bileşiklerin EAF'de varlığını gösterir.
2.8.EAF'de Tanımlanmış Fenolik Bileşikler
Diğer fraksiyonlardan en yüksek biyolojik aktiviteyi gösteren EAF, ana biyoaktif bileşiklerinin RP-HPLC ile tanımlanması için seçildi. Alıkonma süreleri referans standartlarınkiyle karşılaştırılarak toplam altı bileşik tanımlandı. Tanımlanan fenolik bileşikler Şekil 4'te sunulmuştur. Gallik, vanilik, kafeik ve ferulik asitler fenolik asitler olarak tanımlanırken, rutin ve kersetin olmak üzere sadece iki bileşik flavonoid olarak tanımlanmıştır. Soumaya ve ark. [53], ferulik asit, luteolin-7-O-glukozit, mirisetin ve kaempferol 3-O-rutinosid, Tunus E.fragilis'in hava kısımlarının EAF'sinde mevcut olarak tanımlanırken, rutin , kersetin, gallik asit ve kafein asit sadece çalışmamızda ilk kez tespit edildi. Aynı bitki türünden elde edilen EAF'nin kimyasal bileşimindeki farklılık bitkinin farklı kısımlarına, bitkinin gelişme aşamasına, büyüme koşullarına (örn. toprak, ışık, sıcaklık, su, nem ve gübreler) göre farklılık gösterebilir. hasat zamanı, kurutma sistemi ve ekstraksiyon prosedürü [54]. Fitokimyasal parmak izi profilinden elde edilen sonuçlar, serbest radikal süpürme ve antioksidan aktivitelere önemli katkılar sağladığı düşünülen birkaç fenolik bileşiğe sahip olan iyi bir E.fragilis zenginliği göstermiştir [55]. Ek olarak, bu bileşikler, güçlü antiglikasyon kapasiteleri ile bilinir [48]. Birkaç çalışma, fenolik bileşiklerin antioksidan aktiviteleri ile onların antiglikozite kapasiteleri arasındaki doğrudan bağlantıyı ortaya çıkarmıştır.
2.9. Tanımlanmış Bileşiklerin Moleküler Yerleştirme Çalışması
E. fragilis'in EAF'sinde tanımlanan bileşiklerin BSA ve RAGE ile bağlandığı ayrıntılı mekanizmayı net bir şekilde görselleştirmek için bir moleküler yerleştirme çalışması gerçekleştirdik. Yerleştirme sonuçları Tablo 6'da sunulurken, en aktif bileşik ve hedefler arasındaki etkileşimler Şekil 5'te gösterilmektedir. Sonuçlar, kuersetin'in BSA'nın alt etki alanı IB'nin hidrofobik boşluğunda yer alan bağlanma bölgesine sıkıca oturduğunu ve en düşük bağlanma enerjisine sahip olduğunu gösterdi. {2}}.7 kcal/mol (Şekil 5A). Buna karşılık, ferulik asit, vanilik asit, kafeik asit, gallik asit ve rutin ile daha az bağlanma enerjisi elde edildi (-6.35,{{7} }.05, -5.84,-5.25 ve -4.41 kcal/mol, sırasıyla). Genellikle, bağlanma enerjisinin yüksek derecede negatifliği daha etkilidir ve bileşik, glikasyon işlemlerini kontrol etmek için kullanılacaktır. Şekil 5B'den, quercetin'in BSA'nın SER109, ASP111, LEU112, LEU115, ARG144, ARG185 ve ARG458 ile sekiz hidrojen bağı ve alifatik amino asitlerin aracılık ettiği dört hidrofobik etkileşim (PRO110, PRO113, LYS114 ve ARG144) oluşturduğu açıktır. . Ayrıca, kuersetin'i çevreleyen dört amino asit (ASP108, HIS145, LEU189 ve LEU462), van der Waal kuvvetleri aracılığıyla etkileşime girdi. Lizin ve argininin glikasyon sürecinde yer alan ana amino asit kalıntıları olduğu bildirilmiştir [56]. Bu nedenle, kuersetin'in lizin ve arginin kalıntılarına maskelenmesi, E. fragilis'in bir başlangıç aşamasında protein glikasyonunu inhibe etme olası mekanizmalarından biri olabilir.
![. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively. Engagement of AGEs products with RAGE are known to trigger, through ROS formation via NADPH oxidase and mitochondria [57], the activation of multiple intracellular signaling pathways (including JAK/STAT, phosphoinositol-3 kinase, rho GTPases, SAPK/JNK MAP kinases, p38 and erk1/2 (p44/p42) MAP kinases), and culminating in the activation of the NF-κB transcription factors [58], leading to the pathogenesis of diabetes and aging-associated disorders [5]. Therefore, blocking the AGEs–RAGE interactions can repress stress-provoking signals transduction, which is considered a therapeutic strategy of inhibiting glycation at a later stage. Docking results with RAGE, as shown in Table 6, proved that gallic acid has the highest docking score (ΔG= −6.8 kcal/mol) in comparison to those of vanillic acid, ferulic acid, caffeic acid, quercetin, and rutin (−6.68, −5.94, −5.89, −5.58 and −4.89 kcal/mol, respectively). Moreover, 2D modeling of gallic acid and RAGE showed that gallic acid formed five conventional hydrogen bonds with CYS38, GLY40, ALA41, LYS43, and SER83 of RAGE (Figure 5C,D). Also, LYS37 and LYS43 were responsible for the hydrophobic interactions of gallic acid with RAGE. Five amino acids surrounding gallic acid (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81, and GLY82) were attached by van der Waal's forces, thereby stabilizing the gallic acid-RAGE complex by providing a strong cohesive environment. In summary, the current study has shown the efficient interaction of certain bioactive compounds in the EAF of E. fragilis with the target proteins of BSA and RAGE. E. fragilis could be a source of potential competitors to glucose and AGEs, which might resist their binding towards BSA and RAGE, respectively, and therefore reducing the subsequent development of oxidative stress and inflammation (Figure 6). Figure 5. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively](/Content/uploads/2022842169/202203241046127d567c69ab264671b6814abd1b4544c7.png ". The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively. Engagement of AGEs products with RAGE are known to trigger, through ROS formation via NADPH oxidase and mitochondria [57], the activation of multiple intracellular signaling pathways (including JAK/STAT, phosphoinositol-3 kinase, rho GTPases, SAPK/JNK MAP kinases, p38 and erk1/2 (p44/p42) MAP kinases), and culminating in the activation of the NF-κB transcription factors [58], leading to the pathogenesis of diabetes and aging-associated disorders [5]. Therefore, blocking the AGEs–RAGE interactions can repress stress-provoking signals transduction, which is considered a therapeutic strategy of inhibiting glycation at a later stage. Docking results with RAGE, as shown in Table 6, proved that gallic acid has the highest docking score (ΔG= −6.8 kcal/mol) in comparison to those of vanillic acid, ferulic acid, caffeic acid, quercetin, and rutin (−6.68, −5.94, −5.89, −5.58 and −4.89 kcal/mol, respectively). Moreover, 2D modeling of gallic acid and RAGE showed that gallic acid formed five conventional hydrogen bonds with CYS38, GLY40, ALA41, LYS43, and SER83 of RAGE (Figure 5C,D). Also, LYS37 and LYS43 were responsible for the hydrophobic interactions of gallic acid with RAGE. Five amino acids surrounding gallic acid (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81, and GLY82) were attached by van der Waal's forces, thereby stabilizing the gallic acid-RAGE complex by providing a strong cohesive environment. In summary, the current study has shown the efficient interaction of certain bioactive compounds in the EAF of E. fragilis with the target proteins of BSA and RAGE. E. fragilis could be a source of potential competitors to glucose and AGEs, which might resist their binding towards BSA and RAGE, respectively, and therefore reducing the subsequent development of oxidative stress and inflammation (Figure 6). Figure 5. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively")
AGE ürünlerinin RAGE ile bağlanmasının, NADPH oksidaz ve mitokondri [57] yoluyla ROS oluşumu yoluyla, çoklu hücre içi sinyal yollarının (JAK/STAT, fosfoinositol-3 kinaz, rho GTPazlar, SAPK/INK dahil) aktivasyonunu tetiklediği bilinmektedir. MAP kinazları, p38 ve erk1/2 (p44/p42) MAP kinazları) ve NF-kB transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonuyla doruğa ulaşarak [58], diyabet ve yaşlanma ile ilişkili bozuklukların patogenezine yol açar [5]. Bu nedenle, AGEs-RAGE etkileşimlerinin bloke edilmesi, daha sonraki bir aşamada glikasyonu engellemenin terapötik bir stratejisi olarak kabul edilen strese neden olan sinyal iletimini baskılayabilir. Tablo 6'da gösterildiği gibi RAGE ile yerleştirme sonuçları, vanilik asit, ferulik asit, kafeik asit, kuersetin ve rutin(-6.68,-5.94,-5.89,-5.58 ve -4.89 kcal/mol, sırasıyla). Ayrıca, gallik asit ve RAGE'nin 2D modellemesi, gallik asidin, RAGE'nin CYS38, GLY40, ALA41, LYS43 ve SER83'ü ile beş geleneksel hidrojen bağı oluşturduğunu göstermiştir (Şekil 5C, D). Ayrıca LYS37 ve LYS43, gallik asidin RAGE ile hidrofobik etkileşimlerinden sorumluydu. Gallik asidi çevreleyen beş amino asit (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81 ve GLY82), van der Waal kuvvetleri tarafından bağlandı, böylece güçlü bir yapışkan ortam sağlayarak gallik asit-RAGE kompleksini stabilize etti. Özetle, mevcut çalışma, E. fragilis'in EAF'sindeki belirli biyoaktif bileşiklerin BSA ve RAGE'nin hedef proteinleri ile etkili etkileşimini göstermiştir. sırasıyla BSA ve RAGE'ye bağlanır ve dolayısıyla oksidatif stres ve inflamasyonun sonraki gelişimini azaltır(Şekil 6).
3. Malzemeler ve Yöntemler
3.1. Kimyasallar ve tepkimeler
22-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit)(ABTS), bütillenmiş hidroksi-toluen (BHT), sodyum azid, guanidin hidroklorür, tween-40,1,{ {7}}difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), Folin Ciocalteau reaktifi, -karoten, linoleik asit, glikoz, 2,4-dinitrofenilhidrazin(DNPH),5,5'-Dithiobis-({{16 }}Nitrobenzoik Asit)(DTNB), amonyum molibdat ve polifenol standartları Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO, ABD) satın alındı. Hidrojen peroksit (H2O2) Fluka'dan (Basel, İsviçre) satın alındı. Alüminyum klorür (AICl3), sodyum karbonat (NazCO3), demir klorür(FeCl3), potasyum persülfat (K2S2Os), potasyum ferrisiyanür (K3Fe(CN)6), sülfürik asit ve tüm çözücüler Merck Life Science'dan (Darmstadt, Almanya) temin edilmiştir. ). Askorbik asit ve triklorasetik asit (TCA), Scharlau'dan (Barselona, İspanya) elde edildi.
3.2.Bitki Malzemeleri
E. fragilis (hava parçaları) Mayıs 2019'da Dour Lagfifat, Oulad Teima, Taroudant, Fas'tan (enlem, 30 derece 24'0"K; boylam,9 derece 12'36"B) toplanmıştır. Enstitümüzden bir botanikçi olan Profesör Najat ELKHIATI tarafından, kupon örneklerinin bir koleksiyonunun depolandığı yerde tanımlandı. Bitki distile su ile durulandı, havada kurutuldu, bir karıştırıcıda toz haline getirildi ve kullanılıncaya kadar 49°C'de saklandı.
3.3.Deneysel Tasarım
3.3.1.Değişkenlerin Seçimi
Çözücü tipi, çözücü konsantrasyonu, ekstraksiyon süresi ve ekstraksiyon sıcaklığı gibi birçok parametrenin fenolik bileşikler ekstraksiyonu üzerinde önemli etkileri olduğu bilinmektedir [59]. Aseton, metanol ve etanol gibi farklı çözücüler, farklı fenolik bileşiklerin ekstraksiyonu için uygundur [16], ancak yenilebilir güvenliği ve yeşil üretimi nedeniyle bu çalışmada çözücü olarak etanol seçilmiştir [60]. Bu nedenle, etanol konsantrasyonu (X), ekstraksiyon sıcaklığı (X2) ve ekstraksiyon süresi (X3) dahil tüm faktörler değişken olarak seçilmiştir.
3.3.2. Ekstraksiyon Optimizasyonu için BBD
Ekstraksiyon faktörlerinin etkilerini belirlemek ve E. fragilis fenolik bileşiğinin optimum deneysel ekstraksiyon koşullarını seçmek için RSM kullanılarak bir optimizasyon prosedürü geliştirildi. X1(etanol konsantrasyonu, yüzde), X,(özütleme sıcaklığı, derece) ve X3(özütleme süresi, h) dahil olmak üzere üç bağımsız faktörün TP ve TF içeriği üzerindeki etkisini araştırmak için üç seviyeli, üç faktörlü bir BBD yapılmıştır. E, fragilis özleri [17]. Optimizasyon amacıyla, rastgele üç merkez nokta içeren toplam 15 deneme yapılmıştır(Tablo 1). Ön tek faktörlü deneyimize dayanarak (veriler gösterilmemiştir), tüm değişkenler X,(yüzde 40,60 ve 80), X ile üç düzeyde(-1,0 ve artı 1) ayarlanmıştır. ,(25,42,5 ve 60 derece ) ve X3(6, 15 ve 24 h)(Tablo 1). Yanıt değişkenlerini uydurmak için aşağıdaki ikinci dereceden polinom denklemi (Denklem (1)) kullanıldı:
Y, tahmin edilen yanıttır; Ö, ; ben ve ; sırasıyla kesme, doğrusal, ikinci dereceden ve etkileşim terimleri için regresyon katsayılarıdır; ve X; ve X; bağımsız değişkenlerdir (i ≠ j).
3.3.3. Ekstraksiyon Prosedürü
Toz haline getirilmiş numune (10 g), farklı sıcaklıklarda (25-60 derece) tasarlanmış bir etanol konsantrasyonunda (yüzde 40-80 ; 1:10, w/v) maserasyon yöntemiyle çeşitli sürelerde ({ {5}} h) bir orbital çalkalayıcı inkübatöründe(160 rpm). Çözünmeyen kütleyi uzaklaştırmak için gazlı bez ve Whatman filtre kağıdı no.1 kullanıldı. Süzüntü daha sonra ham etanolik özü (CEE) verecek şekilde R-3 Rotavapor(Büchi) kullanılarak düşük basınç altında 40 derecede kurutuldu.
3.4. Optimum Koşul Altında Elde Edilen CEE Fraksiyonasyonu
Optimum koşul altında elde edilen CEE, damıtılmış suda (100 mL) çözündürüldü ve artan polariteye sahip çeşitli çözücüler ile sıvı-sıvı ekstraksiyonu yapılarak heksan fraksiyonu (HF,3x100 mL), diklorometan fraksiyonu (DMF, 3x100) elde edildi. mL), etil asetat fraksiyonu (EAF.3 x 100 mL), suyla doymuş bir n-bütanol fraksiyonu (WBF, 3 x 100 mL),
ve kalan su fraksiyonu (WF). Bu fraksiyonlar daha sonra süzüldü ve yukarıda tarif edildiği gibi kurutuldu ve ekstraksiyon verimi Denklem (2)'ye göre kaydedildi:
Wo ve W, kurutulmuş CEE/fraksiyonların ağırlığı ve E.fragilis tozunun başlangıç ağırlığı mıydı; sırasıyla.
3.5. Fitokimyasal Analiz
E. fragilis ekstraktlarının fitokimyasal içeriğini değerlendirmek için kullanılan spektrofotometrik teknikler, Ek Materyallerde [61,62] detaylandırılmıştır.
3.6. Biyolojik Aktiviteler
Antioksidan [43,63-67] ve antiglikasyon aktivitelerinin [68-70] in vitro testlerinin ayrıntıları Ek Malzemelerde verilmiştir.
3.7.RP-HPLC EAF Analizi
EAF'deki fenolik bileşiklerin analizi, 100x4 mm ve 3.5 um'lik bir ZORBAX Eclipse SB-C18 ters-faz analitik kolonu ile donatılmış Agilent 1100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABD) ile gerçekleştirilmiştir. parçacık boyutu [71]. Kolon sıcaklığı 48 derecede sabit tutulmuştur. Asetonitril ile izokratik elüsyon, mobil faz olarak suda yüzde 0.1 asetik asit (12:88, v/v) ve 1 mL/dk akış hızı, E.fragilis'in EAF'sindeki polifenollerin iyi ayrılmasını sağlamıştır. Enjekte edilen hacim 10 µL idi ve kromatogramlar 330 nm'de ölçüldü. EAF'deki fenolik bileşiklerin alıkonma süreleri, onları tanımlamak için tamamen mevcut standartlarınkiyle karşılaştırıldı.
3.8. Moleküler Yerleştirme
Moleküler yerleştirme çalışması gerçekleştirmek için AutoDock Tools(ADT) sürüm 1.5.6 kullanıldı. Tüm bileşiklerin SDF formatı PubChem veri tabanından elde edildi ve ardından Open Babel GUI (versiyon 2.4.1) kullanılarak 3Dpdb dosyasına dönüştürüldü. BSA(PDB ID:4ORO) ve RAGE(PDB ID:4LP5) kristal yapıları RCSB Protein Veri Bankasından (PDB) toplanmıştır. Kısaca, proteinler ilk olarak (i) tüm heteroatomları ve su moleküllerini uzaklaştırarak, (i) polar hidrojen atomları ekleyerek ve (ii) Kollman yüklerini atayarak yerleştirme için hazırlandı. Izgara kutusu boyutu x{{10}},y=126,z=126 ve x=80,y=80.Z{{ olarak ayarlandı 15}} ızgara merkezi ×=8.415,y=21.626,z=106.57 vex=37.98,y=-43.581 ,z=9.371, sırasıyla BSA ve RAGE'nin bağlanma bölgesi çevresinde oluşturulan 0,375A'lık bir ızgara aralığı ile. Yerleştirme yazılımı, en iyi bağlama pozunu bulmak için Lamarckian Genetik Algoritması (LGA) kullanılarak 100 kez çalıştırıldı. En düşük bağlanma enerjisi skoruna sahip ligand, daha fazla araştırma için seçildi. Yerleştirme sonuçlarını görselleştirmek için Discovery Studio yazılım sürümü 2020 (BIOVIA, San Diego, CA, ABD) kullanıldı.
3.9. İstatistiksel analiz
RSM'yi gerçekleştirmek için Design-Expert yazılımının 119 sürümü (Stat-Ease Inc. ve Minneapolis, MN, ABD) kullanıldı. Veri analizi, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Duncan'ın SPSS 26 kullanılarak yapılan post-hoc testi ile yapıldı.0(IBM Co., USA);p<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" pearson="" correlation="" analysis="" was="" conducted="" to="" investigate="" correlations="" between="" variables="" and="" their="" significance.="" all="" graphics="" were="" constructed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0="" software="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" all="" experiments="" were="" conducted="" in="" triplicate="" and="" presented="" as="" mean="" values="" ±standard="" deviation="">
4. Sonuçlar
Fas şifalı bitkisi E. fragilis'ten biyoaktif bileşiklerin ekstraksiyonu için optimize edilmiş parametreleri ayarlamak için bir BBD'li RSM kullanıldı. Optimum etanol konsantrasyonu, ekstraksiyon sıcaklığı ve ekstraksiyon süresi maksimum için tahmin edildi.
fenolik bileşiklerin ekstraksiyon verimi sırasıyla yüzde 61.93, 44.43 derece C ve 15.84 saat olarak gösterildi. Optimum ekstraksiyon koşulları altında elde edilen CEE ve çeşitli fraksiyonları, TP ve TF içerikleri ve bunların yanı sıraantioksidanve antiglikasyon aktiviteleri. EAF fraksiyonu, diğer fraksiyonlara kıyasla en yüksek TP ve TF içeriğini ve en güçlü antioksidan aktiviteyi gösterir. Ayrıca, UV-vis absorpsiyon spektrumu, spesifik AGEs floresansı, karbonil içeriği ve serbest tiyoller grubu gibi çeşitli biyobelirteçlerin değerlendirilmesi, EAF'nin glikozun aracılık ettiği glikasyona karşı en büyük koruyucu etkisini göstermiştir. Ayrıca fenolik bileşiklerin antioksidan kapasiteleri ile antiglikasyon aktiviteleri arasında önemli bir pozitif ilişki gözlemlendi. Bu, fenolik bileşiklerin hem antioksidan hem de antiglikasyon aktivitelerinden sorumlu ana baskın bileşenler olabileceğini göstermektedir. EAF'deki biyoaktif bileşikler, RP-HPLC analizi ile karakterize edildi ve toplam altı bileşik tanımlandı. In silico moleküler yerleştirme analizi ayrıca, sırasıyla hedef proteinler olarak sırasıyla BSA ve RAGE ile quercetin ve gallik asit arasında etkili bir etkileşim göstermiştir. Toplu olarak, bu çalışma, E.fragilis'in güçlü antioksidan ve antiglikasyon aktivitelerine sahip potansiyel bir doğal biyoaktif bileşik kaynağı olabileceğini ve yaşlanma ve glikasyon ile ilişkili komplikasyonların tedavisinde ve önlenmesinde uygulanması gerektiğini ileri sürmektedir. E. fragilis'in fitokimyasını ve farmakolojik özelliklerinin etki mekanizmalarını araştırmak için biyoaktif bileşiklerin izolasyonu ve farmakolojik tarama (yani sitotoksisite çalışması) üzerine daha ileri çalışmaların yapılması gerekmektedir.
Referanslar
1. Martins, N.; Barros, L.; Santos-Buelga, C.; Silva, S.; Henriques, M.; Ferreira, ICFR Kaynatma, İnfüzyon ve Ekili Kekik Hidroalkolik Özü: Antioksidan ve Antibakteriyel Aktiviteler ve Fenolik Karakterizasyon. Gıda Kimyası 2015, 167, 131–137. [Çapraz Referans]
2. Deetae, P.; Parichanon, P.; Trakunleewatthana, P.; Chanseetis, C.; Lertsiri, S. Tay Bitki Çaylarının Konvansiyonel Çaylara Göre Antioksidan ve Anti-Glikasyon Özellikleri. Gıda Kimyası 2012, 133, 953–959. [Çapraz Referans]
3. Yao, Q.; Liang, Y.; Shao, Y.; Bian, W.; Fu, H.; Xu, J.; Sui, L.; Yao, B.; Li, M. GnRH Agonist Protokolü ile IVF/ICSI Uygulanan Kadınların Foliküler Sıvısında Gelişmiş Glikasyon Son Ürün Konsantrasyonları. tekrar. Biyomedikal. Çevrimiçi 2018, 36, 20–25. [CrossRef] [PubMed]
4. Grimm, S.; Ott, C.; Hörlacher, M.; Weber, D.; Höhn, A.; Grune, T. İmmünoproteasomların Gelişmiş-Glikasyon-Son Ürün-İndüklenmiş Oluşumu: RAGE ve Jak2/STAT1'in Katılımı. Biyokimya. J. 2012, 448, 127–139. [Çapraz Referans]
5. Meenatchi, P.; Purushothaman, A.; Maneemegalai, S. Coccinia Grandis'in (L.) İn Vitro Antioksidan, Antiglikasyon ve İnsülinotropik Özellikleri: Diyabetik Komplikasyonların Önlenmesinde Olası Rolü. J. Gelenek. Tamamlayıcı. Med. 2017, 7, 54-64. [CrossRef] [PubMed]
6. Nakagawa, T.; Yokozawa, T.; Terasawa, K.; Şu, S.; Juneja, Yeşil Çayın Serbest Radikal ve Glikoz Aracılı Protein Hasarına Karşı LR Koruyucu Aktivitesi. J. Agric. Gıda Kimyası 2002, 50, 2418–2422. [CrossRef] [PubMed]
