Baba Nikotini Korku Hafızasını Güçlendirir, Nikotin Yönetimini Azaltır ve Yavrularda Hipokampal Genetik ve Nöral Fonksiyonu Değiştirir
Mar 21, 2022
İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com
Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Münir Güneş Kutlu2|Robert D. Cole3|Valeria Lallai4|Aswathy Sebastian5|İstvan Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1
1Biyodavranış Sağlığı Departmanı, Penn State Üniversitesi, University Park, Pennsylvania
2Farmakoloji Bölümü, Vanderbilt Tıp Fakültesi, Nashville, Tennessee
3Eczacılık Fakültesi, Kentucky Üniversitesi, Lexington, Kentucky
4Nörobiyoloji ve Davranış Bölümü, California Üniversitesi Irvine, Irvine, California
5Biyoinformatik, Biyokimya ve Moleküler Biyoloji, Penn State University, University Park, PA
6Psikoloji Bölümü, Temple Üniversitesi, Philadelphia, Pensilvanya
Soyut
Nikotin kullanımı, dünya çapında tüketilen tütün ve e-sigara ürünlerinde oldukça yaygın olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, nesiller arası epigenetik kalıtımın artan kanıtı, nikotin kullanımının sonraki nesillerde davranış ve nörobiyolojiyi değiştirebileceğini düşündürmektedir. C57BL6/J farelerinde babadan gelen kronik nikotin maruziyetinin F1 ve F2 yavrularında korku koşullanmasının yanı sıra F1'de koşullu korku tükenmesi ve kendiliğinden iyileşme, nikotin kendi kendine tatbikat, hipokampal kolinerjik işlev, RNA ifadesi ve DNA metilasyonu üzerindeki etkilerini test ettik. yavru. Babanın nikotine maruz kalması, gelişmiş bağlamsal ve ipucu korku koşullandırması ve sönmüş korku anılarının kendiliğinden iyileşmesi ile ilişkilendirildi. Ayrıca, kendi kendine uygulama paradigmasında değerlendirildiği gibi, nikotin babalı farelerde nikotin takviyesi azaltılmıştır. Bu davranışsal fenotipler, nikotine karşı değişen tepki, yukarı regüle edilmiş hipokampal nikotinik asetilkolin reseptörü bağlanması, azaltılmış uyarılmış hipokampal kolinerjik akımlar ve nöral gelişim ve plastisite ile ilgili hipokampal genlerin metilasyonu ve ekspresyonunda değişiklik ile birleştirildi. Gen ekspresyonu analizi, potansiyel olarak nöroplastisite ve zihinsel bozukluklarda yer alan daha geniş gen ağları üzerinde çok nesilli etkiler önermektedir. Korku koşullanmasındaki değişiklikler, benzer şekilde, travma sonrası strese benzer kaygı bozukluklarına benzer fenotipler önerir.
ANAHTAR KELİMELER: kolinerjik, hipokampus, öğrenme, nesiller arası, nikotin, nesiller arası
1. GİRİŞ
Biriken kanıtlar, kötüye kullanılan ilaçlara maruz kalmanın etkisinin, maruz kalmayan yavrularda fizyolojik ve davranışsal fenotipleri etkilemek için bireyin ötesine geçtiğini göstermektedir.1-3 Nikotinin etkilerinin nesiller arası karakterizasyonu, tütün ürünü kullanımının yaygınlığı4 ve dramatik artış göz önüne alındığında kritik öneme sahiptir. e-sigara kullanımının beyin kolinerjik sistemleri üzerindeki etkileri aracılığıyla, nikotine maruz kalma, beyin işlevinde nikotin bağımlılığının altında yatan ve depresyon6 ve anksiyete dahil olmak üzere psikiyatrik bozukluklar için artan riske katkıda bulunan belirgin değişiklikler üretir.7 Kolinerjik aktivasyonun aşağısındaki epigenetik modifikasyonlar, hücresel ve devre fonksiyonu üzerinde kalıcı etkilere izin verir.8,9 Yakın zamana kadar, bu epigenetik modifikasyonların germ hattının kurulmasıyla silindiğine ve böylece sonraki nesillerden ayrıldığına inanılıyordu. Bununla birlikte, bir nesilde edinilen DNA metilasyonu, histon translasyon sonrası modifikasyonları ve kodlayıcı olmayan RNA'ları içeren epigenetik modifikasyonlar, bir sonraki nesilde kalıtsal olabilir.10,11 Bu epigenetik modifikasyonlar, ebeveyn nikotine maruz kalmanın yavru davranışı ve nörobiyoloji üzerindeki çok nesilli ve nesiller arası etkilerine aracılık edebilir. .
Birden fazla bağımsız laboratuvardan yapılan kemirgen çalışmaları, ebeveyn nikotine maruz kalmanın nesiller arası ve nesiller arası sonuçlarını belirlemeye başladı. Bu çalışma şimdiye kadar ebeveyn nikotin maruziyetinin depresif ve anksiyete benzeri fenotipler,1 bilişsel esneklik,2 dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu (DEHB) benzeri davranışlar,3 ve gen ifadesi üzerindeki etkilerini tanımlamıştır.1,2 nikotine maruz kalma, nikotin bağımlılığı ve zihinsel sağlıkla ilgili endofenotipleri etkileyebilir. Örneğin, nikotine maruz kalmanın, travma sonrası stres bozukluğu (PTSD) ve bağımlılık gibi zihinsel sağlık bozukluklarına karşı savunmasızlıkla ilişkili bir hipokampus bağımlı korku öğrenme modeli olan bağlamsal korku koşullandırmasını modüle ettiğini gösterdik.12-14 Nikotin'in bağlamsal korku öğrenme üzerindeki etkiler hipokampus tarafından modüle edilir.15,16 Akut nikotine maruz kalmanın hipokampusa bağlı korku öğrenmeyi geliştirdiğini,15,17 bağlamsal korkunun yok edilmesini bozduğunu,18,19 ve aşağıdaki bağlamsal korkunun kendiliğinden iyileşmesini arttırdığını bulduk. neslinin tükenmesi.18 Bununla birlikte, baba tarafından nikotine maruz kalmanın bu fenotipler üzerindeki nesiller arası ve nesiller arası etkileri araştırılmamıştır. Ayrıca, önceki hiçbir çalışma nikotinin kolinerjik fonksiyon üzerindeki çok nesilli etkilerini karakterize etmemiştir. Çok kuşaklı kalıtım, maruz kalan bireylerden hemen sonraki kuşakta ortaya çıkan fenotiplere atıfta bulunurken, kuşaklar arası kalıtım, fenotipik varyasyona yol açan doğrudan çevresel etkilerin yokluğunda kuşaklar arasındaki epigenetik bilginin germ-hattı aracılığıyla kalıtılmasından oluşur.11 Burada, hem çok kuşaklı hem de çok kuşaklıları inceledik. ve baba tarafından nikotine maruz kalmanın F1 ve F2 kuşağında bağlamsal ve işaretli korku öğrenimi ve ayrıca kendi kendine nikotin uygulaması, hipokampal nikotinik asetilkolin reseptörü (nAChR) bağlanması, hipokampal kolinerjik işlev, hipokampal gen ifadesi ve hipokampal DNA metilasyonu üzerindeki kuşaklar arası etkileri. F1 nesli. Baba tarafından nikotin maruziyetinin korku şartlandırmasını, hipokampal gen ekspresyonunu ve yavrularda ve büyük yavrularda işlevi etkileyeceğini varsayıyoruz.
cistanche özü etkileri
2 YÖNTEM VE MATERYALLER
2.1 Konular
Denekler erkek ve dişi C57BL/6J fareleriydi (8-20 haftalık, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Harem yetiştiriciliği için barınma dışında, tüm hayvanlar 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü ve ad libitum yiyecek ve suya erişim ile grup halinde barındırıldı. Kendi kendine uygulama sırasında, denekler, serbest beslenen vücut ağırlıklarının yüzde 85 ila yüzde 90'ı ile sınırlı gıdaya tabi tutuldu ve su, ad libitum sağlandı. Tüm davranış testleri 09:00 AM ve 6:00 PM arasında gerçekleşti. Tüm prosedürler, Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzuna uygun olarak yürütüldü ve Penn State Üniversitesi, Temple Üniversitesi veya California Üniversitesi Irvine IACUC komiteleri tarafından onaylandı.
2.2 Baba tarafından nikotin maruziyeti
Erkekler (8 hafta) içinde çözülmüş yüzde 0.9 steril salin veya nikotin hidrojen tartarat tuzu (12.6 mg/kg/gün, serbest baz ağırlık—Fisher Scientific, Waltham, MA veya MP Biomedical, Santa Ana, CA) aldı. 0%0,9 steril salin, 28 gün boyunca ozmotik mini pompalar (Alzet, Model 1004, Durect, Cupertino, CA) yoluyla deri altından verilir. Bu doz, orta düzeyde sigara içen insanlarda görülenlerle karşılaştırılabilir plazma nikotin ve kotinin seviyeleri üretir.20,21
2.3 F1 ve F2 farelerinin üretilmesi
Farelerde nikotinin yarı ömrü yaklaşık 6 dakikadır.22 Daha önce nikotinin kesilmesinin etkilerinin nikotinin çıkarılmasından 4 gün sonra dağıldığı gösterilmişti.23-25 Bu nedenle, nikotin tedavisi ile nikotin tedavisi arasında 4 günlük bir gecikme olduğu gösterilmiştir. üreme öncesi nikotinin sistemik olarak ortadan kaldırılmasını sağlamak için üreme uygulandı. Erkek fareler, F1 yavruları oluşturmak için 2 hafta boyunca iki saf C57BL/6 J dişi (8-20 haftalık) ile kafeslere yerleştirildi. F2 fareleri, saf erkek F1 farelerinin saf dişilerle çiftleştirilmesiyle üretildi.
2.4 Korku koşullandırma
Korku koşullandırma ve yok olma prosedürleri daha önce ayrıntılı olarak tarif edilmiştir.19 Kısaca, fareler gürültü azaltıcı odalarda (18.8 × 20 × 18.3 cm, 65 dB arka plan gürültüsü) eğitilmiş ve test edilmiştir; MED Associates, St. Albans, VT). F1 ve F2 fareleri, 120 saniye ile ayrılmış iki koşullu uyarıcı (CS, 30 s, 85-dB beyaz gürültü)-koşulsuz uyarıcı (ABD, 2 s, 0.57-mA ayak şokları) eşleştirmeleriyle korkuyla koşullandırılmıştır. F1 ve F2 farelerde nikotinin korku koşullandırması üzerindeki akut etkilerini incelemek için, yavrulara 2 ila 4 dakika önce akut nikotin (0.09 mg/kg, NIC serbest baz ağırlığı, ip; nikotin hidrojen tartrat tuzu, Fisher Scientific) veya salin (SAL) verildi. eğitim ve test oturumları için. Eğitimden yirmi dört saat sonra, bağlamsal donmayı değerlendirmek için fareler 5 dakika boyunca eğitim bağlamına geri döndürüldü. Bağlamsal testten sonra, fareler, korkuyla öğrenmeyi değerlendirmek için farklı odalara yerleştirildi. Deneyciler, tarafsız bir zaman örnekleme yöntemiyle, solunum dışında istemli hareketin olmaması olarak tanımlanan, donma olarak değerlendirilen koşullara karşı kör oldular.19 İşaretli testler sırasında potansiyel tavan etkilerini incelemek için, ayrı bir F1 faresi kohortu, yalnızca bir CS-US ile aynı eğitimi aldı. eşleştirme ve bağlamsal korku tükenmesi ve kendiliğinden iyileşme de incelenmiştir. Korku tükenmesi, bağlamsal ve ipucu korku testlerinden sonraki gün başlayan ardışık beş oturumda gerçekleşti. Son yok olma oturumunun ardından, fareler 7 gün boyunca ev kafeslerinde rahatsız edilmeden bırakıldı ve ardından kendiliğinden iyileşme için eğitim bağlamında yeniden test edildi. Korku koşullandırmasında gözlemlenen herhangi bir farklılığın şok duyarlılığı, kaygı veya daha geniş öğrenme eksikliklerindeki farklılıklardan kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için erkek ve dişi NIC- ve SAL-Sired hayvanları ek olarak açık bir alanda, şok duyarlılığında, yükseltilmiş artı labirentte test edildi ( EPM) ve yeni nesne tanıma paradigmaları (tüm yöntemler ve sonuçlar için Destekleyici Bilgilere bakın).
2.5 Gıda ve intravenöz nikotin kendi kendine tatbikat
A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>Müteakip üç seans boyunca seans başına 25 pelet), deneklere daha önce tarif edildiği gibi izofluran (yüzde 1 - yüzde 3)/oksijen buharı anestezisi altında juguler ven kateterize edildi.26 Farelerin erişimden önce ameliyattan 72 saat veya daha uzun süre sonra iyileşmesine izin verildi. bir yemek ödülü için tekrar cevap vermek için. Gıda tepkisinin yeniden kurulması, farelerin intravenöz cerrahi sonrası yeterince iyileşmesini ve edim odalarına erişimde bir gecikmenin ardından normal edimsel tepki sergilemesini sağlar. Daha sonra farelerin haftada 6 ila 7 gün, 1 saatlik günlük seanslar sırasında intravenöz (IV) nikotin kendi kendine tatbikatını almalarına izin verildi (nikotin hidrojen tartrat tuzu 0%9 steril salin içinde çözülmüş, {{1{ {12}}}}.03 mg/kg/infüzyon, serbest baz ağırlık; MP Biomedical, Santa Ana, CA). IV nikotin, bir Razel şırınga pompası (Med Associates) ile verildi. Her seansta iki geri çekilebilir kol vardı (bir aktif, bir aktif değil). Aktif koldaki yanıt kriterlerinin tamamlanması, IV nikotin infüzyonunun verilmesiyle sonuçlandı (0.{{20}}3 ml infüzyon hacmi; FR5TO20 sn programı). Etkin olmayan koldaki yanıtlar kaydedildi, ancak planlanmış sonuçları yoktu. 0.03 mg/kg/infüzyonda sekiz edinim seansının ardından, infüzyon dozu altı seans için 0.1 mg/kg/infüzyona geçti. Her doz için, istatistiksel analizler için son üç seansın ortalama alımı kullanıldı. Kateterler, heparin (100 USP birimi/ml) içeren fizyolojik steril tuzlu su (yüzde 0.9 a/h) ile günlük olarak yıkandı. Kateter açıklığı, nikotin kendi kendine uygulama aşamasını takiben Brevital (metoheksital sodyum, Eli Lilly, Indianapolis, IN) ile doğrulandı. Nüksetmeye bağlı davranışı değerlendirmek için, fareler, kendi kendine IV nikotin uygulamasının son 0.1 mg/kg/infüzyon dozunun hemen ardından seanstan sonra aşerme inkübasyonu için test edildi; bu prosedürde, farelerin aktif kol üzerinde tepki vermesine izin verilir, ancak nikotin infüzyonu almazlar. İlk temel inkübasyon oturumunda (1. gün), fareler, koşullu işaret ışığı aktivasyonu ile FR5TO20 sn programı kapsamında edimsel odalara yerleştirildi. Daha sonra fareler 20 gün boyunca ev kafeslerinde tutuldu. Yoksunluğun 21. gününde, fareler, FR5TO20 sn programı altında verilen aktif kaldıraç işaret ışığı ile, aşerme inkübasyonu için incelendi. Çalışmalar, grup koşullarına kör olan deneyciler tarafından yürütüldü ve davranışsal tepkiler, MedAssociates yazılımı tarafından otomatik olarak kaydedildi.
2.6 Nikotinik asetilkolin reseptörü bağlanması
8 haftalık NIC-Sired (5 M ve 10F) ve SAL-Sired (9 M ve 6F) F1 farelerinden alınan hipokampi kullanılarak bir radyoligand bağlanma tahlili16 gerçekleştirilmiştir. Örnekler, lizis tamponu (5 mM Tris artı 5 mM EDTA artı 5 mM EGTA) kullanılarak homojenleştirildi, 100 000 g'de 4 derecede 30 dakika santrifüjlendi, lizis tamponu içinde yeniden süspanse edildi ve tekrar santrifüjlendi. Peletler, Tris/10 yüzde sükroz tamponu içinde yeniden süspanse edildi ve [3H] Epibatidin ([3H]EB) (27,28'e göre ~2 nM) (spesifik aktivite 54.1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, MA) ile 1 süreyle inkübe edildi. saat oda sıcaklığında. [3 H]EB, nAChR bağlanması için seçildi, çünkü önceki sonuçlar hipokampal heteromerik 4 2 nAChR'lerin nikotinin korku koşullandırma üzerindeki etkilerine aracılık ettiğini gösterdi.17 Spesifik olmayan bağlanma, 300 μM nikotin (nikotin hidrojen tartrat tuzu) varlığında değerlendirildi. Tris Tamponu içinde çözülmüş, serbest baz konsantrasyonu). [3H]EB'ye bağlı nAChR'ler süzüldü (24 oyuklu hücre toplayıcı, Brandel Co, Gaithersburg, MD) ve bir sıvı sintilasyon sayacı (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) filtre radyoaktivitesini ölçtü. fmol/mg doku olarak ifade edilen spesifik bağlanma, toplam ve spesifik olmayan bağlanma arasındaki fark olarak hesaplandı.16
2.7 In vivo amperometrik kolinerjik kayıtlar
Amperometri kullanarak hipokampal kolinerjik iletimdeki değişiklikleri değerlendirmek için saf 10 ila 20 haftalık NIC-Sired ve SAL-Sired F1 farelerinden oluşan ayrı bir kohort kullanıldı. Çiftler halinde (üst ve alt) düzenlenmiş 4 (15 × 333 μm) platin kayıt bölgesi ile seramik bazlı mikroelektrotlar (Mikroelektrot Teknolojisi Merkezi, Lexington, KY), kolin oksidaz ile kaplanmıştır (EC Numarası 1.1.3.17; Sigma‐ Aldrich, St. Louis, MO), daha önce bildirildiği gibi.29 Elektrotlar, kolin akımlarını saptamak için seçiciliği arttırmak için meta-fenilendiamin (m-PD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ile elektropolimerize edildi. Asetilkolin (ACh) salınımının hassas bir indeksini sağlamak için duyarlılığı 3pA/μM'ye eşit veya daha büyük olan ve kolin için algılama sınırı 400 nM'ye eşit veya daha düşük olan mikroelektrotlar kullanıldı.30 Hayvanlar üretan (1.2‐1.5) ile anesteziye tabi tutuldu. g/kg, ip) ve enzim kaplı mikroelektrotlar stereotaksik olarak dorsal (A/P -1.7 mm, M/L ± 1.5 mm, D/V -2.3 mm) veya ventral (A/P -3.1 mm, M) içine indirildi. /L ± 3.0 mm, D/V -4,3 mm) hipokampus. Bağlamsal korku koşullanmasına farklı şekilde katkıda bulundukları için ventral ve dorsal hipokampus ayrı ayrı değerlendirildi: ventral hipokampus (vHPC) korku ilişkilendirmesinde ve ifadesinde daha belirgin bir role sahipken, dorsal hipokampus (DHCP) bağlamsal bellek için kritik öneme sahiptir.31 Ag/ AgCl referans elektrotları kontralateral rostral kortekse implante edildi.
Amperometrik kayıtlar, artı 0.7 V sabit bir potansiyel uygulanarak 2 Hz'de yapıldı ve veriler sayısallaştırıldı (FAST-16 potansiyostat, Quainton, Nicholasville, KY). Arka plan akımları 60 dakika stabilize edildi, ardından elektrota bağlı bir cam kapiler (uç çapı:15 µm) kullanılarak ilaçlar hipokampusa uygulandı. Depolarizasyonla uyarılmış ACh salınımı, her 2 dakikada bir 2 ila 10 psi'de kısa potasyum darbeleri (KCl 70 mM; 100 NL) veya NIC (1 mM serbest baz, nikotin tartrat; 100 NL) uygulanarak ölçülmüştür. Kayıtlar, hipokampal bölge (dorsal veya ventral) ve ilaç (potasyum veya NIC) için dengelendi. Kolin sinyal genlikleri, temel akımdan enzim kaplı kanaldaki akımdaki değişiklikle ölçüldü ve in vitro kalibrasyona dayalı olarak kolinin μM eşdeğerlerine dönüştürüldü. Sentinel kanallardan akımları çıkararak artefaktları ortadan kaldırmak için kendi kendine referanslama benimsendi.29 Mikroelektrot yerleşimi koronal hipokampal bölümlerin Nissl boyamasıyla doğrulandı (Şekil S1). İstatistiksel analiz için hayvan başına ilaç manipülasyonu başına iki yanıtın ortalaması kullanıldı.
2.8 İstatistiksel analiz
İstatistiksel karşılaştırmalar SPSS (IBM, Armonk, NY) veya GraphPad Prism (La Jolla, CA, ABD) kullanılarak yapıldı. Aykırı değerler, ortalamanın 2 standart sapma üzerindeki değerlerle belirlendi. Bir aykırı değer tespit edilirse, bilgiler sonuçlar bölümüne dahil edilir. Önem kriteri=.05 olarak belirlendi. İstatistiksel analiz, başlangıçta, hem erkek hem de dişi yavruları test eden tüm deneyler için bir faktör olarak cinsiyet dahil olmak üzere yapıldı. Cinsiyetle üç yönlü veya iki yönlü etkileşimler tespit edilmediğinde analizler cinsiyete göre çöktü (P > .05). Veriler uygun olduğu şekilde t-testi, 1-yollu veya 2-yollu ANOVA ile analiz edildi. Önemli ana veya etkileşim etkilerini, LSD sonrası hoc karşılaştırmalar izledi. Tekrarlanan ölçümler ANOVA'ları, çoklu karşılaştırmalar için düzeltme ile Bonferroni post hoc karşılaştırması izledi. Eşit olmayan varyanslar tespit edilirse, eşit olmayan varyanslar için Welch'in t testi kullanıldı ve serbestlik dereceleri aşağı yuvarlandı.
2.9 RNA/DNA izolasyonu
Yetişkin F1 farelerine (8 haftalık; n=3 M ve grup başına 3 F) servikal dislokasyon yoluyla ötenazi uygulandı. Hipokampi hızla ventral ve dorsal kısımlara ayrıldı (1:1 oranında), sol ve sağ taraflardan havuzlandı ve kuru buz üzerinde flaş donduruldu. DNA ve RNA birlikte izole edildi ve bir AllPrep DNA/RNA Mini Kiti (Qiagen, Valencia, CA) kullanılarak saflaştırıldı. RNA ve DNA konsantrasyonu ve kalitesi, NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) ve Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) kullanılarak değerlendirildi. RNA ekstraksiyonları için minimum RNA Bütünlük Sayısı (RIN) 8,5'tir.
2.10 Transkriptom analizi yoluyla
RNA dizileme kitaplıkları, Huck Institutes of the Life Sciences Genomics Core Facility (Penn State University) tarafından Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) kullanılarak 150 bp tek uçlu okumalar için hazırlanmıştır. ve hızlı çalışma modunda Illumina HiSeq 2500 üzerinde sıralanmıştır (örnek başına yaklaşık 10 milyon okuma ile ardışık üç çalışma). FASTQ dosyalarının kalitesi, FASTQC aracılığıyla kontrol edildi ve 30'dan büyük okuma başına ortalama Phred kalite puanlarına sahipti (yani, yüzde 0.1'den az sıralama hatası). FASTQ dosyaları, Galaxy Project33'te TopHat (v2.1.0)32 kullanılarak bir fare referans genomuna (mm10; UCSC Genom Tarayıcı) hizalandı. Kol Düğmeleri ve Manşet Birleştirme (v2.2.1.0)34, haritalanmış okumalardan transkriptleri birleştirmek ve son transkriptome montajı için transkript dosyalarını birleştirmek için kullanıldı. Yanlış keşif oranı (FDR) ayarlı P değerleri, Cuffdiff (v2.2.1.3),34 kullanılarak NIC-Sired ve SAL-Sired numunelerinden diferansiyel gen ekspresyonu için 0,05.35 standart FDR kesme değeriyle hesaplandı. Gen Ekspresyonu Omnibus'a.
2.11 Zenginleştirme analizi
Farklı şekilde ifade edilen genler, birleştirici biyolojik ağların potansiyel zenginleşmesini ortaya çıkarmak için yaratıcı yol analizi (IPA, Aralık 2018; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, ABD)36 kullanılarak analiz edildi. Gen ağı başına maksimum 35 molekül belirtilen parametreleri çalıştırın ve analizi memeli CNS dokusu veya hücre hatlarıyla sınırlandırın. Zenginleştirme için istatistiksel önem, çoklu test için düzeltilmiş sağ kuyruklu Fisher'ın kesin testi kullanılarak belirlendi.
2.12 Hedeflenen bisülfit dizilimi
DNA metilasyon analizi için RNA ile birlikte izole edilmiş DNA (bkz. Bölüm 2.9) kullanıldı. RNA-seq, sırasıyla vHPC ve DHCP'de 952 ve 162 diferansiyel olarak eksprese edilmiş gen tanımladı. Bu birleşik listelerden 1010 benzersiz gen, özel bir SeqCap Epi Zenginleştirme Sistemi (Roche, Pleasanton, CA, ABD; Tablo S1) kullanılarak bisülfit-seq'de zenginleştirme için seçildi.38 Hedeflenen bisülfit dizileme, Yaşam Bilimleri Genomik Çekirdek Tesisinin Penn State Huck Enstitülerinde yapıldı. Kütüphaneler KAPA Hyper Prep kiti (Kapa Biosystems, Wilmington, MA) kullanılarak oluşturulmuştur. Sodyum bisülfit dönüştürülmüş kütüphaneler, özel bir yakalama probu seti (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, ABD) kullanılarak seçilen genomik bölgeler için PCR ile büyütüldü ve zenginleştirildi. Yakalanan DNA, 100 nt çift uçlu okuma kullanılarak Illumina HiSeq 2500'de dizildi. FASTQ dosyalarının kalitesi FASTQC ile kontrol edildi. Illumina adaptör dizileri kaldırıldı ve düşük kaliteli bazlar Trimmomatic kullanılarak kırpıldı.39 Düşük kaliteli taban kırpma, kayar pencere yaklaşımıyla yapıldı, dört taban çifti penceresindeki ortalama kalite 20'lik bir eşiğin altına düştüğünde kırpma yapıldı. minimum okuma uzunluğu 35. Kırpmadan sonra, FASTQ dosyaları 30'dan büyük okuma başına ortalama Phred kalite puanlarına sahipti (yani, yüzde 0.1'den az sıralama hatası). Kırpılan okumalar, Bismark'ta uygulanan Bowtie240 kullanılarak fare referans genomuna (mm10) eşlendi.41 Bismark içindeki Metil_ekstresi, CpG metilasyon bilgilerini çıkarmak ve metilasyon raporları oluşturmak için kullanıldı. MetilKit42, diferansiyel olarak metillenmiş bölgelerin (DMR'ler) analizi için kullanıldı. Metilasyon durumu, 500 baz çiftinin örtüşmeyen pencereleri üzerinde özetlendi ve diferansiyel metilasyon analizi yapıldı, standart FDR 0.05.35 ile Veri kümeleri Gene Expression Omnibus'a yatırıldı.
Cistanche özütünün faydası
3. SONUÇLAR
3.1 Babadan gelen nikotin, F1 ve F2 nesli farelerde bağlamsal korku koşullandırmasını geliştirir ve bağlamsal korku koşullandırmasının akut nikotin artışını tersine çevirir
NIC-Sired ve SAL-Sired F1 erkek ve dişi fareler, akut SAL veya NIC uygulamasının (0.09 mg/kg ip, Şekil 1A) ardından korkuyla koşullandırılmıştır. Temel, CS öncesi ve CS dondurmanın tam analizi, Destekleyici Bilgiler'e dahil edilmiştir. Faktörler olarak ana tedavi, akut ilaç tedavisi ve cinsiyet ile bağlamsal dondurmanın 3 yönlü bir ANOVA'sı, önemli bir ana × akut ilaç tedavisi etkileşimi ortaya çıkardı (F(1,36)=32.75, P < .{{27)="" }}01).="" cinsiyet="" ile="" baba="" veya="" akut="" ilaç="" tedavisi="" arasında="" anlamlı="" bir="" etkileşim="" olmadığı="" için,="" cinsiyete="" göre="" 2="" yönlü="" bir="" anova="" çöktü="" ve="" önemli="" bir="" ana="" tedavi="" x="" akut="" ilaç="" tedavisi="" etkileşimi="" ortaya="" çıktı="" (f(1,40)="20.96)." ,="" p="">< .001).="" post="" hoc="" karşılaştırmalar,="" salin="" ile="" tedavi="" edilen="" nic-sired="" f1="" farelerinin,="" salin="" ile="" tedavi="" edilen="" sal-sired="" f1="" fareleri="" ile="" karşılaştırıldığında="" artırılmış="" bağlamsal="" korku="" koşullandırması="" sergilediğini="" gösterdi="" (t20="2.73," p="">< .05).="" önceki="" bulgularla="" uyumlu="" olarak,="" 0,09="" mg/kg'da="" 43="" akut="" nic,="" sal-sired="" farelerde="" gelişmiş="" bağlamsal="" korku="" koşullandırması="" üretti="" (t22="2.99," p="">< .01).="" bununla="" birlikte,="" 0,09="" mg/kg'daki="" akut="" nic,="" nic'ye="" bağlı="" farelerde="" bağlamsal="" korku="" koşullandırmasını="" bozmuştur="" (t18="3.36," p="">< .01).="" genel="" olarak,="" nic-sired="" nic="" farelerindeki="" bağlam="" dondurma="" seviyeleri,="" her="" iki="" 0,09="" mg/kg'da="" sal-sired="" sal="" farelerinde="" gözlemlenenlerle="" karşılaştırılabilirdi="" (p=""> .05).
Ek olarak, erkek ve dişi NIC- ve SAL-Sired hayvanları, şok duyarlılığı (Şekil S2), yükseltilmiş artı labirent (EPM, Şekil S3), açık alan ve yeni nesne tanıma paradigmalarında (Şekil S4, tüm yöntemler için Destekleyici Bilgilere bakın) test edilmiştir. ve sonuçlar). EPM'deki NIC-Sired dişileri (artan kaygı benzeri davranışlar sergileyen) ve şok duyarlılığındaki NIC-Sired hayvanları (şoka karşı düşük ses tepkisi gösteren, bu artan korku öğrenme çok kuşaklı fenotipi etkilemez), fark yok NIC- ve SAL-Sired fareler arasında tespit edildi.
ŞEKİL 1 Babadan gelen nikotin, bağlamsal korku koşullandırmasını arttırır ve korku koşullandırmasının akut nikotin artışını hafifletir. Bağlamsal dondurma, SAL-Sired artı SAL kontrollerine kıyasla NIC-Sired artı SAL'da önemli ölçüde daha yüksekti. 0.09 mg/kg'da akut nikotin, SAL-Sired'de bağlamsal korku koşullandırmasını artırdı, ancak NIC-Sired hayvanlarında bağlamsal korku koşullandırmasını önemli ölçüde azalttı (grup başına n=10-12). B, Bağlamsal dondurma, SAL-grandsire artı SAL kontrolleri ile karşılaştırıldığında NIC-grandsire artı SAL'da önemli ölçüde daha yüksekti (grup başına n=9-11). Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını gösterir, *P <>
Bozulmuş bağlamsal korku koşullandırmasının gelecek nesilde (F2) devam edip etmediğini belirlemek için, NIC-grandsire ve SAL-grandsire erkek ve dişi F2 fareleri, saf F1 erkek farelerden yetiştirildi. Temel, CS öncesi ve CS dondurmanın tam analizi, Destekleyici Bilgiler'e dahil edilmiştir. Grandsire tedavisi, akut ilaç tedavisi ve bağımsız faktörler olarak cinsiyet ile 3 yollu bir bağlamsal dondurma ANOVA'sı yapıldı (Şekil 1B). Cinsiyet ile baba veya akut ilaç tedavisi arasında anlamlı bir etkileşim olmadığı için, cinsiyete göre 2 yönlü bir ANOVA çöktü. Babanın (F(1,37)=9.88, P < .01)="" önemli="" bir="" ana="" etkisi="" bulundu="" ve="" post="" hoc="" karşılaştırmalar,="" nic-gransire="" farelerinin,="" karşılaştırıldığında="" artırılmış="" bağlamsal="" korku="" koşullandırması="" sergilediğini="" gösterdi.="" sal-grandsire="" fareleri="" ile="" (t39="3.04," p="">< 0.01).="" ek="" olarak,="" akut="" nic="" uygulanan="" sal-grandsire="" fareleri,="" bağlamsal="" korku="" koşullandırmasını="" (t19="2.41," p="0.026)" artırdı,="" ancak="" akut="" nic,="" nic-gransire="" farelerinde="" bağlamsal="" korku="" koşullandırmasını="">
ŞEKİL 2 Babadan gelen nikotin, işaret edilen korku koşullandırmasını ve korku hafızasının kendiliğinden iyileşmesini geliştirir. Cued testi sırasında potansiyel tavan etkilerini incelemek için, ayrı bir F1 faresi kohortu, yalnızca bir CS-US eşleştirmesi ile aynı eğitimi aldı. NIC-Sired farelerde, 1 CS-US eşleştirmesi ile eğitilmiş SAL-Sired farelere kıyasla (grup başına n=8-10) hem bağlamsal hem de ipucu korku koşullandırması artırıldı. B, Babanın nikotine maruz kalması bağlamsal korkunun yok olmasını etkilemedi ama son yok olma seansından 7 gün sonra korku hafızasının kendiliğinden iyileşmesini artırdı (grup başına n=8-10). Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını gösterir, *P <>
3.2 Babadan gelen nikotin, F1 nesli farelerde işaret edilen korku koşullandırmasını geliştirir
Bir tavan etkisinin, işaretli korku koşullandırması için grup farklılıklarının saptanmasını engelleyip engellemediğini incelemek için (bkz. Destekleyici Bilgiler), ayrı bir F1 fare grubu, bir CS-US eşleştirmesi ile eğitildi. Bu kohortta, NIC-Sired farelerinde (t6=2.41, P < .="" 05;="" şekil="">
3.3 Babadan gelen nikotin, F1 nesli farelerde bağlamsal korku hafızasının kendiliğinden iyileşmesini artırır
Bir CS-US eşleştirmesi alan F1 farelerinin kohortu, daha sonra, bağlamsal korku hafızasının neslinin tükenmesi ve kendiliğinden iyileşmesi için test edildi. F1 NIC-Sired fareleri, normal korku tükenmesi gösterdi, ancak SAL-Sired farelere göre bağlamsal korku hafızasında gelişmiş spontan iyileşme sergiledi (t7=3.38, P < 0.05;="" şekil="">
3.4 Babadan gelen nikotin, kendi kendine nikotin uygulamasını azaltır
Kendi kendine nikotin tatbikatı için eğitimden önce, denekler yiyecek ödülü almak için edimsel bir görevi öğrenme yetenekleri açısından analiz edildi ve hiçbir farklılık gözlemlenmedi (Destekleyici bilgi, Şekil S5). F1 yavrularında nikotin takviyesine sire nikotin maruziyetinin potansiyel etkilerini test etmek için, IV nikotin kendi kendine tatbikatının (0.03 mg/kg/infüzyon) edinimi, 2 yönlü karma tasarımlı bir ANOVA'da değerlendirildi. seansın ana etkisi (F(7,119)=13.60, P < .001)="" ve="" seans="" ×="" ana="" tedavi="" etkileşimi="" (f(7,119)="5.00," p="">< .001).="" ancak,="" post="" hoc="" testler,="" sekiz="" kazanım="" oturumunun="" her="" birinde="" gruplar="" arasında="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" bir="" farklılık="" ortaya="" çıkarmadı="" (şekil="" 3a).="" aktif="" ve="" aktif="" olmayan="" kaldıraç="" preslerinin="" sayısı,="" daha="" sonra="" grupların,="" oturumun="" ana="" etkisini="" tanımlayan="" (f(7,238)="" {{20})="" edinme="" sırasında="" aktif="" kaldıraç="" için="" oturumlar="" arası="" bir="" tercih="" sürdürüp="" sürdürmediğini="" belirlemek="" için="" analiz="" edildi="" (şekil="" 3b).="" }.18,="" p="">< .001)="" ve="" bir="" seans="" ×="" ana="" tedavi="" etkileşimi="" (f(21,238)="11.40," p="">< .001).="" post="" hoc="" analiz,="" grupların="" kendi="" kendine="" nikotin="" uygulamasının="" ilk="" gününde="" farklılık="" gösterdiğini="" ortaya="" çıkardı.="" nic-sired="" grubu,="" sal-sired="" grubu="" ile="" karşılaştırıldığında="" daha="" fazla="" aktif="" kol="" bastırma="" sergiledi.="" bu="" etki,="" maruziyetin="" ilk="" gününde="" daha="" yüksek="" düzeyde="" ilaç="" arama="" davranışını,="" yiyecek="" ödülü="" için="" yanıt="" verme="" azmini="" ve/veya="" gıdadan="" ilaca="" geçişte="" bilişsel="" esnekliğin="" azalmasını="" temsil="" edebilir.="" ancak,="" bu="" fark="" sonraki="" seanslarda="" devam="" etmedi.="" sal-sired="" fareleri,="" aktif="" olmayan="" kollarına="" kıyasla="" aktif="" kaldıraç="" için="" istatistiksel="" olarak="" anlamlı="" bir="" tercih="" sergiledi="" (post="" hoc="" p="">< .01),="" ancak="" nic-sired="" fareleri,="" 3="" ila="" 8="" seansları="" için="" bu="" korunan="" tercihi="">
ŞEKİL 3 Babadan gelen nikotin, kendi kendine nikotin uygulamasını azaltır. Bir NIC- ve SAL-Sired erkek fare (grup başına n=9‐10), 0 üzerinde edinim süresi boyunca her seans için kazanılan toplam infüzyon sayısında farklılık göstermedi. .03 mg/kg/infüzyon dozu. B, Edinme sırasında, NIC-Sired farelerin nikotininin SAL-Sired farelere kıyasla daha fazla sayıda aktif kol preslerinin sergilenmesiyle, ilk seansta aktif ve aktif olmayan kaldıraç preslerinin sayısı önemli ölçüde farklılık göstermiştir. Bununla birlikte, sonraki seanslarda, NIC-Sired fareleri yanıt vermeyi azalttı ve 3 ila 8 seansları arasında aktif ve aktif olmayan kaldıraç presleri sayıları arasında önemli bir fark olmamasına neden oldu. etkin olmayan kolları üzerinde. C, Son üç edinme seansı boyunca ortalama nikotin infüzyonu sayısı, NIC- ve SAL-Sired fareler arasında önemli ölçüde farklılık göstermedi. D, 0.1 mg/kg/infüzyon gibi orta bir dozda, NIC-Sired fareleri kendi kendilerine önemli ölçüde daha düşük sayıda nikotin infüzyonu uyguladılar. E, Özlem değerlendirmesinin inkübasyonu, yalnızca SAL-Sired fareler için 21 günlük yoksunluktan sonra önceden aktif olan kola yanıt vermede önemli bir artış ortaya çıkardı. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını gösterir, *P <>
Edinmenin ilk aşamasında değişkenliği kontrol ederken potansiyel grup farklılıklarını daha fazla incelemek için, deneklerin nikotin için daha tutarlı tepkiler gösterdiği son üç seans için ortalama nikotin infüzyonu sayısı incelenmiştir (Şekil 3C). Gruplar, ortalama nikotin infüzyonu sayısında anlamlı farklılık göstermedi (P > .05). Daha sonra, fareler, daha önce yetişkin C57BL6/J farelerinde tercih edildiği gösterilen 0.1 mg/kg/infüzyon dozunda nikotine geçirildi.44 Bu dozda, NIC-Sired fareleri kendi kendilerine daha az sayıda infüzyon uyguladılar (t{ {7}}.20, P < .05;="" şekil="" 3d).="" yoksunluk="" sırasında="" artan="" uyuşturucu="" arayışının="" bir="" ölçüsü="" olarak="" kabul="" edilen="" aşerme="" davranışının="" inkübasyonu="" için,="" seans="" ve="" baba="" tedavisi="" ile="" 2="" yönlü="" karma="" tasarımlı="" bir="" anova,="" seansın="" ana="" etkisini="" tanımladı="" (f(1,17)="" {{16}="" }.90,="" p="">< .001).="" sal-sired="" hayvanları,="" 1.="" güne="" kıyasla="" yoksunluğun="" 21.="" gününde="" daha="" büyük="" tepkilerle="" bir="" kuluçka="" etkisi="" sergilerken,="" nic-sired="" fareleri="" nikotin="" arama="" davranışında="" bir="" artış="" göstermedi="" (p=""><>
3.5 Baba tarafından nikotin maruziyeti hipokampal kolinerjik bağlanmayı ve işlevi değiştirir
Yüksek afiniteli hipokampal heteromerik nAChR bağlanması, NIC-Sired F1 farelerinde yukarı doğru düzenlenmiştir (t28=2.14, P < .05;="" sal-sired="1.21" ±="" {{10})="" }.043,="" nic-sired="1.34" ±="" 0.044).="" bağlanma="" değerleri="" ortalamanın="" iki="" standart="" sapma="" üzerinde="" olduğu="" için="" bir="" denek="" (nic-sired)="">
Potasyum ve nikotinle uyarılmış ACh akımlarının amperometrik kayıtları F1 dHPC ve vHPC'de değerlendirildi. Cinsiyet başına eşit olmayan örneklem büyüklükleri nedeniyle, bu analizlerde cinsiyet bir ön faktör olarak dahil edilmemiştir. KCl depolarizasyonu ile uyarılmış kolinerjik sinyaller, dHPC'de SAL- ve NIC-Sired fareler arasında farklılık göstermedi (P > .05; Şekil 4A); bununla birlikte, lokal nikotin uygulaması, NIC-Sired farelerinde kolinerjik sinyal genliklerinde önemli bir azalma ile sonuçlandı (t8=2.33, P < .05;="" şekil="" 4c).="" vhpc'de,="" kcl="" (t8="2.60," p="">< .05;="" şekil="" 4b)="" veya="" nikotin="" (t8="2.98," p="">< .05)="" uygulandıktan="" sonra="" nic-sired="" farelerde="" ach="" salınımı="" azalmıştır.="" ;="" şekil="">
ŞEKİL 4 Babadan gelen nikotin, hipokampustaki kolinerjik sinyalleri azaltır. KCl kaynaklı terminal depolarizasyonu tarafından uyarılan bir dHPC popülasyon kolin sinyalleri. NIC- ve SAL-Sired hayvanlar (grup başına n=5) arasında anlamlı bir fark tespit edilmedi. B, NIC-Sired farelerinde KCl ile indüklenen terminal depolarizasyonu tarafından uyarılan vHPC popülasyon kolin sinyalleri azalmıştır. C, Nikotinle uyarılmış popülasyon dHPC kolin sinyalleri, NIC-Sired farelerinde azalmıştır. D, Nikotinle uyarılmış popülasyon vHPC kolin sinyalleri, NIC-Sired farelerinde azalmıştır. Cinsiyetin kolinerjik sinyalleme üzerinde hiçbir etkisi gözlenmedi. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hatasını gösterir, *P <>
3.6 Baba tarafından nikotin maruziyeti, dorsal ve ventral hipokampal gen ekspresyonunu farklı şekilde değiştirir
RNA dizilimi yoluyla F1 hipokampal transkriptom analizi, vHPC'de 952 farklı şekilde eksprese edilmiş gen ortaya çıkardı (FDR=0.05; Tablo S2). Bu genlerin 612'si NIC-Sired farelerinde aşağı regüle edildi ve 340'ı yukarı regüle edildi. dHPC'de, SAL-Sired farelere kıyasla NIC-Sired farelerde sadece 162 gen farklı şekilde eksprese edildi (FDR=0.05). Bu 162 genden 86 aşağı regüle edildi ve 76'sı yukarı regüle edildi. Değişmiş gen ekspresyonuna sahip yüz üç gen, vHPC ve dHPC arasında örtüşmüştür.
3.7 Baba tarafından nikotin maruziyeti, sinir sistemi gelişiminde rol oynayan transkripsiyonel yolları değiştirir
vHPC'de, IPA analizi "Nörolojik Hastalık, Organizma Yaralanması ve Anormallikler, Hücre Ölümü ve Hayatta Kalma" (skor=41, Tablo S3) ve ikinci en üst ağ "Sinir Sistemi Gelişimi ve İşlevi, Doku Morfolojisi, Nörolojik Hastalık" (puan=23). İlk beş Moleküler ve Hücresel Fonksiyon kategorisi şunlardı: "Hücre morfolojisi" (88 molekül), "Hücre Birleşimi ve Organizasyonu" (79 molekül), "Hücresel Gelişim" (96 molekül), "Hücresel İşlev ve Bakım" (79 molekül), ve "Hücresel Büyüme ve Çoğalma" (87 molekül). İlk Fizyolojik Sistem Gelişimi ve İşlevi "Sinir Sistemi Gelişimi ve İşlevi" (175 molekül) idi ve en üstteki Hastalık ve Bozukluk İşlevlerinden bazıları "Nörolojik Hastalık" (ikinci, 191 molekül) ve "Psikolojik Bozukluklar" (dördüncü, 90 molekül) idi. ) (Tablo S4).
IPA sonuçlarını tamamlayıcı olarak, Enrichr kullanılarak yapılan zenginleştirme analizi, "RNA ekleme", "katlanmamış proteine yanıt" ve "hücre büyümesinin düzenlenmesi" ve "hücre büyümesinin düzenlenmesi" dahil olmak üzere en iyi GO biyolojik terimleriyle birlikte vHPC'de hücresel büyüme ve gelişmedeki değişiklikler için daha fazla kanıt sağladı. protein stabilizasyonu" (Tablo S5). Buna uygun olarak, "splicosomal kompleksi", bir üst GO hücresel terimi olarak tanımlandı. Enrichr aracılığıyla yapılan KEGG yolu analizi ayrıca, potansiyel olarak etkilenen yollar olarak spliceosome işleyişine ve MAPK sinyaline işaret etti.
vHPC ile karşılaştırıldığında dHPC'de diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin oldukça kısa bir listesine rağmen, benzer dHPC ile zenginleştirilmiş yollar ve terimler tanımlandı (Tablo S3 ve S4). IPA analizi, "Davranış, Nörolojik Hastalık, Organizma Yaralanmaları ve Anormallikler" (skor=24) ve ikinci en üst ağ olan "Nörolojik Hastalık, Organizma Yaralanmaları ve Anormallikler ve Psikolojik Bozukluklar (skor=20) ağlarını belirledi. .
dHPC'deki ilk beş Moleküler ve Hücresel Fonksiyon kategorisi "Hücresel Gelişim" (29 molekül), "Hücresel Büyüme ve Proliferasyon" (29 molekül), "Hücre Morfolojisi" (27 molekül), "Hücre Birleşimi ve Organizasyonu" (23 molekül) idi. ve "Hücresel İşlev ve Bakım" (25 molekül). "Sinir Sistemi Gelişimi ve İşlevi" yine Fizyolojik Sistem Geliştirme ve İşlev sınıflandırması (ikinci, 44 molekül) altında en zenginleştirilmiş terim olarak tanımlandı. Hastalıklar ve Bozukluklar İşlev sınıflandırması altında en zenginleştirilmiş terimler "Nörolojik Hastalık" (1., 51 molekül) ve "Psikolojik Bozukluklar" (beşinci, 31 molekül) içeriyordu. Enrichr kullanılarak yapılan zenginleştirme analizi, IPA moleküler ve hücresel işlevi "Hücre Ölümü ve Hayatta Kalma"yı tamamlayan "nöron ölümünün düzenlenmesi" ve "beyin gelişimi" (Tablo S5) dahil olmak üzere vHPC ile karşılaştırıldığında dHPC için çok sayıda farklı GO biyolojik terimi tanımladı.
dHPC ve vHPC arasında örtüşen diferansiyel olarak eksprese edilmiş transkriptlerin fonksiyonel rolünü daha fazla araştırmak için her iki bölgede ortak olan diferansiyel olarak eksprese edilmiş genler (toplam 103) değerlendirildi. İki bölge arasındaki örtüşen farklı şekilde eksprese edilen transkriptlerin tümü, aynı yönde aşağı regüle edildi veya yukarı regüle edildi, bu da NIC'ye bağlı farelerde beyin bölgeleri boyunca transkripsiyonel yollarda ortak değişiklikler olduğunu düşündürdü. IPA tarafından tanımlanan ilk beş Moleküler ve Hücresel Fonksiyon kategorisi, "Hücre Ölümü ve Hayatta Kalma" (17 molekül), "Hücresel Hareket" (10 molekül), "Hücreden Hücreye Sinyalleşme ve Etkileşim" (17 molekül), "Hücresel Büyüme" idi. ve Proliferasyon" (18 molekül) ve "Hücre Morfolojisi" (17 molekül) (Tablo S4)
dHPC ve vHPC'ye özgü farklı şekilde eksprese edilen genler daha sonra iki bölge arasındaki farklı nörobiyolojik adaptasyonları test etmek için IPA'da ayrı ayrı analiz edildi (Tablo S6). Benzersiz vHPC benzersiz dHPC analizleri arasında çakışan hiçbir zenginleştirilmiş kurallı yol yoktur. vHPC'ye özgü en zenginleştirilmiş kanonik yollar (toplam 44) "Kalsiyum sinyali" ve "Glukokortikoid reseptör sinyali"ni içerirken, en iyi dHPC kanonik yolları (toplam sekiz) "Tiroid Hormon Metabolizması" ve "Retinoik asit Aracılı Apoptoz Sinyali"ni içeriyordu. vHPC'ye özgü zenginleştirilmiş hastalıklar ve işlevler (toplam 295), "[Hipokampus] Ammon Boynuzu'nun Oluşumu" ve "Hücresel Çıkıntıların Miktarı"nı içerirken, benzersiz dHPC ile zenginleştirilmiş hastalıklar ve işlevler terimleri (toplam 111) "Beyaz cevher iltihabı" ve "Demiyelinizasyon"u içeriyordu. "
3.8 Baba tarafından nikotin maruziyeti hipokampal DNA metilasyonunu değiştirir
İlgili düzenleyici bölgelerdeki değiştirilmiş DNA metilasyonunun NIC-Sired F1 yavrularında farklı gen ekspresyonundan sorumlu olup olmadığını belirlemek için hedeflenen bir DNA metilasyon analizi yapıldı. Hedefler, dHPC veya vHPC'de tanımlanan 1114 farklı şekilde eksprese edilmiş geni içeriyordu. vHPC'de, sekizi artan metilasyon ve üçü azalmış metilasyon gösteren 11 farklı şekilde metillenmiş bölge (DMR'ler) tespit edildi (Tablo 1). 11 DMR'den 10'u, vHPC'de değiştirilmiş ekspresyon sergileyen bir gen ile ilişkili bölgelerde bulunuyordu. dHPC'de, 15'i artan metilasyon ve 15'i azalmış metilasyon gösteren 30 DMR tespit edildi. 30 DMR'den 29'u, dHPC'de değiştirilmiş ekspresyon sergileyen bir gen ile ilişkili bölgelerde bulunuyordu.
Bencistanche echinacoside'ın etkisi
4. TARTIŞMA
Mevcut bulgular da dahil olmak üzere son verilerle bağlantılı olarak epigenetik süreçlerin artan anlayışı, geleneksel kalıtım anlayışına meydan okudu. Tek başına genotipin ötesindeki faktörler, sonraki nesillerdeki fenotipleri belirleyebilir ve bir nesil içindeki maruziyetler, nesilden ayrı tutulamaz. Bu çalışma, nikotin maruziyetinin zararlı sağlık etkilerinin bireysel maruziyeti aşabileceğini ve sonraki nesilleri etkileyebileceğini düşündürmektedir. C57BL/6J farelerinde gebe kalma öncesi baba nikotine maruz kalmasının Pavlovian korku koşullandırması üzerindeki çok kuşaklı ve kuşaklar arası etkilerini belirledik, bu da F1 ve F2 soyunda daha güçlü korku anılarına neden oldu. Babanın nikotine maruz kalması aynı zamanda kendi kendine nikotin uygulamasının azalmasına ve nüksetmeye bağlı davranışların azalmasına neden oldu ve bu da nikotine karşı daha büyük bir caydırıcı tepki olduğunu düşündürdü. Bu davranış farklılıklarını desteklemek için, hipokampal kolinerjik fonksiyonda ve epigenetik süreçlerde çok kuşaklı değişiklikler gözlemlendi. Birlikte, bu sonuçlar, nikotine maruz kalan farelerin yavrularında sinir sistemi işlevinde, değişen davranışsal fenotiplerle sonuçlanan değişikliklere işaret eder.
Nikotine maruz kalan erkek farelerin F1 ve F2 yavruları, gelişmiş bağlamsal ve işaretli korku koşullandırması sergiledi. NIC- ve SAL-Sired F1 fareleri arasında bağlamsal korku yok oluşunda herhangi bir fark olmamasına rağmen, NIC-Sired fareleri, bağlamsal korku anılarının gelişmiş spontan iyileşmesini gösterdi. Daha da önemlisi, NIC- ve SAL-Sired fareler arasında artan korku koşullandırmasını açıklayabilecek şok duyarlılığında hiçbir fark bulunmadı. Gelişmiş korku koşullandırma, öğrenme korkusuna daha özgü süreçlerin modülasyonunun aksine, öğrenme süreçlerinin genelleştirilmiş bir şekilde geliştirilmesini önerebilir. Bununla birlikte, NIC-Sired dişi farelerde artan EPM açık kol süresinin cinsiyete özgü bir etkisi tanımlanmış olmasına rağmen, NIC-Sired farelerde yeni nesne tanıma, edimsel gıda eğitimi veya açık alan hareketinde hiçbir değişiklik gözlemlenmemiştir. Bu, diğer öğrenme sistemlerinde veya bilişsel süreçlerde olası değişiklikleri dışlamazken, bu bulgular birlikte korku öğrenmenin baba tarafından nikotin maruziyetinin çok nesilli ve nesiller arası etkilerine daha duyarlı olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, bu bulgular NIC-Sired hayvanlarında değişmiş bir kolinerjik fonksiyona işaret etmektedir. Nikotin, bağlamsal korku koşullandırmasını modüle eder. Akut nikotin bağlamsal korku koşullandırmasını artırırken,15,45 kronik nikotin yoksunluğu bağlamsal korku koşullandırmasını bozar.16,21 Mevcut çalışmada, tuzlu su ile tedavi edilen farelerden alınan F1 ve F2 farelerinde akut nikotin bağlamsal korku koşullandırmasını artırmıştır. Buna karşılık, NIC-Sired farelerde akut nikotin-bozulmuş bağlamsal korku koşullandırması ve NIC-grandsire farelerinde hiçbir etkisi olmadı, bu da hipokampusta değişen kolinerjik işleve işaret edebilir.
F1 neslinde baba tarafından nikotin maruziyetinin müteakip nikotin kendi kendine uygulanması üzerindeki etkileri de bozulmuş kolinerjik fonksiyona işaret eder. Daha düşük dozda kendi kendine IV nikotin uygulamasının edinimi sırasında, NIC-Sired grubunda aktif kaldıraç preslerinin sayısında bir artış bulunmasına rağmen, gruplar nikotin infüzyonlarının sayısında farklılık göstermedi. Bu, NIC-Sired farelerinin, yiyecek ödülü için yanıt vermede azim sergilemiş olabileceğini ve/veya yiyecekten ilaca yanıt vermede geçişte bilişsel esnekliği azaltmış olabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, grupların, bir yok olma seansını temsil eden (örneğin, seans sırasında nikotin infüzyonu yapılmaması) aşerme inkübasyonunun 1. gününde farklılık göstermediğini ve dolayısıyla, bu etkinin, pekiştireçler verildiğinde mevcut olduğunu belirtmekte fayda var. bir sönme oturumu sırasında bir pekiştireç yokluğunda değiştirilir. NIC-Sired fareleri ayrıca, orta dozda kendi kendine nikotin uygulamasında azalma sergilemiştir; bu, ebeveyn alkolü, kokain ve morfine maruz kalma ile ilişkili alkol, kokain ve opioid uygulamasındaki azalmaları tanımlayan son çalışmalarla uyumludur (örn. Vassoler ve diğerleri, 46 Goldberg ve Gould47'de gözden geçirilmiştir). Nikotinin kendi kendine uygulanmasında gözlenen azalma, nikotinin ödüllendirici etkilerine karşı duyarlılığın azalmasına ve/veya nikotinin caydırıcı etkilerine karşı artan duyarlılığına bağlanabilir. Gerçekten de gruplar, orta düzeyde nikotin dozunda farklılık gösterirken, daha düşük nikotin dozunda farklılık göstermemiştir; bu, daha yüksek dozla artan bir caydırıcı tepki fikrini desteklemektedir. İlginç bir şekilde, NIC-Sired farelerde 21. günde orta dozda kendi kendine tatbikatı takiben aşerme inkübasyonu eksikliği de bulduk, bu da azalmış nikotin arama davranışlarının nikotin için isteksizlikle ilişkili bir hafıza ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Nikotin alımı ve nükse bağlı yanıt üzerindeki bu etkilerin altında çeşitli nöral substratlar yatsa da, yakın tarihli bir çalışma, hipokampal CA1 bölgesindeki DNA metiltransferazın azalmasının, morfinin kendi kendine tatbikatını azalttığını bulmuştur.48 Bu bulgu, kolinerjik hipokampal fonksiyonun bilinen işleviyle birlikte Öğrenme ve hafıza süreçleri, NIC-Sired farelerinin hipokampüsünde nikotin aracılı işlemenin bozulduğu fikrini daha da destekler.
Bu çizgiler boyunca, NIC-Sired fareleri, artan hipokampal yüksek afiniteli nAChR bağlanması sergiledi. NIC-Sired hayvanlarının hem dHPC hem de vHPC'sinde nikotinle uyarılmış ACh salınımının yanı sıra vHPC'de potasyum ile uyarılmış ACh salınımında da azalmalar bulduk. Depolarizasyonla uyarılmış ACh salınımındaki değişiklikler, reseptör bağlanmasının aşağısında değişen kolinerjik işlevi yansıtırken, nikotinle uyarılmış ACh salınımındaki değişiklikler, değiştirilmiş nAChR işlevini yansıtır. Bu veriler, azalan nAChR fonksiyonunu takiben yukarı regüle edilmiş yüksek afiniteli nAChR bağlanmasına ilişkin önceki bulgularla uyumludur.49 Hem potasyum ile uyarılmış hem de nikotin ile uyarılmış ACh salınımı, NIC-Sired farelerin vHPC'sinde değiştirildiğinden, vHPC, nAChR'ye daha duyarlı olabilir. baba tarafından nikotin maruziyetinin çok kuşaklı etkileri. DHPC'nin bağlamsal korku koşullandırmasını modüle ettiği bilinmektedir.31,50 vHPC'nin inhibisyonu, hem işaretli hem de bağlamsal korku koşulunu bozar51,52 ve vHPC kolinerjik lezyonlar, uyarılmış korku koşullandırmasını bozar.53
ot cistanche
Ayrıca, dHPC'ye doğrudan nikotin infüzyonunun bağlamsal korku koşullanmasını geliştirdiğini, vHPC'ye infüzyonun ise bağlamsal korku koşullandırmasını bozduğunu gösterdik.15 vHPC, bağlamsal korku anılarının kendiliğinden iyileşmesini de modüle edebilir, çünkü vHPC-prelimbik devrenin etkisizleştirilmesi bağlamsal korku anılarının kendiliğinden iyileşmesini azaltır. 54 Amigdala gibi korku koşullandırmasına dahil olan diğer beyin bölgeleri de 55 babanın nikotine maruz kalmasından etkilenebilirken, mevcut verilerle birlikte bu bulgular, NIC-Sired farelerde değişen korku koşullandırmasından vHPC işlevindeki değişikliklerin sorumlu olabileceğini düşündürmektedir. . Baba tarafından nikotin maruziyetinin çok kuşaklı etkilerinin, bu sinir sistemlerinin yukarısında hareket eden transkripsiyonel efektörlerdeki değişikliklerle ilişkili olabileceğini varsaydık. F1 nesli farelerin vHPC ve dHPC'sinde genom çapında transkripsiyonel dizileme, NIC- ve SAL-Sired fareler arasında 1114 farklı şekilde eksprese edilmiş gen tanımladı. Bu fark, dHPC kolinerjik işlevine göre vHPC'deki daha büyük değişiklik ve hem bağlamsal hem de işaret edilen korku koşullandırmasındaki değişikliklerle paralel olarak, dHPC'ye (162) karşı vHPC'de (952) daha büyüktü. Müteakip yol analizi, her iki hipokampal bölgede glukokortikoid sinyalleme ve nöral gelişim/plastisite ile ilişkili transkripsiyonel yollarda geniş değişiklikler önerdi.
vHPC'ye özgü potansiyel uyarlamaları belirlemek için, yalnızca hipokampal alt bölgelere özgü transkriptler kullanılarak yol analizi yapıldı. Hipokampusun işlevsel olarak farklı alt bölgeleri olan vHPC ve dHPC arasında örtüşen zenginleştirilmiş IPA kanonik yolları yoktur.31 dHPC ve vHPC arasında örtüşen genler çıkarıldığında, vHPC'ye özgü en zenginleştirilmiş kanonik yollar arasında "Glukokortikoid Reseptör Sinyali" yer alır ve benzersiz bir , dHPC ile karşılaştırıldığında bu bölgede glukokortikoid işlevinde ek değişiklik. Gen ekspresyonu üzerinde etkili olabilecek yukarı akış epigenetik düzenleyicilerini belirlemek amacıyla, RNA diziliminden tanımlanan dHPC ve vHPC diferansiyel olarak eksprese edilmiş genlerin derlenmiş listesini kullanarak hedeflenen DNA metilasyon dizilimi gerçekleştirdik. Şaşırtıcı bir şekilde, NIC- ve SAL-Sired hayvanlar arasında vHPC'de sadece 11 DMR ve dHPC'de 30 DMR bulduk. vHPC'de diferansiyel olarak eksprese edilen transkriptlerin çok daha yüksek sayısı göz önüne alındığında bu beklenmeyen bir durum olsa da, DNA metilasyonu gen ekspresyonunu etkileyebilecek birkaç düzenleyici faktörden sadece biridir ve DNA metilasyonu tutarlı bir şekilde değiştirilmiş gen ekspresyonuna dönüşmez.56 11 vHPC DMR'den yedisi diferansiyel transkripsiyon yönü ile tutarlı metilasyon paternleri sergiledi (artan DNA metilasyonu ile azalan transkripsiyon ve azaltılmış metilasyon ile artan transkripsiyon). vHPC'deki farklı şekilde metillenmiş genler, Fkbp5, Ksr1 ve Pnpla2'yi içeriyordu. İlginç bir şekilde, Fkbp5 ve Ksr1 transkripsiyonu, farelerin bir elektrik ayak şokuna maruz bırakıldığı ve daha sonra durumsal hatırlatıcılar sunduğu bir davranışsal fare PTSD modelinde 57 bozuldu. Fkbp5, işleyişi PTSD ve diğer anksiyete bozuklukları olan bireylerde uyumsuz uzun süreli stres tepkisi ile ilişkilendirilen bir glukokortikoid reseptör şaperonunu kodlar.58
Spesifik olarak, insan çalışmaları, Fkbp5 metilasyonu ve transkripsiyonunun, artan metilasyon ve azalan transkripsiyonun daha şiddetli TSSB semptomolojisini öngördüğü şekilde, TSSB semptomlarının şiddeti ile ilişkili olduğunu göstermektedir.59,60 Fkbp5 ekspresyonu, HPA-ekseni işleyişini modüle eder ve bunun, onun dahil olduğu düşünülen HPA-ekseni işleyişini modüle eder. PTSD.59,61 NIC-Sired hayvanlarda glukokortikoid sinyalleme ile ilişkili transkripsiyonel yolların düzensizliği ile bağlantılı olarak korku hafızasının spontan iyileşmesinin arttığına dair bulgumuz, PTSD benzeri fenotiplere karşı artan hassasiyete işaret edebilir. dHPC'de, DMR kalıpları, RNA dizilimi tarafından bulunan diferansiyel transkript ekspresyonunun yönü ile büyük ölçüde tutarsızdı; bu, baba tarafından nikotin maruziyeti tarafından üretilen vHPC DNA metilasyonundaki değişikliklerin, gen ekspresyonunu etkileme açısından dHPC'dekinden daha önemli olduğunu öne sürüyor. Bu, dHPC ile karşılaştırıldığında NIC-Sired vHPC'de daha fazla sayıda diferansiyel olarak eksprese edilmiş transkript ve kolinerjik iletimde daha abartılı değişiklikler tanımlamamızla uyumludur. Hedeflenen dizileme yaklaşımımız, distal olarak metillenmiş diziler tarafından potansiyel transkripsiyonel düzenlemeyi tespit etme yeteneğini sınırlamış olabilir. Genom çapında DNA metilasyonu, histon modifikasyonları ve küçük RNA ekspresyonunun analizini içeren gelecekteki araştırmalar, bu bulguların daha eksiksiz bir yorumunu sağlayacaktır.
Nikotine maruz kalma tasarımımızın olası bir sınırlaması, nikotine maruz kalmanın nesiller arası ve nesiller arası etkisini araştırmak için babanın nikotine maruz kalmasına odaklanmasıdır. Kokain46 ve morfin62 de dahil olmak üzere baba tarafından ilaca maruz kalmanın ardından çoklu/kuşaklar arası fenotipler bulan diğer çalışmalar, anne bakımında hiçbir farklılık bulmasa da, babanın nikotine maruz kalmasının anne bakımını etkilemesi olasıdır. Anne bakımı üzerindeki etkisini araştıran gelecekteki çalışmalar garanti edilmektedir. Şu anki odak noktamız babanın maruz kalması üzerine olduğu için, gelecekteki çalışmalar aynı zamanda babanın maruz kalmasına karşı annenin maruz kalmasının etkilerini de karşılaştırmalıdır. Genel olarak, mevcut bulgular, ilaca maruz kalmanın nesiller arası ve nesiller arası etkilerini karakterize eden büyüyen bir literatür tarafından desteklenen (Goldberg ve Gould47'de gözden geçirildiği gibi) nikotin maruziyetinin nesiller arası ve nesiller arası etkilerine dair yeni bir anlayış sağlar. Bu çalışma, nikotine maruz kalan erkeklerin F1 ve F2 yavrularında bağlamsal korku koşullandırmasını test eden ilk çalışmaydı ve gelişmiş korku belleği oluşumunu ve korku anılarının kendiliğinden iyileşmesini tanımladı. Bu çalışma aynı zamanda F1 nikotine maruz kalan yavrularda değiştirilmiş nikotin kendi kendine tatbikatını ve aşerme inkübasyonunu tanımlayan ilk çalışmadır.
NIC-Sired farelerinde PTSD ve HPA ekseni düzensizliği ile ilişkili genlerde farklı metilasyon ve ayrıca stresle ilişkili transkripsiyonel yollarda eşzamanlı bozulmalar bulundu. Babadan gelen nikotin, hipokampal kolinerjik fonksiyonun azalması ve hipokampal nAChR bağlanmasının artmasıyla da ilişkilendirildi. İlginç bir şekilde, sigara içmeyen TSSB hastaları, önemli ölçüde daha yüksek meziotemporal kortikal yüksek afiniteli nAChR bağlanması gösterir63 ve TSSB, daha fazla korku koşullandırması ve sönmüş korku anılarının kendiliğinden iyileşmesi ile ilişkilidir.64 Birlikte, bulgularımız nikotine maruz kalmanın, nikotine maruz kalmanın çok kuşaklı bir etkisi olabileceğini düşündürmektedir. TSSB benzeri semptomolojiye karşı yavru duyarlılığının artması. Bu bulgu, nikotine maruz kalmanın bilişsel esneklik üzerindeki çok kuşaklı etkilerini gösteren diğer yeni bulgularla birlikte2 nikotine maruz kalmanın olumsuz sağlık sonuçlarının önceden düşünülenden daha geniş bir ağ oluşturduğunu göstermektedir.
Cistanche özü
REFERANSLAR
1 Dai J, Wang Z, Xu W, et al. Babadan gelen nikotin maruziyeti, mmu-miR-15b'nin hiper-metilasyonu yoluyla sonraki nesillerde farklı davranışları tanımlar. Bilim Temsilcisi 2017;7(1):7286.
2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE, et al. Erkek farelerin nikotine maruz kalması, birden fazla nesilde davranışsal bozulmaya neden olur. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.
3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. DEHB'nin bir fare modelinde hiperaktivitenin nesiller arası aktarımı. J Neurosci. 2014;34(8):2768-2773.
4. Cummings KM, Proctor RN. Amerika Birleşik Devletleri'nde sigara içmenin değişen kamu imajı: 1964-2014. Kanser Epidemiol Biyobelirteçleri Önceki. 2014;23(1):32-36.
5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Lise öğrencileri arasında elektronik sigara kullanımı ve sigara kullanımı ve sigarayı bırakma ile ilişkisi, North Carolina Youth Tobacco Surveys, 2011 ve 2013. Prev Chronic Dis. 2016;13:E103.
6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG, et al. Kronik nikotinin farelerde duygusal ve bilişsel davranışlar ve hipokampus hücre morfolojisi üzerindeki uzun vadeli etkileri: yetişkin ve ergen nikotin maruziyetinin karşılaştırılması. Eur J Neurosci. 2016;44:2818-2828.
7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Ergenlik ve erken yetişkinlik döneminde sigara içimi ile anksiyete bozuklukları arasındaki ilişki. JAMA. 2000;284:2348-2351.
8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM, et al. Epigenetik bir mekanizma, nöronal yapı ve davranış üzerindeki gelişimsel nikotin etkilerine aracılık eder. Nat Neurosci. 2016;19(7):905-914.
9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, et al. Kolin, yetişkin öğrenme eksikliklerini iyileştirir ve ergen nikotin maruziyetiyle ilgili kromatin yeniden modelleme faktörlerinin epigenetik modifikasyonunu tersine çevirir. Neurobiol Learn Mem. 2018;155:239-248.
10. Kuş A. Epigenetik algıları. Doğa. 2007;447:396-398.
11. Skinner MK. Çevresel epigenetik nesiller arası kalıtım ve somatik epigenetik mitotik kararlılık. Epigenetik. 2011;6:838-842.
12. Davis JA, Gould TJ. İlişkisel öğrenme, hipokampus ve nikotin bağımlılığı. Curr Uyuşturucu Suistimali Rev. 2008;1:9-19.
13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Nikotin bağımlılığı ve psikiyatrik bozukluklar. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171-208.
14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. Şizofreni ve komorbid nikotin bağımlılığı için ortak bir substrat olarak nAChR disfonksiyonu: mevcut eğilimler ve bakış açıları. Şizofre Res. 2016;171:1-15.
15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Dorsal ve ventral hipokampustaki nikotinik reseptörler, bağlamsal korku koşullandırmasını farklı şekilde modüle eder. Hipokampus. 2012;22:1681-1690.
16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Genetik arka plan, kronik nikotin yoksunluğunun öğrenme ve dorsal ve ventral hipokampusta yüksek afiniteli nikotinik asetilkolin reseptörü bağlanması üzerindeki etkilerini etkiler. Psikofarmakoloji (Berl). 2013;225(1): 201-208.
17. Davis JA, Gould TJ. DHBE ve MLA'nın, C57BL / 6 farelerinde nikotin kaynaklı bağlamsal korku koşullandırmasının arttırılması üzerindeki etkileri. Psikofarmakoloji (Berl). 2006;184:345-352.
18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Ergenlik öncesi ve ergen fareler, akut nikotinin yok olma ve kendiliğinden iyileşme üzerindeki etkilerine karşı daha az duyarlıdır. Beyin Res Boğa. 2018;138:50-55.
19. Kutlu MG, Gould TJ. Akut nikotin, farelerde bağlamsal korkunun yok olmasını geciktirir. Davran Beyin Arş. 2014;263:133‐137.
20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3. Nikotin kimyası, metabolizma, kinetik ve biyobelirteçler. İçinde: Nikotin psikofarmakolojisi. Berlin, Heidelberg: Springer; 2009:29-60.
21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Kronik nikotin uygulamasından çekilme, C57BL/6 farelerinde bağlamsal korku koşullandırmasını bozar. J Neurosci. 2005;25:8708-8713.
22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. Üç kendilenmiş fare suşunda nikotin ve metabolitlerinin düzeninin karşılaştırmalı bir çalışması. İlaç Metabı İmhası 1984;12:725-731.
23. Gould TJ, Portekiz GS, Andre JM, et al. Bağlamsal korku koşullandırmasındaki nikotin yoksunluğuyla ilişkili eksikliklerin süresi, hipokampal yüksek afiniteli nikotinik asetilkolin reseptör düzenlemesindeki değişikliklerle paraleldir. Nörofarmakoloji. 2012;62:2118-2125.
24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu-Chen LY, Gould TJ. Kronik nikotin tarafından bağlamsal korku tükenmesinin bozulması ve kronik nikotin çekilmesi, hipokampal nAChR yukarı regülasyonu ile ilişkilidir. Nörofarmakoloji. 2016;109:341-348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Farede kendiliğinden ve çökeltilmiş nikotin çekilmesinin karakterizasyonu. J Pharmacol Exp Ther. 2003;307:526-534.
26. Fowler CD'si, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Habenular alfa5 nikotinik reseptör alt birimi sinyali, nikotin alımını kontrol eder. Doğa. 2011;471:597-601.
27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Sıçan hipokampüsündeki heteromerik nöronal nikotinik reseptörlerin kantitatif analizi. J Neurochem. 2010;115:625-634.
28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Kronik nikotin ve vareniklini takiben nöronal nikotinik asetilkolin reseptörlerinin paralel anksiyolitik benzeri etkileri ve yukarı regülasyonu. Nikotin Tob Res. 2011;13:41-46.
29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Prefrontal beta2 alt birimi içeren ve alfa7 nikotinik asetilkolin reseptörleri, glutamaterjik ve kolinerjik sinyalleri farklı şekilde kontrol eder. J Neurosci. 2010;30: 3518-3530.
30. Parikh V, Başlangıç M. Ön beyin kolinerjik sistemleri ve biliş: enzim bazlı biyosensörler kullanılarak kolin sivri uçlarının hızlı tespitine dayanan yeni anlayışlar. İçinde: Mikroelektrot Biyosensörler. Totowa, NJ: Humana Press; 2013:257-277.
31. Fanselow MS, Dong HW. Dorsal ve ventral hipokampus işlevsel olarak farklı yapılar mıdır? Nöron. 2010;65(1):7-19.
32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: eklemeler, silmeler ve gen füzyonları varlığında transkriptomların doğru hizalanması. Genom Biol. 2013;14(4): R36.
33. Afgan E, Baker D, van den Beek M, et al. Erişilebilir, tekrarlanabilir ve işbirlikçi biyomedikal analizler için Galaxy platformu: 2016 güncellemesi. Nükleik Asitler Araş. 2016;44:W3‐w10.
34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, et al. RNA-Seq ile transkript montajı ve ölçümü, hücre farklılaşması sırasında açıklamasız transkriptleri ve izoform değişimini ortaya çıkarır Nat Biyoteknoloji. 2010;28(5): 511-515.
35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Davranış genetiği araştırmalarında yanlış keşif oranını kontrol etmek. Davran Beyin Arş. 2001; 125(1-2):279-284.
36. Kramer A, Green J, Pollard J Jr, Tugendreich S. Yaratıcılık Yolu Analizinde nedensel analiz yaklaşımları. Biyoinformatik. 2014;30(4): 523-530.
37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD, et al. Enrichr: kapsamlı bir gen seti zenginleştirme analizi web sunucusu 2016 güncellemesi. Nükleik Asitler Araş. 2016;44(W1): W90-W97.
38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. SeqCap epi zenginleştirme sistemi kullanılarak hedeflenen bisülfit dizilimi. Yöntemler Mol Biol. 2018;1708:383-405.
39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: Illumina dizi verileri için esnek bir düzeltici. Biyoinformatik. 2014;30(15):2114-2120.
40. Langmead B, Salzberg SL. Bowtie 2. Nat Methods ile hızlı boşluklu okuma hizalaması. 2012;9(4):357-359.
41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: Bisulfite-Seq uygulamaları için esnek bir hizalayıcı ve metilasyon çağırıcı. Biyoinformatik. 2011;27(11):1571-1572.
42. Akalın A, Kormaksson M, Li S, et al. methylKit: genom çapında DNA metilasyon profillerinin analizi için kapsamlı bir R paketi. Genom Biol. 2012;13(10): R87.
43. Gould TJ, Lommock JA. Nikotin, bağlamsal korku koşullandırmasını geliştirir ve bağlamsal korku koşullandırmasında etanol kaynaklı eksiklikleri iyileştirir. Davranış Neurosci. 2003;117(6):1276-1282.
44. Fowler CD'si, Kenny PJ. Farelerde intravenöz nikotin kendi kendine tatbikat ve işaret kaynaklı eski haline getirme: nikotin dozunun etkileri, ilaç infüzyon hızı ve önceki enstrümantal eğitim. Nörofarmakoloji. 2011;61(4):687-698.
45. Gould TJ, Wehner JM. Bağlamsal korku koşullandırmasının nikotin geliştirmesi. Davran Beyin Arş. 1999;102(1-2):31-39.
46. Vassoler FM, Beyaz SL, Schmidt HD, Sadri-Vakili G, Pierce RC. Bir kokaine dirençli fenotipin epigenetik mirası. Nat Neurosci. 2013;16(1):42-47.
47. Goldberg LR, Gould TJ. Baba tarafından kötüye kullanılan ilaçlara maruz kalmanın davranışsal ve sinirsel işlev üzerindeki çok kuşaklı ve kuşaklararası etkileri. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453-2466.
48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W, et al. Hipokampal CA1'deki DNMT3a, sıçanlarda morfin kendi kendine tatbikatının kazanılmasında çok önemlidir. Bağımlı Biol. 2019;▪:▪‐▪.
49. Schwartz RD, Kellar KJ. Beyindeki nikotinik kolinerjik reseptör bağlanma bölgeleri: in vivo düzenleme. Bilim. 1983;220(4593):214-216.
50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Hipokampal lezyonlar, Morris su labirentinde ve koşullu korku görevinde doğuştan gelen farelerde öğrenme eksikliklerine neden olur. Davranış Neurosci. 1997;111(1):104-113.
51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Sıçanlarda ventral hipokampus ve korku koşullandırması: N-metil-D-aspartat veya onun rekabetçi olmayan antagonisti MK-801'in ventral hipokampa infüzyonundan sonra farklı anterograd korku amnezileri. Davran Beyin Arş. 2001;126(1-2):159-174.
52. Maren S, Holt WG. Sıçanlarda hipokampus ve Pavlovian korku koşullandırma: ventral içine muscimol infüzyonları, ancak dorsal değil, hipokampus, işitsel bir koşullu uyaran için koşullu dondurma alımını bozar. Davranış Neurosci. 2004;118(1):97-110.
53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Broca kolinerjik projeksiyonların ventral hipokampusa medial septum ve diyagonal bantlarının bozulması işitsel korku hafızasını bozar. Neurobiol Learn Mem. 2018;152:71-79.
54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Prelimbik kortekse yansıyan ventral hipokampal hücrelerin yola özgü aktivasyonu, korku yenilenmesini azaltır. Neurobiol Learn Mem. 2019;161:63-71.
55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Yanal amigdaloid çekirdek: korku koşullandırmasında amigdalanın duyusal arayüzü. J Neurosci. 1990;10(4):1062-1069.
56. Jones PA. DNA metilasyonunun işlevleri: adalar, başlangıç bölgeleri, gen gövdeleri ve ötesi. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484-492.
57. Tanaka M, Li H, Zhang X, et al. PTSD benzeri bir fare modelinin amigdala ve ön singulat korteksinde bölge ve zamana bağlı gen regülasyonu Mol Beyin. 2019;12(1):25.
58. Bağlayıcı EB. Afektif ve anksiyete bozukluklarının patogenezinde ve tedavisinde glukokortikoid reseptörünün bir yardımcı şaperonu olan FKBP5'in rolü. Psikonöroendokrinoloji. 2009;34(Ek 1): S186‐S195.
59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM, et al. Dünya Ticaret Merkezi saldırılarından kurtulanlar arasında TSSB riski ve esnekliği için genetik belirteçler. İşaretleyiciler. 2011;30(2-3):101-110.
60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, et al. PTSD'li savaş gazilerinde psikoterapiyi takiben semptom iyileşmesinin öngörücüleri ve bağıntıları olarak epigenetik biyobelirteçler. Ön Psikolog. 2013;4:118.
61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA, et al. Dünya Ticaret Merkezi saldırılarına maruz kalmanın ardından travma sonrası stres bozukluğu ile ilişkili gen ekspresyon kalıpları. Biol Psikiyatri. 2009;66:708-711.
62. Li CQ, Luo YW, Bi FF, et al. Ebeveyn morfine maruz kalmanın yavrularında hipokampal IGF-2 sinyali yoluyla anksiyete benzeri davranışların geliştirilmesi: zenginleştirilmiş ortamın etkisi. Nöropsikofarmakoloji. 2014;39(12):2777-2787.
63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S, et al. Travma sonrası stres bozukluğunda beta2 Nikotinik asetilkolin reseptörü mevcudiyeti. Int J Nöropsikofarmakol. 2008;11(3):419-424.
64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, et al. Travma sonrası stres bozukluğunda yok olma hafızasını hatırlayamamanın nörobiyolojik temeli. Biol Psikiyatri. 2009;66(12):1075-1082.
