Feniletanoid Glikozitler, Mitokondriye Bağlı Yol Yoluyla Eca‑109 Hücrelerinde Apoptozu İndükler

giriiş

Yemek borusu kanseri, dünya genelinde 11'inci en yüksek hastalık oranına ve 6'ncı en yüksek ölüm oranına sahip en yaygın kanser türlerinden biridir ve 2015 yılında ~439,000 ölüme neden olmuştur. Yemek borusu kanserinin görülme sıklığı, doğu bölgelerine göre farklı bölgeler arasında önemli ölçüde farklılık göstermektedir. 2012'de en yüksek görülme oranları Asya ile doğu ve güney Afrika'da görülürken, en düşük oranlar Batı Afrika'da görüldü. Çin'de tahmini özofagus kanseri vakaları ve ölüm oranları sırasıyla 477000 ve 375000 idi. 2005-2015 yılları arasında orta ve yüksek-orta sosyodemografik indekse sahip ülkelerde özofagus kanserinin morbidite oranı azalmış olsa da, kötü prognoz nedeniyle mortalite oranı yüksek olmaya devam etmektedir. Özofagus kanserini tedavi etmek için cerrahi rezeksiyonun kemoterapi veya radyoterapiyle kombinasyonu kullanılmıştır, ancak 2003 ile 2014 yılları arasında 5-yıllık hayatta kalma oranının aynı kaldığı rapor edilmiştir.<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyşunu gösterdiCistanche tubulosa feniletanoid glikozitler(CTPG), melanom B16-F10 hücrelerinin in vitro ve in vivo büyümesini baskılayabilir (24). Ancak daha önce kullanılan CTPG'nin suda çözünürlüğünün zayıf olması ilacın gelişimini sınırlamaktadır. Bu nedenle suda çözünebilen CTPG (CTPG-W) kullanılmış ve yemek borusu kanseri hücreleri (Eca-109) üzerindeki antitümör etkisi araştırılmıştır. CTPG-W'nin, mitokondriye bağımlı bir yol yoluyla apoptozun indüklenmesi yoluyla Eca-109 hücrelerinin canlılığını doza bağlı olarak inhibe edebildiği belirlendi.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Malzemeler ve yöntemler

Hayvanlar.

Dişi C57BL/6 fareleri (6-8 hafta, ~25 g) Pekin Laboratuvar Hayvanları Araştırma Merkezi'nden (Pekin, Çin) satın alındı ​​ve sıcaklık kontrollü (25˚C), ışık döngülü (12/ 12) Sincan Üniversitesi Hayvan Tesisi (Urumçi, Çin). Tüm hayvanlara patojen içermeyen su ve yiyecek verildi.

Hücre çizgisi ve kültürü.

İnsan yemek borusu karsinomu hücre dizisi (Eca-109), Sincan Biyolojik Kaynaklar ve Genetik Mühendisliği Anahtar Laboratuvarı (Yaşam Bilimi ve Teknoloji Koleji, Sincan Üniversitesi, Urumçi, Çin) tarafından korunmuş ve RPMI{{1}'de kültürlenmiştir. } ortamı (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ABD), %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Çin), %1 L ile desteklenmiştir. -glutamin (100 mM), 100 U/ml penisilin ve 100 µg/ml streptomisin, 37˚C'de %5 CO2 içeren nemli bir atmosferde.

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC).

CTPG-W (kat. no. SGJG20170410), Shanghai Upbio Tech Co., Ltd.'den (Şanghay, Çin) satın alındı. CTPG'nin ana bileşikleri önceki çalışmamıza göre HPLC ile nitelendirildi ve ölçüldü (24). Kısaca HPLC, 30˚C'de bir ZORBAX SB‑C18 Kolonu (250x4,6 mm; 5 µm) üzerinde gerçekleştirildi ve %0,2 formik asit çözeltisi ve %23'ten başlayan bir metanol gradyanı ile elüte edildi, her dakikada bir 1 ml eklendi. %31'e ulaşana kadar 45 dakika süreyle. Toplam 10 µl numune enjekte edildi ve 330 nm'de tespit edildi. Ekinakozit standardı, Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd.'den (Şangay, Çin) satın alındı ​​ve akteozit standardı, Sigma-Aldrich'ten (Merck KGaA, Darmstadt, Almanya) satın alındı. Standartlar CTPG-W bileşenlerini analiz etmek için kullanıldı.

MTT tahlili.

Hücre proliferasyonu bir MTT tahlili ile ölçüldü. Eca{{0} hücreleri, 100 ul RPMI{{5'te 5x103 hücre yoğunluğunda 96-kuyu plakalarına aşılandı }} ortamı/kuyucuk ve 37˚C'de 24 saat kültürlendi, ardından farklı konsantrasyonlarda (0, 200, 400, 600 ve 800 µg/ml) CTPG-W veya %0,4 dimetil sülfoksit (DMSO) ile 24 saat işlendi, 48 ve 72 saat. Çözücü kontrolü olarak DMSO kullanıldı (%0.4 DMSO içeren 800 ug/ml CTPG-W). Pozitif kontrol olarak sisplatin (20 µg/ml) kullanıldı. Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 225 xg'de santrifüjlemenin ardından süpernatan atıldı ve her bir kuyucuğa 100 ul MTT çözeltisi (FBS içermeyen RPMI-1640 ortamında 0,5 mg/ml) eklendi ve 37˚C'de 3 süre inkübe edildi. H. Oluşan formazan kristalleri 200 ul DMSO içerisinde çözüldü. Optik yoğunluk (OD) değerleri, bir 96-kuyulu mikroplaka okuyucu (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD) ile 490 nm dalga boyunda ölçülmüştür. Göreli hücre canlılığı şu formüle göre hesaplandı: Hücre canlılığı (%)=(ODişlenmiş/ODişlenmemiş)x%100. Eca‑109 hücrelerinin morfolojisi, ters bir floresan mikroskobu (büyütme, x200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokyo, Japonya) ile gözlemlendi.

Splenositlerin çoğalması için C57BL/6 farelerine servikal dislokasyon yoluyla ötenazi uygulandı ve dalaklar izole edildi. Tek hücreli süspansiyon yapıldı ve splenositler, 100 ul RPMI-1640 ortamında 1x105 hücre/kuyu yoğunluğunda 96-kuyu plakalarına ekildi ve daha sonra farklı konsantrasyonlarla işlendi. (0, 200, 400, 600 ve 800 µg/ml) CTPG-W, %5 CO2 ile 37˚C'de 24, 48 ve 72 saat süreyle. Splenositlerin çoğalması yukarıda belirtilen protokole göre MTT tahlili ile ölçüldü. Uyarıcı dizin=ODtreated/ODuntreated.

Apoptoz ve hücre döngüsünün ölçümü. Eca{{0} hücreleri, 2,5x105 hücre/tabak yoğunluğunda 60 mm'lik tabaklarda 24 saat boyunca kültürlendi ve farklı konsantrasyonlarla ({{31}) işlendi. }, 200, 400, 600 ve 800 µg/ml) CTPG-W veya %0,4 DMSO, 37°C'de %5 CO2 ile 24 saat süreyle. Hücreler toplandı ve üreticinin protokollerine göre bir Annexin V-floresein izotiyosiyanat (FITC)/Propidium iyodür (PI) Apoptoz Tespit kiti (Shanghai Shengsheng Bioteknoloji Co., Ltd., Şangay, Çin) ile boyandı. Numuneler akış sitometrisi (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ABD) ile toplandı ve FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, ABD) ile analiz edildi. CTPG-W'nin hücre döngüsü üzerindeki etkisini analiz etmek için, 2,5x105 Eca-109 hücresi 60 mm'lik kültür tabaklarına ekildi ve CTPG-W (0, 100, 200 ve 400 µg/ml) veya 0,4 ile işlendi. %5 CO2 ile 37˚C'de 24 saat boyunca % DMSO. Tüm hücreler toplandı ve iki kez buz soğukluğunda PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ile yıkandı, ardından 4°C'de %70 buz soğukluğunda etanol içerisinde 30 dakika süreyle sabitlendi. Buz soğukluğunda PBS ile iki kez yıkamanın ardından hücreler, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 ul PI/RNaz boyama tamponunda (BD Biosciences, San Jose, CA, ABD) yeniden süspanse edildi. Hücre döngüsü dağılımı, akış sitometrisi (BD FACSCalibur) yoluyla ModFit LT 3.0 yazılımıyla analiz edildi.

DOĞAL CISTANCHE TUBULOSAYorgunluk KarşıtıKaraciğeri Koruyun PHGS%75 ECH %30 ACT %12

Mitokondriyal membran potansiyelinin (Δψm) ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) analizi.Δψm'yi analiz etmek için, Eca{{0}} hücreleri CTPG-W (0, 400, 600 ve 800 µg/ml) veya %0,4 DMSO ile işleme tabi tutuldu. %5 CO2 ile 37°C'de 24 saat ve üreticinin protokolüne göre JC-1 (Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü, Şanghay, Çin) ile Mitokondriyal membran potansiyeli tahlil kiti ile 37°'de 20 dakika boyunca boyandı C. JC-1 yıkama tamponu (Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü) ile iki kez yıkamanın ardından, numuneler 300 ul JC‑1 yıkama tamponu ile yeniden süspanse edildi ve akış sitometrisi (BD FACSCalibur) ile analiz edildi. Eca‑109 hücrelerinde JC‑1 boyasının floresansı, ters bir floresans mikroskobu (büyütme, x200; Nikon Eclipse Ti‑E) ile de gözlemlendi. ROS analizi için Eca-109 hücreleri CTPG-W (0, 400, 600 ve 800 µg/ml) ile 2, 4, 6, 12 ve 24 saat süreyle işleme tabi tutuldu ve Reaktif Oksijen Türleri Tahlili ile boyandı kiti (Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü) üreticinin protokolüne göre 37˚C'de 20 dakika süreyle. Buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkamanın ardından numuneler akış sitometrisi (BD FACSCalibur) ile toplandı ve FlowJo 7.6 yazılımı ile analiz edildi.

Şekil 1. CTPG-W'nin nitelikli kontrolü. CTPG-W'nin bileşenleri, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile niteliksel ve niceliksel olarak analiz edildi ve ekinekozit ve akteozit standartlarıyla karşılaştırıldı. CTPG-W, suda çözünür feniletanoid glikozitlerC. tübüloza.

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikal temizleme aktivitesi. CTPG-W'nin serbest radikal temizleme aktivitesi, DPPH'yi çözmek için metanol etanol ile ikame edildiğinden, küçük bir modifikasyonla yayınlanan protokole göre bir DPPH serbest radikal tahlili ile belirlendi (25,26). Kararlı durum ölçümleri için, etanol içindeki 150 µl DPPH (100 mmol/l), farklı konsantrasyonlarda CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 ve 600 µg/ml) 50 µl PBS içerisine yerleştirildi ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edildi. 517 nm'deki absorbans, CTPG-W'nin varlığında ve yokluğunda tespit edildi. Pozitif kontrol olarak toplam 50 µl C Vitamini kullanıldı. DPPH radikal temizleme aktivitesi şu formül kullanılarak hesaplandı: Temizleme (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, burada Ablank kontrolün absorbansıdır (DPPH olmadan), Asample numunenin absorbansıdır ve A0, PBS'nin DPPH ile absorbansıdır.

Western leke analizi. Eca{{0}} hücreleri CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) veya %0,4 DMSO ile 24 saat boyunca 37°C'de %5 CO2 ile işleme tabi tutuldu. Aşağıdaki PBS ile iki kez yıkama, hücreler 

Şekil 2. CTPG-W'nin Eca-109 hücreleri ve splenositlerin büyümesi üzerindeki etkisi. (A) Eca-109 hücreleri, 24, 48 ve 72 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda CTPG-W ile muamele edildi ve ardından bir MTT tahlili ile hücre canlılığı tespit edildi. (B) 24 saatte CTPG-W tedavisi sonrasında Eca-109 hücrelerinin morfolojik değişiklikleri. (C) C57BL/6 farelerinin splenositleri, 24, 48 ve 72 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda CTPG-W ile tedavi edildi ve ardından çoğalma, bir MTT tahlili ile analiz edildi.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tübüloza.

Radyoimmünopresipitasyon Tahlili Lizis tamponunda (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Pekin, Çin) buz üzerinde 20 dakika süreyle parçalandı. 4˚C'de 10 dakika süreyle 10,000 xg'de santrifüjlemenin ardından süpernatanlar toplandı ve protein konsantrasyonları, üreticinin protokollerine göre bir bisinkoninik asit kiti (Thermo Fisher Scientific, Inc.) kullanılarak tespit edildi. Western blot analizi önceki açıklamamıza göre yapıldı (24). Kaspaz-7 (kat. no. D120077), kaspaz-8 (kat. no. D155240), kaspaz-9 (kat. no. D220078), B hücreli lenfoma{'ya karşı antikorlar {13}} (Bcl-2) ile ilişkili X (Bax) (kat. no. D220073) ve Bcl-2 (kat. no. D260117) ve anti-fare IgG-yaban turpu peroksidazı (HRP) ) (kat. no. D111050) ve anti-tavşan IgG-HRP (kat. no. D110058), BBI Life Sciences'tan (Şanghay, Çin) satın alınmıştır. Kaspaz-3 (kat. no. E-AB-10050) ve aktif kaspaza-3 (kat. no. E-AB-22115) karşı antikorlar Elabscience'dan satın alınmıştır ( Wuhan, Çin). Kaspaz-7 (kat. no. 9492), poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) (kat. no. 9542), sitokrom c (kat. no. AC909), c-Jun NH{'ye karşı diğer antikorlar {37}}terminal kinaz (JNK) (kat. no. 9252S) ve -aktin (kat. no. 58169), Cell Signaling Technology, Inc.'den (Danvers, MA, ABD) elde edildi. Tüm birincil ve ikincil antikorlar 1:1000 oranında seyreltildi. Birincil antikorlar gece boyunca 4˚C'de, ikincil antikorlar ise 37˚C'de 1 saat inkübe edildi.

Şekil 3. CTPG-W tarafından indüklenen Eca-109 hücrelerinin apoptozu. Hücreler 24 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda CTPG-W ile işlendi. (A) Apoptotik ve nekrotik Eca‑109 hücreleri akış sitometrisi ile analiz edildi. Üst panel bireysel nokta grafiklerini, alt panel ise özet verileri gösterir. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tübüloza.

Hedef proteinler, üreticinin protokolüne göre geliştirilmiş bir kemilüminesans tahlil kiti (Beyotime Biyoteknoloji Enstitüsü) kullanılarak tespit edildi.

İstatistiksel analiz. İstatistiksel anlamlılık, Tukey'in post hoc testiyle tek yönlü varyans analiziyle hesaplandı ve sonuçlar, tedavi ve kontrol grupları arasında GraphPad Prism 5.0 yazılımı (GraphPad Software, La Jolla, CA, ABD) kullanılarak analiz edildi. Tüm veriler ortalama ± standart sapma olarak sunuldu. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

BÖBREK FONKSİYONUNUN GELİŞTİRİLMESİ İÇİN CISTANCHE TUBULOSA EKSTRESİ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Sonuçlar

CTPG‑W, Eca‑109 hücrelerinin büyümesini baskılar.

CTPG-W'nin bileşenleri, ekinakozit ve akteozit standartlarıyla karşılaştırılan HPLC (Şekil 1) ile nitelendirildi ve ölçüldü. Pik alıkonma süreleri ve pik alanlarına göre CTPG-W, %39,16 oranında ekinakozit ve %2,44 oranında akteozit içermektedir. İlk olarak CTPG-W'nin Eca-109 hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkisi bir MTT tahlili ile belirlendi. CTPG-W, 200 mg/ml'de DMSO içinde çözüldü ve %10 ısıyla inaktive edilmiş FBS içeren RPMI{11}} ortamıyla belirtilen konsantrasyonlara kadar seyreltildi. Eca-109 hücreleri CTPG-W ile muamele edildi ve hücre canlılığı, belirtilen zaman noktalarında bir MTT tahlili ile analiz edildi. CTPG‑W tedavisi, Eca-109 hücrelerinin canlılığını doza ve zamana bağlı bir şekilde önemli ölçüde azalttı (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Şekil 4. Eca-109 hücrelerinde CTPG-W'nin hücre döngüsü dağılımı üzerindeki etkisi. Eca-109 hücrelerini 24 saat boyunca tedavi etmek için farklı CTPG-W konsantrasyonları kullanıldı ve hücre döngüsü dağılımı, akış sitometrisi ile analiz edildi. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tübüloza.

CTPG‑W, Eca‑109 hücrelerinde apoptozu indükler. CTPG-W'nin apoptoz veya nekrozun indüklenmesi yoluyla Eca-109 hücrelerinin büyümesini baskılayıp baskılamadığını araştırmak için hücreler farklı konsantrasyonlarda CTPG-W ile tedavi edildi. 24 saat sonra Annexin V/PI boyama ile Eca-109 hücrelerinde apoptoz ve nekroz tespit edildi. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, Annexin V- /PI+ hücreleri nekrotik hücreler olarak, Annexin V+ /PI+ ve Annexin V+ /PI- hücreleri ise apoptotik hücreler olarak kapılanmıştır. CTPG-W, öncelikle Eca-109 hücrelerinin apoptozunu doza bağlı bir şekilde uyardı, ancak nekrotik Eca-109 hücreleri ayrıca 600 ve 800 µg/ml CTPG-W (P) tedavisi altında önemli ölçüde arttı.<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG‑W, Eca‑109 hücrelerinde S fazında hücre döngüsü durmasını tetikler. Kanser hücre döngüsünün bozulması hücre büyümesini baskılayacak ve apoptozu teşvik edecektir (27). Eca-109 hücrelerinde hücre döngüsünün dağılımı, 24 saatlik CTPG-W tedavisinin ardından PI boyama ile tespit edildi. CTPG‑W tedavisi sonrasında S fazındaki hücrelerin arttığı ve G0/G1 fazlarındaki hücrelerin genel olarak önemli bir düşüş gösterdiği gözlendi (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG‑W, Δψm'yi azaltır ve sitokrom c salınımını indükler. Apoptoz mitokondriye bağımlı bir yol ile indüklenebilir (28,29). BCL-2 protein ailesinin pro- ve anti-apoptotik üyeleri, mitokondriyal membran bütünlüğünün düzenlenmesinde önemli roller üstlenirler (30,31). 24 saatlik CTPG-W tedavisinin ardından Δψm, JC‑1 boyama kullanılarak değerlendirildi. JC‑1 agregatı (FL‑2'de tespit edilen kırmızı floresan), Δψm azalırken (32) monomer halinde parçalanacaktır (FL-1'de yeşil floresan tespit edilmiştir). Şekil 5A'da gösterildiği gibi FL-1+ FL-2-/+ hücrelerinin frekansları, doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde arttı; bu, Eca‑109 hücrelerinin Δψm'sinin azaldığını gösterir. Eca‑109 hücrelerindeki floresans değişiklikleri ters floresans mikroskobuyla da gözlemlendi (Şekil 5B). Artan CTPG‑W konsantrasyonlarıyla birlikte kırmızı floresans azaldı ve yeşil floresans arttı; bu, akış sitometrisinden elde edilen verilerle tutarlıdır. Ayrıca sitozoldeki sitokrom c seviyesinin belirgin şekilde arttığı da gözlendi (Şekil 5C), bu da Δψm'nin azalmasının bir sonucudur. Bu, CTPG-W tedavisinin bir sonucu olarak Δψm'nin azaldığı FL-1+ FL-2-/+ hücrelerinin artan sayısından çıkarılan sonucu güçlendirir. JNK'nin, sitokrom c (33-35) salınımına neden olan BCL-2 protein ailesinin aktivasyonunu düzenleyebildiği rapor edilmiştir. Ayrıca CTPG-W tedavisinin ardından JNK seviyesinin belirgin şekilde yukarı doğru düzenlendiği de belirlendi (Şekil 5C). Sonuçlar, CTPG-W'nin, mitokondriye bağımlı bir yol yoluyla Eca-109 hücrelerinin apoptozunu indükleyebileceğini gösterdi.

Şekil 5. Δψm'nin azaltılması ve sitokrom c ve JNK'nin yukarı regülasyonu. Eca-109 hücreleri, 24 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda CTPG-W ile işleme tabi tutuldu. (A) Δψm, JC‑1 boyama ile tespit edildi ve numuneler akış sitometrisi ile analiz edildi. Bireysel nokta grafikleri JC‑1 floresansındaki değişiklikleri gösterir. FL-1+ FL-2-/+ hücrelerinin frekansları alt panelde gösterilmektedir. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Şekil 6. CTPG-W tedavisi sonrasında Eca-109 hücrelerindeki ROS seviyeleri ve CTPG-W'nin antioksidan aktivitesi. (A) Eca-109 hücreleri farklı konsantrasyonlarda CTPG‑W ile tedavi edildi ve ROS seviyeleri, belirtilen zaman noktalarında akış sitometrisi ile analiz edildi. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

CTPG‑W'nin hücre içi ROS üretimi üzerindeki etkisi.ROS, apoptozu tetiklemek için Δψm'yi azaltabilir (36). CTPG-W'nin ROS üretimini arttırıp arttıramayacağını araştırmak için Eca-109 hücreleri farklı konsantrasyonlarda CTPG-W ile işleme tabi tutuldu. Hücreler belirtilen zaman noktalarında toplandı ve DCFH-DA ile boyandı. Eca-109 hücrelerinde hücre içi ROS üretimi, akış sitometrisi ile belirlendi. Şekil 6A'da gösterildiği gibi, 800 µg/ml CTPG-W, ROS üretimini 2-6 saatten önemli ölçüde artırdı ve 12-24 saatten itibaren azaldı. Ek olarak 400 µg/ml CTPG‑W, ROS üretimini 12-24 saatten önemli ölçüde artırdı. Ayrıca 200 µg/ml CTPG-W, ROS üretimini önemli ölçüde değiştirmedi. ROS üretimindeki dinamik değişiklikler Eca-109 hücresi apoptozu ile ilişkili olabilir. Ayrıca CTPG-W'nin, 12 saat sonra 800 µg/ml CTPG-W ile tedavi edilen Eca-109 hücrelerinde azalan ROS üretimi ile ilişkili olabilecek serbest radikal temizleme aktivitesine sahip olduğu da belirlendi (Şekil 6B).

Şekil 7. CTPG-W tedavisinin ardından bölünmüş kaspazlar ve bölünmüş PARP seviyeleri. Proteinler, CTPG-W ile 24 saat boyunca işleme tabi tutulan Eca-109 hücrelerinden izole edildi ve bölünmüş kaspaz ve bölünmüş PARP seviyeleri western blot analizi ile tespit edildi. DMSO, dimetil sülfoksit; CTPG-W, suda çözünür feniletanoid glikozitlerC. tübüloza; PARP, poli (ADP-riboz) polimeraz.

CTPG‑W kaspaz‑3, kaspaz‑7, kaspaz‑9 ve PARP'ın aktivitesini yükseltir. Δψm azalması nedeniyle sitokrom c'nin salınması, apoptozu indüklemek için kaspaz proteazlarını aktive edebilir (29,30,37). 24 saatlik CTPG-W tedavisinin ardından kaspaz-3, 7, 8, 9 ve PARP'nin aktivasyonu western blot analizi ile tespit edildi. Kontrolle karşılaştırıldığında, bölünmüş kaspaz-9, bölünmüş kaspaz-7, bölünmüş kaspaz-3 ve bölünmüş-PARP seviyeleri görüldü, ancak bölünmüş kaspaz{{20 seviyeleri görülmedi }}, CTPG tedavisi ile doza bağlı bir şekilde yukarı doğru düzenlenmiştir (Şekil 7). Bu sonuçlar CTPG-W'nin Δψm'yi azalttığını ve Eca-109 hücrelerinin apoptozunu indükleyen kaspazları aktive etmek için sitokrom c salınımını teşvik ettiğini gösterdi.

Tartışma

Geleneksel CHM, özofagus kanseri hücrelerinin apoptozunu, dışsal ölüm reseptörü ve içsel mitokondriyal ve endoplazmik retikulum stres yolları dahil olmak üzere farklı yollar yoluyla indükleyebilir (29). Önceki çalışmamız, C. tubulosa'nın ana bileşeni olan CTPG'nin, mitokondriye bağlı bir yol yoluyla apoptozun indüklenmesi yoluyla melanom B16-F10 hücrelerinin büyümesini inhibe ettiğini gösterdi (24). Bu çalışmada CTPG-W'nin Eca-109 hücreleri üzerindeki antitümör etkisi araştırılmış ve CTPG-W'nin Eca-109 hücrelerinin büyümesini baskıladığı, apoptozu indüklediği ve hücre döngüsünün durdurulmasını sağladığı belirlenmiştir. Δψm'yi azalttı, sitokrom c salınımını arttırdı ve kaspazları aktive etti. CTPG ve CTPG-W, kanser hücrelerinde apoptozu ve hücre döngüsü durmasını indükleyebilir. Bununla birlikte, CTPG'nin (%26,64 ekinakozit, %10,19 akteozit ve %1,71 izoakteozit) ve CTPG-W'nin (%39,16 ekinakozit ve %2,44 akteozit) farklı bileşenleri nedeniyle doğru mekanizmalar farklıdır. CTPG, G0/G1 fazlarında B16-F10 hücrelerini tutukladı, ancak CTPG-W, S fazında (24) Eca{26}} hücrelerini tutukladı. ROS üretimi CTPG tarafından doza bağlı olarak arttı, ancak CTPG-W tedavisinin başlangıcında (2-6 saat) önemli ölçüde artan yüksek dozda CTPG‑W ile zamana bağlı bir şekilde bir değişiklik olduğunu gösterdi ve kontrole kıyasla 12 saat sonra önemli ölçüde azaldı. Olası bir neden CTPG-W'nin ana bileşeninin ekinekozit olmasıdır. Birçok çalışma, ekinekosidin, nöroprotektif ve yaşlanma karşıtı etkilerini ortaya koymak için ROS üretimini ve ROS kaynaklı apoptozu inhibe edebildiğini bildirmiştir (38-40). Benzer şekilde bu çalışmada da serbest radikal temizleme aktivitesi gözlendi. Bu nedenle, yüksek dozda CTPG-W içindeki verbascoside, iso-verbascoside ve salidrosid dahil bazı bileşenlerin, Eca{39}} hücrelerinde apoptoza neden olacak şekilde ROS oluşumunu anında indükleyebileceği (41,42) ve ardından da spekülasyon yapıldı. ROS echi tarafından temizlendinakosid. CTPG ve CTPG-W'nin ROS üretimindeki farklılıkların bir diğer olası nedeni de bu çalışmada ve önceki çalışmada farklı hücre hatlarının kullanılmış olmasıdır (24). Dong ve arkadaşları (43), ekinakosidin, ROS seviyelerini artırmadan oksidatif DNA hasarı oluşturarak insan SW480 kolorektal kanser hücrelerinin apoptozunu indükleyebileceğini bildirdi.

CTPG-W tedavisi Δψm'yi azalttı ve kaspaz-9'ın bölünmesini teşvik eden sitokrom c salınımına neden oldu (28). Tutarlı bir şekilde, bölünmüş kaspaz-9 seviyeleri CTPG-W tedavisiyle yukarı doğru düzenlendi. Daha sonra aktif kaspaz-9, apoptozu tetiklemek için kaspaz-3'ı aktive edebilir (44). Bölünmüş kaspaz-3 seviyeleri de CTPG-W tedavisiyle yukarı doğru düzenlendi. Bununla birlikte kaspaz-8, CTPG-W tarafından aktive edilmemiştir; bu durum, CTPG-W tarafından indüklenen apoptozda dışsal ölüm reseptör yolunun yer almadığını göstermektedir. Bu gözlemler, CTPG-W'nin, mitokondriye bağımlı bir yolun aktivasyonu yoluyla Eca-109 hücrelerinin apoptozunu indüklediğini göstermektedir.

PARP, genomik stabilitede önemli roller üstlenir ve aktif kaspazlar, özellikle kaspaz-3 ve -7 (45) tarafından bölünebilir. CTPG-W tedavisinin, PARP'ı parçalayarak DNA onarımını inhibe edebilen ve apoptoza neden olabilen kaspaz-3 ve -7'yi aktive ettiği belirlendi.

CTPG-W ayrıca insan hepatoselüler karsinoma BEL-7404 hücrelerinin büyümesini doza ve zamana bağlı olarak baskılar (yayınlanmamış veriler). CTPG-W, Eca-109 ve BEL-7404 hücrelerinin büyümesini engellese de splenositlerin çoğalmasını teşvik eder, bu durum CTPG-W'deki polisakkarit içeriğinden (~%50) kaynaklanıyor olabilir (46 ). Benzer şekilde, çeşitli çalışmalar polisakkaritlerin splenositlerin (46-49) çoğalmasını destekleyebildiğini bildirmiştir. Fare modelinde CTPG‑W'nin kontrol grubuyla karşılaştırıldığında dalak indeksini önemli ölçüde arttırdığı ancak vücut ağırlığını ve kalp, karaciğer, böbrek ve akciğer gibi diğer organ indekslerini etkilemediği belirlendi (yayınlanmamış veriler), CTPG-W'nin normal hücreler üzerinde sitotoksik etkisinin olmadığını gösterir.

Toplu olarak veriler, CTPG-W'nin, mitokondriyal bağımlı bir yol yoluyla apoptozun başlatılması yoluyla Eca-109 hücrelerinin büyümesini engellediğini gösterdi.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%