Cistanche Tubulosa'dan Sükroz Sentazının Gen Klonlaması, Fonksiyonel Tanımlanması, Yapısal ve Ekspresyon Analizi

Soyut:Sükroz sentaz, çeşitli metabolik işlemler için biyoaktif bir glikosil donörü olarak görev yapan üridin difosfat (UDP)-glikozun üretimini katalize ederek bitki şeker metabolizması yolunda önemli bir rol oynar. Bu çalışmada CtSus isimli sükroz sentaz geni klonlandı.Cistanche tubulosaZengin içeriğiyle bilinen geleneksel bir Çin tıbbıçeşitli glikozitlerin içeriği, transkriptom analiz sonuçlarına dayanmaktadır. CtSus'un açık okuma çerçevesi, 805 amino asidi kodlayan 2 418 bp uzunluğundaydı. Dizi analizi, CtSus proteininin hem N-terminal hem de C-terminal bölgelerinde bitki sakaroz sentaz ailesiyle ilişkili korunmuş alanları ortaya çıkardı. Filogenetik analiz, CtSus'un yakın bir evrimsel ilişkiyi paylaştığını gösterdi.sükroz sentezleridiğer bitkilerden aynı sırada. CtSus'un fonksiyonel tanımlanması, karakterize edilmiş bir glikosiltransferaz enzimi olan UGT71BD1 ile tam hücre katalizinin birleştirilmesi yoluyla gerçekleştirildi. Sonuçlar, CtSus'un eklenmesinin, UGT71BD1 tarafından katalize edilen glikosilasyonun dönüşüm oranını önemli ölçüde arttırdığını gösterdi. Escherichia coli'de CtSus'un çözünür ifadesi ayrıca pCold™ TF ifade vektörü kullanılarak elde edildi. İn vitro enzimatik analiz, CtSus'un sükroz ve UDP varlığında UDP-glikoz oluşumunu katalize etme aktivitesini gösterdi. Gerçek zamanlı kantitatif-polimeraz zincir reaksiyonu sonuçları, C.tubulosa'nın farklı kısımlarındaki CtSus geninin ekspresyon modellerinin ve C.tubulosa'nın kuraklık stresi altındaki süspansiyon hücre kültürlerinin sırasıyla feniletanol glikozitleri için gözlemlenen birikim modelleriyle korele olduğunu gösterdi. Ayrıca, anahtar amino asitler ve bunların enzim ile substrat arasındaki etkileşimleri, protein yapısı tahmini ve moleküler kenetlenme sonuçlarına dayalı olarak araştırıldı. Genel olarak bulgularımız, C. tubulosa'daki glikozit ürünlerinin biyosentezi sırasında aktif glikosil donör UDP-glikozun tedarikinden sorumlu bir sakaroz sentaz CtSus'u tanımlar ve ayrıca glikozit ürünleri üretimi için mühendislik türü yapımında kullanılabilecek bir gen elemanı sağlar.

Anahtar kelimeler: Cistanche tubulosa; sükroz sentazı; glikozitler; UDP-glikoz; enzimatik kataliz

DICHEN CISTANCHE YUTIAN, HOTAN, SİNCAN'DA ÜSLER İŞLİYOR

Wecistanche Destek Hizmeti-Çin'deki en büyük cistanche ihracatçısı:

E-posta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Cistanche tubulosa (Schenk) R. WightOrobanchaceae familyasının Cistanche cinsine ait çok yıllık otsu parazit bir bitkidir. Sincan ve İç Moğolistan'a özgü, geleneksel, nadir ve değerli bir Çin tıbbi malzemesidir. Doğası gereği tatlı, tuzlu ve sıcaktır ve aşağıdaki işlevlere sahiptir:tonlayıcı böbrek yang, öz ve kandan faydalanmakve bağırsakların nemlendirilmesi vekabızlığı gidermek. "" olarak bilinir.çöl ginsengi" [1]. Modern araştırmalar şunu buldu:Cistanche tubulosaiçerirçeşitli kimyasal bileşenlerörneğinfeniletanoid glikozitler, iridoid eter terpenlerve bunların glikozitleri, lignanları ve bunların glikozitleri, oligosakkarit esterleri, polisakkaritleri, poliolleri, oligosakkaritleri, sterolleri ve bunların glikozitleri, monoterpenoid glikozitler, şekerler, amino asitler ve uçucu yağlar [2,3]özellikle glikozit bileşikleri en önemli etken maddelerdir. Bunlar arasında feniletanoid glikozit bileşikleri, orijinal tıbbi malzemede en yüksek içeriğe sahip olan ve nöroproteksiyon ve yaşlanma karşıtı gibi çok çeşitli farmakolojik aktivitelere sahip olanlardır [4]. Yukarıda bahsedilen glikozit bileşiklerinin biyosentezi, aşağıdakiler tarafından katalize edilen birden fazla glikozilasyon reaksiyonu adımını içerir:bitkilerde glikosiltransferazlarveaktif glikozil donörlerinin sağlanmasıbu süreçte olmazsa olmazdır. Organizmalardaki yaygın aktif şeker donörleri arasında üridin difosfat (UDP), timidin difosfat (TDP) ve guanozin difosfat (GDP) bulunur. Bunlar arasında UDP-glikoz, bitkilerde en yaygın aktif glikosil donörüdür. Glukozil transfer reaksiyonunu katalize etmek için sadece glukoziltransferaz tarafından doğrudan tanınmakla kalmaz, aynı zamanda diğer glikosil donör türlerinin sentezine katılmak için bir öncü olarak da kullanılabilir. Örneğin, UDP-glikoz, 4,6-dehidrataz, 3,5-izomeraz ve 4-redüktazın[5] katalizi altında UDP-ramnoz üretmek için bir substrat olarak kullanılabilir; UDP-glikoz, UDP-ksilozun UDP-glikoz dehidrojenaz ve UDP-ksiloz sentaz yoluyla sentezini katalize etmek için bir substrat olarak kullanılabilir; UDP-ksiloz, UDP-arabinoz[6] oluşturmak için UDP-ksiloz epimeraz tarafından daha da katalize edilebilir; UDP-glikoz ve UDP-galaktoz diastereomerlerdir ve epimeraz aracılığıyla birbirlerine dönüştürülebilirler[7,8]. Bu nedenle, UDP-glikoz sentezinin bitkilerde aktif glikosil donörlerinin temini ve sekonder metabolitlerin glikosilasyon modifikasyonu üzerinde önemli bir etkisi vardır.

Bitkilerde UDP-glikozun sentezi sentaz yolu, fosforilaz yolu ve kinaz yolu aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Bunlar arasında, sükroz sentaz, UDP-glikoz ve fruktozun yanı sıra ters reaksiyonu oluşturmak için UDP ile sükroz arasındaki reaksiyonu doğrudan katalize edebilir [9]. Geniş anlamda sükroz sentaz, sükroz sentezi fosfataz, trehaloz sentaz ve trehaloz fosforilaz gibi çeşitli glikosiltransferazları içeren glikosiltransferaz-4 alt ailesine aittir [10]. Sükroz sentaz ilk olarak buğday tohumunda tanımlandı [11]. O zamandan bu yana araştırmacılar, maş fasulyesi (Vigna radiata), pirinç (Oryza sativa), mısır (Zea mays), soya fasulyesi (Glycine max) ve şeftali (Amygdalus persica) gibi çeşitli bitkilerden yüzlerce sükroz sentaz geni tanımladılar. Sakkarozun taşınması ve dağıtımı, nişasta sentezi, selüloz sentezi ve hücre duvarı bileşimi, biyotik ve abiyotik stres vb. dahil olmak üzere bitkilerde çoklu metabolik süreçlerde yer alırlar ve bitki karbon kaynağı tahsisinde önemli bir düzenleyici rol oynarlar [12]. Ayrıca araştırmacılar, fizyolojik fonksiyonların incelenmesine dayanarak elde edilen sakaroz sentazını, glikozit bileşiklerinin enzimatik sentezi için bir gen elemanı olarak kullandılar ve ideal sonuçlara ulaştılar. Örneğin, Masada ve ark. [13], Arabidopsis thaliana'dan sükroz sentaz geni AtSus-1'u ve Catharanthus roseus'tan glikosiltransferaz geni CaUGT2'yi in vitro olarak birlikte eksprese ettiler ve kurkuminin glikozilasyon reaksiyonunu katalize etmek için tek kaplı bir ikili enzim sistemi kullandılar; kurkumin glikozit verimi 7 kat artar. Aynı zamanda kullanılan UDP-glukoz donörünün miktarı başlangıçtaki miktarın yalnızca onda biri kadardı.

Bungaruang ve ark. [14] soya fasulyesinden sükroz sentaz GmSuSy ve pirinçten glikosiltransferaz OsUGT kullanarak birleşik bir katalitik sistem oluşturdular. Yalnızca az miktarda UDP (1.0 mmol·L-1) ve sakkaroz ekleyerek nothofagin'in glikosilasyon modifikasyonunu başardılar. OsUGT'nin tek enzim kataliziyle karşılaştırıldığında, glikosilasyon ürünlerinin üretimi μmol·L-1'den mol·L-1'ye kadar üç kat arttı.

Cistanche tubulosa'daki glikozit bileşiklerinin zenginliği ve çeşitliliği, ikincil metabolitlerin glikosilasyon modifikasyonuyla ilişkili güçlü bir sakaroz sentazı içermesi gerektiğini düşündürmektedir, ancak bu enzim, Cistanche cinsinin bitkilerinde bildirilmemiştir. Bu yazıda materyal olarak farmakopede yer alan tıbbi materyallerden biri olan Cistanche tubulosa kullanılmıştır. Transkriptom analizi ve farklı parçaların karşılaştırmalı transkriptom analizi yoluyla, bir sükroz sentaz geni CtSus'u çıkarmak ve tanımlamak için moleküler biyoloji teknikleri kullanıldı. CtSus'un fonksiyonunu ve bunun ile korelasyonunu araştırmak için kuraklık stresi altında Cistanche tubulosa ve bitki doku kültürü sistemlerinin farklı kısımlarında biyoinformatik analiz, tam hücre biyotransformasyonu, prokaryotik ekspresyon ve saflaştırma, in vitro enzim katalitik aktivite analizi ve gen ekspresyon analizi yapıldı. Cistanche tubulosa'daki glikozit bileşiklerinin biyosentezi, Cistanche tubulosa'daki glikozit bileşiklerinin biyosentetik yolunun incelenmesi için bir temel oluşturuyor.

Malzemeler ve yöntemler

Malzemeler Taze Cistanche tubulosa bitkileri Çin'in Sincan şehrindeki Hotan Şehrinden toplandı ve biyolojik tanımlama Pekin Üniversitesi'nden Profesör Tu Pengfei tarafından yapıldı; Cistanche tubulosa süspansiyon hücre kültürü sistemi araştırma grubumuz tarafından erken aşamada kurulmuştur [15]; E. coliFast-T1, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.'den satın alınmıştır; E. coli BL21 (DE3), Beijing Quanshijin Bioteknoloji Co., Ltd.'den satın alınmıştır; pCold™ I ve pCold™ TF vektörleri Bio-Tech (Beijing) Co., Ltd.'den satın alınmıştır; UDP-glikoz kontrolü, Xi'an Qiyue Bioteknoloji Co., Ltd.'den satın alındı ​​ve eskülin ve resveratrol substratları, Shanghai Yuanye Bioteknoloji Co., Ltd.'den satın alındı.

DICHEN CISTANCHE HOTAN, SİNCAN'DA ÜSLER İŞLİYOR

RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezi RNA, OMEGA RNA Bitki Kitinin (Cat R6827-01, Omega Bio-Tek) talimatlarına göre ekstre edildi. RNA'nın saflığını, konsantrasyonunu ve bütünlüğünü tespit etmek için agaroz jel elektroforezi ve Nanodrop 2000 spektrofotometre kullanıldı. Nitelikli RNA örnekleri, cDNA'nın ilk zincirini sentezlemek için ters transkripsiyon kiti TransScript® OneStep gDNA Kaldırma ve cDNA Sentezi SuperMix (Cat AT311-02, Beijing Quanshijin Bioteknoloji Co., Ltd.) kullanılarak ters kopyalandı.

Sükroz sentaz genlerinin madenciliği ve CtSus genlerinin klonlanması İşlevsel olarak tanımlanmış Arabidopsis thaliana sükroz sentaz AtSus1'in (GenBank erişim numarası: AED92894.1)[16] amino asit dizisi şablon olarak kullanıldı. Sükroz sentaz genleri, C. tubulosa'nın transkriptom verilerinden, transkriptom gen açıklaması, FPKM (gen ekspresyonu bolluğu) analizi ve karşılaştırmalı transkriptom veri analizi ile birleştirilen yerel Blastp sekans hizalaması yoluyla tarandı. C. tubulosa'nın ikinci nesil transkriptom verileri tarafından sağlanan aday gen sekansı bilgilerine dayanarak spesifik primerler tasarlandı (Tablo 1). Şablon olarak C. tubulosa cDNA kullanıldı ve hedef genin PCR amplifikasyonu, yüksek kaliteli bir PCR enzimi (Cat P505-d1, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.) kullanılarak gerçekleştirildi. PCR amplifikasyon ürünü, FastPure Gel DNA Ekstraksiyon Mini Kiti (Cat DC201-01, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.) kullanılarak saflaştırıldı ve daha sonra hızlı klonlama kitine (Cat C112-01, Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.), çalıştırma talimatlarına göre pCE2 TA/Blunt-Zero klonlama vektörüne bağlandı, Fast-T1 yetkin hücrelere aktarıldı ve gece boyunca 37 derecede kültürlendi. Plazmit ekstre edildi ve dizilimin tanımlanması için Beijing Liuhe BGI Genomics Co., Ltd.'ye gönderildi.

Tablo 1 Bu çalışmada kullanılan primerlerin nükleotid dizisi. qPCR: Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zinciri reaksiyonu

Cistanche tubulosa'dan sakaroz sentaz CtSus'un biyoinformatik analizi

Proteinin fizikokimyasal özelliklerini analiz etmek için çevrimiçi yazılım ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) kullanıldı; proteinin transmembran yapısını tahmin etmek için çevrimiçi yazılım TMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM{{0}}.0/) kullanıldı; çevrimiçi yazılım SOPMA (https://npsa-rabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) kullanıldı. proteinin ikincil yapısını tahmin etmek; protein amino asit dizisinin korunmuş alanını tahmin etmek için çevrimiçi yazılım SMART (http://smart.embl.de/) kullanıldı; DANMAN yazılımı, CtSus'un amino asit dizilerini diğer türlerden gelen sakaroz sentezlerininkilerle karşılaştırmak için kullanıldı; Filogenetik ağaç, 1000 kez önyükleme tekrarı ile MEGA11 yazılımı kullanılarak komşu birleştirme yöntemi kullanılarak küme analizi yoluyla oluşturuldu.

Cistanche tubulosa'nın farklı kısımlarında ve kuraklık stresi altında CtSus'un ekspresyon analizi

CtSus ve dahili referans geni DNAj için gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR primerleri, DNAMAN yazılımı kullanılarak tasarlandı [17] (Tablo 1). Cistanche tubulosa'nın farklı kısımlarında ve kuraklık stresi altında Cistanche tubulosa'nın süspansiyon hücrelerinde CtSus geninin nispi ekspresyon seviyesi, gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR ile analiz edildi. Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR analizi, TransStart® Top Green qPCR SuperMix Kiti (Cat AQ131-01, Beijing Quanshijin Bioteknoloji Co., Ltd.) kullanılarak gerçekleştirildi. Amplifikasyon programı iki aşamalı bir yöntemi benimsemiştir: 30 saniye boyunca 94 derece; 5 saniye boyunca 94 derece, 30 saniye boyunca 60 derece, 40 döngü boyunca tekrarlanır; Bio-Rad CFX Connect™ Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sisteminde (Bio-Rad Laboratuvarı, Hercules, CA, ABD) çalıştırıldı. Farklı deney gruplarında CtSus geninin göreceli ifadesini analiz etmek için 2-ΔΔCT yöntemi kullanıldı. Önemlilik analizi ve çubuk grafik çizmek için GraphPadPrism 9 kullanıldı.

CtSus geninin prokaryotik ekspresyon vektörünün ve heterolog ekspresyonunun oluşturulması Gen dizileme sonuçlarına dayanarak, PCR amplifikasyonu için vektör homoloji kollarını ve kısıtlama bölgelerini (Tablo 1) içeren spesifik primerler tasarlandı. Hedef gen CtSus, ClonExpress Ultra Tek Adımlı Klonlama Kiti (CatC115-01) kullanılarak kesintisiz klonlama teknolojisi kullanılarak pET-28a, pET-24b, pCold™ I ve pCold™ TF ekspresyon vektörleri halinde oluşturuldu. , Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.). Başarılı bir şekilde oluşturulan rekombinant ekspresyon vektörlerinin plazmitleri ekstre edildi ve Escherichia coli ekspresyonuna yetkin hücre Transetta'ya (DE3) dönüştürüldü. Hücreler, 50 µg·mL-1 kanamisin sülfat (ekspresyon vektörleri olarak pET-28a ve pET-24b ile) veya 1{{ içeren LB sıvı ortamında kültürlendi. 22}}0 µg·mL-1 ampisilin (ekspresyon vektörleri olarak pCold™ I ve pCold™ TF ile) ve sırasıyla 50 ug·mL-1 kloramfenikol, 37 derece ve 200 dev/dak'da{{ 15}} bakteriyel solüsyonun A600 değeri 0.4-0.6'ya ulaşana kadar çalkalanarak. Protein ekspresyonunu indüklemek için 0,5 mmol·L-1'lik nihai konsantrasyonda izopropil-beta-Dtiyogalaktopiranosid (IPTG) ekleyin. 23 derecede (ekspresyon vektörleri olarak pET-28a ve pET-24b ile) veya 15 derecede (ekspresyon vektörleri olarak pCold™ I ve pCold™ TF ile), 180 r· sabit sıcaklıktaki bir çalkalayıcıda inkübe edin. 16 saat (ekspresyon vektörleri olarak pET28a ve pET-24b ile) veya 24 saat (ekspresyon vektörleri olarak pCold™ I ve pCold™ TF ile) dk-1, ardından bakterileri santrifüjleme yoluyla toplayın.

Lizis tamponu (20 mmol·L-1 NaH2PO4-Na2HPO4, 0,5 mol·L-1 NaCl, 20 mmol·L{{10} } imidazol, %3 gliserol, 100 mmol·L-1 fenilmetilsülfonil florür, 1 mg·mL-1 lizozim, pH 7,4) ilave edildi ve hücreler 8 dakika süreyle kırıldı ve santrifüjlendi. Sırasıyla süpernatan ve çökelti alındı. Süpernatan, His etiketini içeren hedef proteini adsorbe etmek için Ni Sepharose 6 Fast Flow dolgu maddesiyle doldurulmuş HisTrap FF afinite kolonu (Cat 17531901, Cytiva) tarafından adsorbe edildi. Farklı konsantrasyonlarda imidazol ile elüsyondan sonra her fraksiyon, SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi) tespiti için alındı. Hedef proteini içeren fraksiyonlar birleştirildi, santrifüjleme yoluyla konsantre edildi ve ultrafiltrasyon tüpü (Millipore) ile tuzdan arındırıldı ve [50 mmol·L-1 içeren) Tris-HCl (pH 7,5), 0,2 mol·L{{ içeren tamponda saklandı Sonraki in vitro enzimatik kataliz reaksiyonları için 30}}NaCl, 1 mmol·L-1 ditiyotreitol, %3 gliserol].

CtSus tam hücre katalizi Araştırma grubu tarafından daha önce tanımlanmış olan pCold™ I-CtSus plazmidi ve glikosiltransferaz UGT71BD1'in ekspresyon plazmidi pET-28a-UGT71BD1[18] eş zamanlı olarak ekspresyon yetkinliğine dönüştürüldü E. coli Transetta (DE3). Hem CtSus hem de UGT71BD1 genlerini içeren pozitif rekombinant bakteriler seçildi ve 50 ug·mL-1 kanamisin sülfat, 100 ug içeren LB ortamına (büyüme ortamı) aşılandı ·mL-1 ampisilin ve 50 ug·mL-1 kloramfenikol, 1:100 (V/V) oranında. Kültür, bakteriyel çözeltinin A600 değeri 0.4-0.6 olana kadar 37 derecede kültürlendi ve ardından 1 mmol·L-1 nihai konsantrasyonunda IPTG eklendi. Kültür 24 saat boyunca 15 derece ve 180 devir/dakikada-1 sürdürüldü. Kültür 4 derecede ve 4 000 r·min-1'de santrifüjlendi. Hücreleri toplayın. Toplanan hücreleri, bakteri gramı başına 40 mL kültür ortamı oranında M9 ortamına (fermantasyon ortamı) aşılayın ve 75 μmol·L-1 sukroz ve 25 μmol·L-1 aesculetin (1) ekleyin veya resveratrol (2) substratlarını reaksiyon gruplarına bağlar. Kültürü 24 saat boyunca sallamaya devam edin, 4000 x g'de, 4 derecede 30 dakika boyunca santrifüjleyin, çökeltiyi ultrasonik olarak kırmak için metanol ekleyin, süpernatanta hacminin 2 katı metanol ekleyin, 4000 x g'de, 4 derecede 30 dakika boyunca santrifüjleyin, Süpernatantı alın ve birleştirin, solventi azaltılmış basınç altında buharlaştırın, metanolde yeniden çözün, 0,22 μm filtre membranından filtreleyin ve reaksiyon ürününü Agilent 1260 yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanarak tespit edin. Analitik kolon olarak CAPCELL PAK C18 KOLON (250 mm×4,6 mm, 5 µm), mobil faz olarak %0,1 formik asit suyu (A) ve metanol (B) kullanıldı ve elüsyon gradyanı şu şekildeydi: {{61 }} dakika, %30-90 B; 25-27 dakika, %90-100B; 27-33 dakika, %100 B. Kütle spektrometresi parametreleri pozitif ve negatif iyon modları ve otomatik çok aşamalı MS1, MS2 ve MS3 tam taramalarıdır.

CtSus'un in vitro enzim katalitik aktivitesinin saptanması Yukarıda bahsedilen HisTrap FF kolon afinite kromatografisi ile elde edilen rekombinant protein, Faktör Xa kullanılarak terminal etiketinin çıkarılmasına tabi tutuldu. Enzim sindirim sistemi şu şekildeydi: rekombinant protein, 1 mg·mL-1 konsantrasyonuna ayarlandı ve 1 μL Faktör Xa, 50 μL rekombinant proteine, bir tampon içinde eklendi. 20 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8,0), 100 mmol·L-1 NaCl ve 2 mmol·L-1

CaCl2 23 derecede 6 saat süreyle. Reaksiyon sistemi 100 μL idi. Enzim sindirim sisteminin ürünü, sonraki in vitro enzim kataliz reaksiyonları için etiketin çıkarılmasıyla hedef proteinin elde edilmesi amacıyla HisTrap FF afinite kromatografisi ile ikincil protein ayrımına tabi tutuldu. Enzim reaksiyon sistemi şu şekildeydi: 10 mmol·L-1 UDP, 100 mmol·L-1 sakaroz, 50 mmol·L-1 MgCl2, 60 ug CtSus proteini, Tris-HCl (pH) 7.0) 100 μL ile desteklendi, 30 derecede bir su banyosunda 6 saat reaksiyona sokuldu ve son işlem ve HPLC analiz yöntemleri referansta [19] anlatıldığı gibi gerçekleştirildi.

CtSus proteini AlphaFold2'nin üç boyutlu yapı tahmini ve moleküler yerleştirme analizi, CtSus proteininin üç boyutlu yapısını tahmin etmek için kullanıldı [20]. Ligand molekülü hidrojenlendi ve AutoDock Tools 1.5.6 yazılımı kullanılarak yüklendi. Substrat bağlama cebi, şablon protein AtSus1 (PDBID 3S28) ile hizalanarak elde edildi. Boşluk etrafındaki amino asit kalıntılarının yan zincirleri esnek olacak şekilde ayarlandı.

Izgara kutusu 40 × 40 × 40 Å3'e ayarlandı ve ızgara aralığı 0,375 Å idi. AutoDock Vina'da moleküler yerleştirme gerçekleştirildi [21]. Modeli en iyi benzeşimle (kcat·mol-1) görselleştirmek için PyMOL 2.0 yazılımı kullanıldı.

).

İstatistiksel analiz İstatistiksel analiz için GraphPad Prism 9 kullanıldı. Deneysel veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi. İki grup arasındaki karşılaştırmada t testi, çoklu grup karşılaştırmalarında tek yönlü varyans analizi kullanıldı. P < 0.05 olduğunda fark istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.