2. Kısım: Askorbik Asit, 5-Kafeoilkinik Asit ve Quercetin-3-Rutinosid'in Isıl İşlem Sırasında Demir Varlığında ve Yokluğunda Etkileşimleri ve Antioksidan Aktivite Üzerindeki Etkisi

Daha fazla bilgi için. İletişim:tina.xiang@wecistanche.com

Bölüm 1 ayrıntılarını öğrenmek için bağlantıya tıklayın:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-etkileşimler-of-askorbik asit-5-kafeo-54916714.html

3. Tartışma

3.1.Askorbik Asit,5-Kafeoilkinik Asit ve Kuersetin-3-Rutinosidin Yapı-Aktivite İlişkisi

Yapı-aktivite ilişkisine bağlı olarak farklı maddeler için ölçülen AOA'nın ilk göstergesi, fonksiyonel grupların sayısından kaynaklanmaktadır. Analiz edilen üç maddenin tümü karşılaştırıldığında, askorbik asit en düşük AOA'ya sahipti ve onu 5-kafeoilkinik asit izledi.kersetin-3-rutinositen yüksek AOA'ya ulaştı. Csepregi et al. [14], bu üç bileşiğin AOA'sını karşılaştırırken aynı sırayı buldu. Bu sıralama, hidroksi gruplarının toplam miktarı ile açıklanabilir: kersetin-3-rutinosit on, 5-kafeoilkinik asit beş veaskorbik asitdördü var. İçinflavonoidler, toplam hidroksi grup miktarı ve bunların AOA mekanizmaları üzerindeki etkisi daha önce Burda ve Oleszek tarafından gösterilmişti[15]. Hidroksi grupları, kolayca diketonlara oksitlenebildikleri için endiol yapılarında özellikle değerlidir [8]. Analiz edilen maddelerde, metal iyonları [16-18] ile kompleks oluşturma yeteneği için endiol yapısı da önemlidir. Endiol yapısı, fenil halkasındaki quercetin-3-rutinosid ve 5-kafeoilkinik asit moleküllerinde oluşur ve bu bileşiklerin daha güçlü AOA'sını da etkileyebilir. Daha ileri çalışmalar, AOA'nın diğer molekül yapılarından da etkilenebileceğini buldu. Fenolik asitler muhtemelen karboksilik asit gruplarından etkilenir, örneğin hidroksifenil asetik asit (R-CH=CH-COOH), hidroksisinamik asit (R-CH,-COOH) ile karşılaştırıldığında daha zayıf bir elektron çeken gruptur. 5-kafeoilkinik asitte [19] kafeik asit olarak. Flavonoidlerde, aglikonlar, karşılık gelen glikozitlerden [20,21] daha yüksek AOA'ya sahipti, kersetin-3-rutinosit, bir glikozit durumunda, aglikonun AOA'sıkuersetindolayısıyla daha yüksektir [14]. AOA'yı etkileyebilecek birçok farklı fonksiyonel grup vardır ve sonuç olarak, tek elektron transferi (SET), hidrojen atomu transferi (HAT) ve sıralı proton kaybı elektron gibi farklı mekanizmalara sahip farklı test tahlillerinin kullanılması önemlidir. Algılama için transfer(SPLET). Her mekanizma ve hatta kullanılan tahlil reaktifi, biyoaktif bileşiklerin farklı yapılarını tespit edebilir [22].

3.2.Mineral Demir Yokluğunda Isıl İşlemin Etkisi ve Yapısal Olarak Farklı Antioksidanların Antioksidan Aktivitesi Üzerindeki Etkileşimi

40 dakikalık termal işlemden oluşan uzun bir süre boyunca kararlı AOA, termal bozulmanın başlangıçta varsayıldığından daha az önemli olduğunu gösterir. Ayrıca, HPLC verileri, saf 5-kafeoilkinik asit ve kersetin-3-rutinositin, termal işlem sırasında maksimum yüzde 20'lik bir bozunma ile kararlı olduğunu gösterdi. Önceki çalışmalar, 5-kafeoilkinik asidin suyun normal kaynama noktasına [23] kadar kararlılığını kanıtlarken, Dawidowicz ve Typek[24], 5-kafeoilkinik asidi 5 saat boyunca ısıttıktan sonra dokuz türev bileşik buldu. cezir. Askorbik asit konsantrasyonu için, 40 dakikalık pişirmeden sonra bir bozulma bulundu. Sulu bir çözeltide demir olmadan askorbik asit bozunmasıyla sonuçlanan etkileyen faktörler pH değerleri, ışığa maruz kalma, oksidasyon, sıcaklık ve farklı konsantrasyonlar olabilir [25,26]. Bu çalışmada, mikrotüplerdeki minimum gaz boşluğu nedeniyle oksidatif süreçler minimuma indirildiğinden, sıcaklık ve konsantrasyon faktörleri büyük olasılıkla ana rolü oynadı. Kalan gaz fazının aerobik koşullar altında bozunma için hala yeterli olması mümkündür. Farklı koşullar farklı ürünlerle sonuçlanır [27,28], bu nedenle bu çalışmada 40 dakikalık pişirmeden sonra her iki koşula ait ürünler bulunabildi. Yuan ve Chen [28], furfural, 2-furoik asit, 3-hidroksi-2-piron ve bilinmeyen bir maddenin pH değerine bağlı olarak sulu bir çözeltide askorbik asidin başlıca bozunma ürünleri olduğunu bildirmiştir. . Shinoda et al. [29,30] portakal suyunda furfural, 2-furoik asit, 5-hidroksimaltol, 3-hidroksi-2-pirron ve 5-(hidroksimetil) bozunma ürünleri buldu. ) furfural. Hsu et al. [31] etanolik solüsyonlarda askorbik asidi analiz etti ve 2-furoik asit ve 3-hidroksi-2-piron tespit etti. Aerobik veya anaerobik koşullara bağlı olarak, tespit edilen askorbik asit türevleri (pik 3 ve 4) furfural, 2-furoik asit veya 3-hidroksi-2-piron veya ara maddeler olabilir. Askorbik asit, bir doz-tepki ilişkisi içinde azaldı ve daha yüksek askorbik asit konsantrasyonları, pişirme sırasında daha düşük bozunma oranları gösterdi. Askorbik asit, muhtemelen hidrojen bağları ve van de Waals enerjisi nedeniyle kendisini daha yüksek konsantrasyonlarda stabilize ediyor gibi görünmektedir [32].

İkili ve üçlü karışımlarda, esas olarak AOA üzerinde ek etkiler bulundu. İkili karışımlarda, AOA'si daha yüksek olan maddenin konsantrasyonu artarsa, kombinasyonlarının AOA'sı da artar. Diğer çalışmalar ayrıca ( artı )-kateşin (200 um) ile askorbik asit (50-200 mg/L)[33] arasında ve farklı monoterpenlerin[34] ikili karışımları arasında ilave etkiler bulmuştur. Yalnızca DPPH testinde, 5-kuersetin-3-rutinosit ile birleştirilen kafeoilkinik asitte ve iki kat kersetin-3-rutinosid konsantrasyonlarına sahip üçlü karışımlarda antagonistik etkiler bulundu. Bu, moleküllerin uzayda, özellikle oldukça büyük bir molekül olarak kuersetin-3-rutinositin oryantasyonundan ve DPPH radikal molekülünün sterik erişilebilirliğinden kaynaklanabilir [35]. TPC testinde, askorbik asit ve 5-kafeoilkinik asit kombinasyonu 1:2 oranında güçlü antagonistik etkilerle sonuçlanırken, 2:1 oranında ters karışımlar toplamını aşan güçlü sinerjistik etkilerle sonuçlandı. ilgili AOA'lar. Çift konsantrasyonlu askorbik asit, bu koşullar altında, bu deneyde 5-kafeoilkinik asit tarafından gösterilen diğer moleküllerin stabilizasyonunun izlediği kendi kendine stabilizasyon nedeniyle AOA'ya ek bir destek verebilir. Nar-nektarin suyunda, doğal fenoller ile askorbik asit arasında aynı etkileşim bulunurken, üzüm suyunda askorbik asit konsantrasyonunu artırarak antagonistik etkileri arttırdığı gözlenmiştir [36]. Bu sonuçlar, askorbik asit, 5-kafeoilkinik ve kersetin-3-rutinosit karışımlarının, en güçlü olduğunda en yüksek AOA potansiyeline ulaştığını göstermektedir.antioksidanlarbol miktarda mevcuttur.

Ürünler hakkında daha fazla bilgi almak için tıklayın

3.3. Mineral Demirin Etkisi

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>askorbik asit. Bununla birlikte, karışımlara demir eklenmesi, TEAC ve DPPH tahlil sonuçları üzerinde bir etkiye sahipken, TPC tahlilleri büyük ölçüde etkilenmemiştir. Bu nedenle, demir açısından zengin numunelerle çalışırken farklı çalışma mekanizmalarına sahip farklı test tahlillerinin kullanılması önemlidir.

Yalnızca DPPH testinde saf kersetin-3-rutinositin AOA'sı ve askorbik asit ile kombinasyon halinde, eşmolar veya eşmolar olmayan ve iki kat kersetin-3-rutinosid konsantrasyonları, demir varlığında daha düşük değerlere sahipti. Boligon et al. [351, bu radikallerin sterik erişilebilirliği nedeniyle DPPH testinin daha küçük antioksidanları daha iyi saptadığını açıkladı. Muhtemelen, iki bağlayıcı tarafı olan quercetin-3-rutinosit, demir ile oldukça büyük kompleksler oluşturabilir ve bu nedenle tahlil için erişilemez. Kejic ve ark. [8], bu, metal iyonlarının koordinasyonu yoluyla supramoleküler komplekslerin oluşumu ile açıklanabilir. 1:2 oranında [12] karışık değerlik kompleksleri oluşturabilen askorbik asit ile kombinasyon halinde, muhtemelen bu daha büyük karışık kompleksler DPPH radikali ile etkileşime giremez. Bu çalışmadaki sonuçların aksine, diğer çalışmalar [18,37,38], DPPH testini kullanarak, kersetin-3-rutinosit komplekslerinin saf kersetin-3-rutinositten daha etkili antioksidanlar olduğunu bulmuştur. Flavonoidlerin ve metal iyonlarının şelat komplekslerinin, kompleks metal iyonlarının radikal aktivitesini engelleyebildiği bilinmektedir [39]. Tek fark, bu çalışmada Symonowics ve Kolandek'in çalışmasında kullanılan demir (ⅡI) klorür veya sülfat yerine amonyum demir (II) sülfatın kullanılmasıydı [39].

2:1 oranında demir varlığında askorbik asit ve 5-kafeoilkinik asit arasında sinerjistik etkiler ve 1:2 oranında antagonistik etkiler bulunmuştur. 5-Kafeoilkinik asidin demir ile kombinasyonu in vivo olarak önerilmez [6]. Bununla birlikte, bu çalışma, in vitro olarak, 5-kafeoilkinik aside kıyasla iki katına çıkan askorbik asit miktarının AOA üzerinde sinerjik etkilerinin bile olabileceğini göstermiştir. Oranlarla ilgili daha fazla araştırma, olumlu etkilerin in vivo olarak da elde edilip edilemeyeceğini gösterebilir.

HPLC verilerine göre, örneğe demir eklenmesi, yalnızca 0 dakika pişirilmiş numunelerde askorbik asit konsantrasyonu azaldığından, katalitik aktivitesi üzerinde minimal bir etkiye sahip olacaktır. Pişirilmiş askorbik asit numunelerinde, demir içermeyen numunelerin aksine, daha yüksek askorbik asit konsantrasyonları, daha yüksek bir bozunma oranına yol açmıştır.5-Kafeovilkinik asit ve kersetin-3-rutinosid, sıcaklık ve zamanın yanı sıra ek faktörlere ihtiyaç duyar. Demirin katalitik aktivitesinin çalışması için karışımlardaki etkileşimler. Quercetin-3-rutinosit, demir varlığında, ısıl işlemden sonra sadece askorbik asit ile ikili karışımlarda azaldı. Bunun nedeni, flavonoidin birincil bir antioksidan görevi görmesi ve daha sonra ortaya çıkan bileşik radikalinin askorbik asit ile reaksiyona girerek orijinal bileşiği yeniden oluşturması olabilir [18]. 5-Kafeoilkinik asit özel görünüyor çünkü kersetin-3-rutinositi korurken askorbik asit kersetin-3-rutinosidi koruyamaz. Bu nedenle, 5-kafeoilkinik asit, sistemi demir ve ısıl işlemle birlikte stabilize etmek için anahtar molekül olabilir. 5-Kafeoilkinik asidin stabilize edici bir molekül olduğu hipotezi, üçlü karışımlarda daha da doğrulandı. Burada, kersetin-3-rutinosit her zaman 5-kafeoilkinik asit tarafından stabilize edildi, böylece askorbik asit varlığında bile kersetin-3-rutinosid konsantrasyonunda hiçbir azalma gözlemlenmedi. Başka bir çalışmada, 5-kafeoilkinik asit, bir ko-pigmentasyon mekanizması yoluyla antosiyaninlerin bozulmasına karşı koruyucu özellikler göstermiştir [40]. Muhtemelen daha yüksek AOA'ya sahip yeni bozunma ürünleri, demir varlığında üç maddenin hepsinden ortaya çıktı. Kafeik asit (tepe 6) bir 5-kafeoilkinik asit parçalanma ürünü olarak tanımlandı (veriler gösterilmemiştir). Bu, diğer maddenin kinik asit veya Dawidowicz ve Typek [24] tarafından tanımlanan dokuz olası türevden biri olabileceği varsayımına yol açtı: kinik asit;(1S,3R,4R,5R)-5-[{{24 }}(3,4-dihidroksifenil)-2-hidroksipropanoil]-1,4,5-trihidroksi-sikloheksan karboksilik asit;(1S3R,4R,5R)-5- [3-(3,4-dihidroksifenil)-3-hidroksipropanoil]-1,4,5 trihidroksisikloheks-ankarboksilik asit; trans 3-O-kafeoilkinik asit; trans 5-O-kafeoilkinik asit; trans 4-O-kafeoilkinik asit; kafeik asit; cis-5-O-kafeoilkinik asit;4,5-dikaffeoilkinik asit. Quercetin-3-rutinosit için, kromatogramda tanımlanamayan bir bozunma ürünü görünür.

3.4. Demir (Fe3 plus ) ve Demirli Demir (Fe2 plus ) ile Şelat Oluşturma Özelliği

Askorbik asit içeren tüm numunelerde ferrik demir, ferröz demire indirgenmiştir. Bu süreçte,askorbik asitferrik demirden bir elektron alır ve onu ferröz demire indirger ve kendisi bir radikal olur. Kararsız radikal hızla dehidroaskorbik aside ve daha fazla bozunma ürünlerine dönüşür [12]. Eksik hidroksi peroksit nedeniyle, Fenton döngüsü yoluyla ferrik demire geri dönüş mümkün değildir. 0 dakika pişirilmiş ikili karışımlarda, demirin yüzde 20'sinden fazlası askorbik asit varlığında bağlandı. Askorbik asidin, 3-OH ve 2-'dan hidrojen yer değiştirmesini takiben 3-O ve 2-O çekirdekleri aracılığıyla şelatlama yoluyla demir türleri ve diğer metal iyonları ile kompleksler oluşturduğu bilinmektedir. OH grupları [16,17,41. Ayrıca karışık değerlikli demir-askorbat kompleksleri oluşturabilir [42]. Bununla birlikte, askorbik asit zayıf bir şelatlayıcı ajandır ve pişirmeden sonra, askorbik asit mevcut olduğunda saf ve karışık numunelerde sadece eser miktarda bağlı demir tespit edildi. Ayrıca, pişirme işlemi nedeniyle askorbik asit, demir ile şelat yapamayan bozunma ürünlerine ayrışır.

5-Kafeoilkinik asit nispeten zayıf bir indirgeyicidir. Ferrik demir, 5-kafeoilkinik asit tarafından indirgendi ve uzun süreli pişirme ile azalma arttı.5-Kafeoilkinik asit, bir ligandda metal yük transferine ferrik demir ile şelatlar [17].5-Kafeoilkinik asit kafeik asidin 3,4 endiol yapısında olası bir bağlanma tarafını taşır. Bu, kafeik asidin neden 5-kafeoilkinik asidin biyoaktif parçası olduğuna dair bir gösterge olabilirken, kinik asidin neredeyse hiç AOA'sı yoktur [43]. Endioller, bire bir oranında [44,45] bir demir kompleksi[41] oluşumu nedeniyle OH oluşumunu engelledi. Lamy ve diğerleri[46], 5-kafeoilkinik asidin monomerik kompleksler oluşturduğu sonucuna varırken, Kiss ve diğerleri. [47] oligomerik türler buldu. Önceki çalışmaların aksine [17,48], ısıl işlem öncesi ve sonrası 5-kafeoilkinik asit varlığında yalnızca bağlı demir izleri bulundu. Bu, bu çalışmadaki nötr pH koşulları ile açıklanabilir, diğer çalışmalar ise insan midesindeki 1-2.5 pH değerine dayalı olarak asidik bir ortamda çalıştı [48]. Birkaç saat sonra saklanan örneklerde 5-kafeoylikkinik asit-ferrik demir komplekslerinin bir göstergesi olan siyah bir çökelti bulundu. Analiz için yakın zamanda karıştırılmış numuneler kullanıldı, bu nedenle bu komplekslerin nötr pH'ta oluşumu daha uzun bir süre gerektirir. Kafeik asitli demir kompleksleri çok az süpürme aktivitesi gösterdi [49]. Ayrıca, kinik asit ve ferrik demir arasında bir reaksiyon için spektrofotometrik kanıt yoktur [48]. 5-kafeoilkinik asidin aksine, kuersetin-3-rutinosit örneğinde, termal işlemden sonra bile bağlı demir bulundu.

Quercetin-3-rutinosid, uzun bir pişirme süresiyle minimum bir artışla ferrik demiri demirli demire indirdi. Quercetin-3-rutinosidin bu orta düzeyde indirgeme aktivitesi daha önce Mira ve ark. [50]. Quercetin-3-rutinosidin ferrik indirgeme aktivitesi 3-rutinosit, 5,7,3',4'-OH [50]'de tespit edildi. Ferrik demir ile orta derecede etkileşim, şelasyon tarafında daha düşük negatif yük yoğunluğu ile sonuçlanan daha düşük sayıda -OH grubu ile açıklanabilir [50]. Flavonoidler, üç potansiyel koordinasyon tarafında metal iyonları ile şelat oluşturabilir: (i) 5-hidroksi ve 4-karbonil grupları arasında, (ii) 3-hidroksi ve 4-karbonil grupları arasında, ve (ii) Bring [39]'deki 3', A'-hidroksi grupları. Quercetin-3-rutinosit bağlayıcı tarafları (i) ve (i)[9] kullanır ve 3-hidroksi grubunda rutinosid eklenir. Spektral veriler, metal iyonlarının sadece 3', A'-hidroksi grubuna bağlı olduğunu bile gösterdi [18]. Şelatlar, iki değerlikli demir ile daha etkilidir [50]. İkili karışımlarda, kersetin-3-rutinosid, üçlü karışımların aksine askorbik asit mevcut olduğunda kompleks oluşturamaz. 5-kafeoilkinik asit varsa, az miktarda bağlı demir bulunur. Bu, 5-kafeoilkinik'in kersetin-3-rutinosit moleküllerini askorbik asit varlığında koruduğunu, dolayısıyla kersetin-3-rutinositin demir ile kompleksler oluşturabileceğini gösterir.

4. Malzemeler ve Yöntemler

4.1.Kimyasallar

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>yüzde 99), demirli amonyum sülfat dodekahidrat ve demirli amonyum sülfat heksahidrat, Carl Roth'tan (Karlsruhe, Almanya) satın alındı.

4.2.Örnekler

Askorbik asit, {{0}}kafeoilkinik asit ve kersetin-3-rutinosidin özgün standartlarının sulu çözeltileri ve karışımları, saf çözeltiler ve farklı oranlarda karışımlar halinde hazırlanmıştır. Tüm olası ikili karışımlar eşmolar oranlarda yapıldı ve bir bileşik ile eşmolar olmayan oranlar iki katına çıkarıldı. Üçlü karışımlar da, sırasıyla bir veya iki bileşiğin ikiye katlandığı eşmolar oranlarda ve eşmolar olmayan oranlarda hazırlandı. Antioksidanların nihai konsantrasyonları, her test solüsyonu için 0.3 mM idi. Ayrıca, karışım başına toplam 0.3 mM demir({{10}}.15 mM demir demir ve 0.15 mM demir demir) ilave edildikten sonra tüm deneyler tekrarlandı. Seçilen antioksidan ve demir miktarları fizyolojik veya gıda seviyelerine dayanmaz, moleküler etkileşimin etkisini incelemek için molar kütlelere dayanır. Sonuç olarak, toplam antioksidanlar ve demir arasında bir eşmolar oran oluşturulmuştur. Tüm karışımlar kaynar suda 0, 10, 20 ve 40 dakika pişirilmiş ve daha sonra ısıtma işlemini durdurmak için buz üzerinde soğutulmuştur. Bu, üç bağımsız kopya için yapıldı.

4.3.Fotometrik Ölçümler

antioksidanlar(saf veya karışık), demirin yokluğunda ve varlığında toplam indirgeme aktiviteleri ve antioksidan aktiviteleri için, 96-kuyulu plakalarda yüksek verimli bir yöntem kullanılarak üç bağımsız teknik kopyada ölçülmüştür (SynergyTM HTX Çok Modlu Mikroplaka Okuyucu, BioTek Instruments, Winooski, VT, ABD). Farklı reaksiyon mekanizmaları nedeniyle farklı test deneyleri kullanıldı: tek elektron transferi(SET) ve hidrojen atomu transferi(HAT). TEAC ve TPC testi SET'e dayalıyken [17,18], DPPH test testi için literatür SET, HAT veya hatta bu iki mekanizmanın bir kombinasyonunu temel alıp almadığı konusunda net değildir [{{6} }]. Foti[51] tarafından yakın zamanda yapılan bir çalışma, fenollerin, iki mekanizmanın bir kombinasyonu olan sıralı proton kayıplı elektron transferi (SPLET) yoluyla DPPH ile reaksiyona girebileceğini keşfetti. Orta kutupluluk ve iyonlaşma potansiyeli gibi faktörler, baskın mekanizmayı etkiler.

4.3.1. Toplam Fenolik İçerik (TPC)

Toplam fenol içeriği (TPC), daha önce Bobo-Garcia ve ark.[52] tarafından tarif edilen bir 96-kuyulu plakada Folin-Ciocalteu yöntemi kullanılarak belirlendi. bazı değişikliklerle.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). Bu testin genel adı yanıltıcıdır çünkü Folin-Ciocalteu reaktifi vitaminler ve mineraller gibi fenolik olmayan maddeler üzerinde de reaksiyona girer [22]. Biyoaktif bileşiklerin "toplam indirgeme aktivitesini" daha iyi tanımlar.

4.3.2. Trolox Eşdeğer Antioksidan Kapasitesi (TEAC)

Antioksidan aktivite, bazı modifikasyonlarla bir 96-kuyucuklu plakada TEAC tahlili kullanılarak belirlendi. 9.6 mg ABTS ve 1.66 mg potasyum persülfat ile 25 mL'ye kadar H2O ile doldurulmuş bir stok solüsyon hazırlandı ve karanlıkta oda sıcaklığında 12-16 saat inkübe edildi. Bu stok solüsyondan, 25 mL'ye %100 MeOH ile doldurulmuş 5 mL'lik bir stok solüsyonu içeren bir TEAC çalışma solüsyonu hazırlandı.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH*Radikal Süpürme

buantioksidanactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Sinerjizm ve Antagonizma

Antioksidan aktivitenin sinerjistik ve antagonistik etkilerinin analizi için, deneysel olarak elde edilen sonuçların, karşılık gelen konsantrasyondaki tek tek bileşenlerin etkilerinin toplamı ile hesaplanan teorik değerlerle bir karşılaştırması yapılmıştır [53]. Sinerjizm, iki veya daha fazla maddenin etkileşimini tanımlar, böylece birleşik eylem, ayrı ayrı hareket edenlerin toplamından daha büyük olur. Bunun aksine, antagonizma, iki veya daha fazla maddenin kombinasyon halinde etkileşiminin, bireysel etkilerinin toplamından daha az olan genel bir etkiye sahip olduğu bir olgudur.

4.5.İyonik Demir Tayini

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). Toplam demir ve iyonik demir arasındaki fark, demirli ve demirli demirin toplamı, bağlı demirdir.

4.6.HPLC-BABA

Fotometrik için kullanılan özütlerde askorbik asit, 5-kafeoilkinik asit ve kersetin-3-rutinosit ve bunların bozunma ürünlerinin antioksidanlarını ölçmek için

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99） hazırlandı. Türetilmiş bileşikler, ısıl işlem öncesi ve sonrası demirin varlığında ve yokluğunda saf standartlar analiz edilerek geçici olarak tanımlandı. Bu nedenle, yeni pik, kesici uç standardından türetilmelidir. Ayrıca, önerilen yapıyı doğrulamak için seçilen karışımlar HPLC-MS ile ölçülmüştür.

4.7. İstatistiksel analiz

Biyoistatistik testleri ve veri sonuçlarının sunulması ve çizilmesi için Microsoft Excel 2016 (Microsoft, Redmond, ABD) ve R İstatistikleri (sürüm 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020) kullanıldı. Tedavileri değerlendirmek ve bağlamak için çıkarımsal istatistikler, üç yollu bir varyans analizi (ANOVA), bir post hoc Tukey HSD testi ve Pearson korelasyonu kullanılarak yapıldı. Kullanılan R paketleri ggplot2 [55], ortalama [56] ve multcomp [57] idi.

5. Sonuçlar

Yukarıda açıklanan bulgulara dayanarak, askorbik asit, 5-kafeoilkinik asit ve kersetin-3-rutinosidin AOA'sı, molekül yapıları, konsantrasyonları, oranları ve diğer antioksidanlar ve demir ile etkileşimlerinden etkilenmiştir. Etkileşim, özellikle askorbik asit ve 5-kafeoilkinik asit birleştirildiğinde AOA'da bir rol oynuyor gibi görünmektedir. Burada sinerjistik ve antagonistik etkiler tespit edildi. Sıcaklık AOA üzerinde minimal bir etkiye sahipken, aynı zamanda sıcaklık, özellikle demir varlığında belirli karışımlardaki tüm antioksidanların stabilitesini etkilemiştir. Sadece askorbik asit konsantrasyonu, uzamış pişirme süresi ile demir yokluğunda azaldı ve 5-kafeoilkinik asit konsantrasyonu sadece demir varlığında azaldı, kuersetin-3-rutinosid konsantrasyonu ise sadece askorbik asit ile kombinasyon halinde azaldı. demir varlığı. Demir ile kombinasyon halinde, 5-kafeoilkinik asit, diğer molekülleri termik işlemle konsantrasyonlarının azalmasından koruyabildi.

Bitkilerde askorbik asit, 5-kafeoilkinik asit ve kersetin-3-rutinosit kombinasyonları sadece mümkün olmakla kalmaz, aynı zamanda yaygındır. Dolayısıyla, bu sonuçlar sebzelerin pişirilmesi sırasında meydana gelen süreçler hakkında temel bilgiler vermektedir. Gıda matrisleri daha karmaşıktır ve enzimler, diğer mineraller veya asitler dahil olmak üzere reaksiyon koşullarını değiştiren veya kendileri reaktan olan sayısız biyoaktif bileşik içerir. Bu karmaşık etkileşimler, bu çalışmanın kapsamının çok ötesindedir ve yararlı konsantrasyonlar ve etkileşimler.antioksidanlarpişmiş sebzelerde gelecekte ele alınmalıdır.

Referanslar

1. Mellor, DD; Naumovski, N. Diyabette Kakaonun Etkisi: Bir Antioksidan Etkiden Daha Fazlası, Ana Hedef Organlar Olarak Pankreas ve Karaciğerin Potansiyeli? Int. J. Gıda Bilimi. Teknoloji. 2016, 51, 829-841. [Çapraz Referans]

2. Crozier, A.; Jaganath, IB; Clifford, MN Fenoller, Polifenoller ve Tanenler: Genel Bir Bakış. Bitki İçi İkincil Metabolitler: İnsan Beslenmesinde Oluşumu, Yapısı ve Rolü; Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., Eds.; Blackwell Yayıncılık: Hoboken, NJ, ABD, 2006; s. 1-24. ISBN 1-4051-2509-8.

3. Miller, D. "Otoksidasyon" Reaksiyonlarının Katalizörleri Olarak Geçiş Metalleri. Ücretsiz Radic. Biol. Med. 1990, 8, 95-108. [Çapraz Referans]

4. Buchner, N.; Krumbein, A.; Rohn, S.; Kroh, LW Termal İşlemin Flavonoller Rutin ve Quercetin Üzerindeki Etkisi. Hızlı Komün. Kütle Spektromu. 2006, 20, 3229–3235. [Çapraz Referans]

5. Layrisse, M.; Garcia-Casal, MN; Solano, L.; Baron, MA; Arguello, F.; Llovera, D.; Ramirez, J.; Leets, İ.; Tropper, E. Demir Bis-Glisin Şelat, Fitatlar ve Polifenoller ile Zenginleştirilmiş Kahvaltılardan İnsanlarda Demir Biyoyararlanımı. J. Nutr. 2000, 130, 2195-2199. [CrossRef] [PubMed]

6. Hurrell, RF; Reddi, M.; Cook, JD, Polifenolik İçeren İçecekler Tarafından İnsanda Hem Olmayan Demir Emiliminin İnhibisyonu. Br. J. Nutr. 1999, 81, 289-295. [CrossRef] [PubMed]

7. Kostyuk, VA; Potapovich, Silika Kaynaklı Hücre Hasarına Karşı Flavonoid Korumada AI Antiradikal ve Şelatlama Etkileri. Kemer Biyokimya. Biyofiz. 1998, 355, 43-48. [CrossRef] [PubMed]

8. Kejik, Z.; Kaplanek, R.; Masarik, M.; Babula, P.; Matkowski, A.; Filipenský, P.; Veselá, K.; Gburek, J.; Sikora, D.; Martasek, P.; et al. Flavonoidlerin Demir Kompleksleri-Antioksidan Kapasitesi ve Ötesi. Int. J. Mol. bilim 2021, 22, 646. [CrossRef]

9. Latos-Brozio, M.; Masek, A. Çeşitli Polimerizasyon Yöntemleriyle Elde Edilen Monomerik ve Polimerik Polifenollerin (Kuersetin, Rutin ve Kateşin) Yapı-Aktivite İlişkilerinin Analizi. Kimya Biyodiverler. 2019, 16, e1900426. [CrossRef] [PubMed]

10. Gullón, B.; Lu-Chau, TA; Moreira, MT; Lema, JM; Eibes, G. Rutin: Ekstraksiyon, Tanımlama ve Saflaştırma Yöntemleri, Biyolojik Aktiviteleri ve Biyoyararlanımını Geliştirmeye Yönelik Yaklaşımlar Üzerine Bir İnceleme. Trendler Gıda Bilimi Teknoloji. 2017, 67, 220–235. [Çapraz Referans]