Herba Cistanche'den Feniletanol Glikozitler Hipoksik Tümör Mikro Ortamını İyileştirir ve HIF‑1 Sinyal Yolu Yoluyla Oksaliplatinin Etkilerini Artırır

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

LIMEI WEN, JUNPING HU, JIAWEI ZHANG ve JIANHUA YANG

Soyut.

Karaciğer kanseri, en yaygın malign tümör türlerinden biridir ve yüksek malignite, hızlı ilerleme, yüksek morbidite ve mortalite ile karakterizedir. Oksaliplatinin (OXA), tolere edilebilir toksisite ile ilerlemiş karaciğer kanserine karşı belirgin bir etkinliğe sahip olduğu bildirilmiştir. Katı tümörlerde, hipoksik mikro ortam, karaciğer kanserinin platin ilaçlara karşı ilaç direncini de indükleyebilen epitelyal-mezenkimal geçişi (EMT) destekler. bitkicistanche (Cistanche tübüloza) geleneksel Çin tıbbında ve Herba'dan elde edilen feniletanoid glikozitlerde sıklıkla kullanılmıştır.cistanche(CPhG'ler) ana aktif bileşenlerdir. Bu çalışma, CPhG'lerin canlılık, apoptoz, göç ve karaciğer kanseri hücrelerinin istilası üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçladı. HepG2 karaciğer kanseri hücreleri kontrol, DMSO, CoCl2, OXA, OXA artı CoCl2 ve CPhGs artı OXA artı CoCl2 gruplarına ayrıldı. Ardından, hipoksi ile indüklenebilir faktör 1 (HIF-1), lisil oksidaz benzeri 2 (LOXL2) ve EMT ile ilgili genlerin ve proteinlerin (yani E -cadherin ve Twist), CPhG'lerin karaciğer kanseri üzerindeki etkilerini araştırmak için. Sonuçlar, CPhG'lerin OXA'nın karaciğer kanseri üzerindeki etkilerini artırabileceğini ve karaciğer kanseri hücrelerinin göçünü, istilasını ve apoptotik hızını engelleyebileceğini gösterdi. Ek olarak, CPhG tedavisi HIF‑1 , LOXL2 ve Twist'in aşağı regülasyonunu ve E‑kadherinin yukarı regülasyonunu etkin bir şekilde indükledi. Mevcut bulgular, CPhG'lerin OXA'ya duyarlılıkta önemli bir artışı tetiklediğini ve karaciğerde hipoksi ile indüklenen EMT'nin baskılandığını gösterdi.

cistanche faydası: anti-Karaciğer kanseri

giriiş

Liver cancer is a malignant tumor that usually involves the digestive system, and consists of primary and secondary types. Primary liver cancer is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >2030 yılına kadar 1,000,000 karaciğer kanserine bağlı ölümler ve yeni teyit edilen vakaların yüzde 46,6'sını Çin anakarasındakiler oluşturacak.

Oksaliplatinin (OXA), klinik ortamlarda tolere edilebilir toksisite ile karaciğer kanserinin büyümesi üzerinde engelleyici etkiler gösterdiği bildirilmiştir. Bununla birlikte, platin bazlı ilaç tedavisinin genel etkinliği, tümör hücresi direnci tarafından engellenir (4). Karaciğer kanserinin diğer kanser türlerine kıyasla kemoterapiye daha düşük duyarlılık gösterdiği iyi bilinmektedir. Karaciğer kanserinin çoklu ilaç direnci, çok sayıda terapötik ajana direncine katkıda bulunmuştur (5). Daha önceki bir çalışmada Xie ve Zhong (6), HepG2 hücrelerinin hipoksik koşullar altında adriamisin, 5-florourasil ve sisplatine karşı zayıf duyarlılık sergilediğini bildirmiştir. Platin bazlı kemoterapi ajanlarının kanser için başlıca tedavi seçenekleri olmasına rağmen, hastalar arasında bu ilaçlara direnç mevcuttur. Ayrıca karaciğer kanserli hastaların prognozu kötü kalmaktadır (7,8). Bugüne kadar, karaciğer kanserli hastalarda ilaç direncini araştırmak ve ilaç duyarlılığını geliştirmek için kapsamlı çabalar sarf edilmiştir.

Hipoksik koşullar altında, kanser hücrelerinde epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) ve vasküler taklitçiliğe (VM) yol açabilen revaskülarizasyon meydana gelir. EMT ve VM daha sonra istilayı ve uzak metastazı teşvik edebilir. Ayrıca, EMT'nin kanser progresyonu için itici güç olarak rol oynadığı tahmin edilmektedir (9). Ek olarak, hipoksi ile indüklenebilir faktörler (HIF'ler) yeni damar oluşumu, enerji metabolizması, hücresel proliferasyon, istila ve metastazda rol oynar (10).

Lisil oksidaz (LOX)-benzeri 2 (LOXL2) proteini, LOX ailesinin bir üyesidir ve kolajen ve elastinin kovalent çapraz bağlanmasıyla yakından ilişkilidir, bu da fibrozise neden olabilir ve hücre dışı matrisin bütünlüğü için çok önemlidir ( 11). Daha önceki bir çalışmada LOXL2'nin kanser hücrelerinin metastazı ile yakından ilişkili olduğu düşünülmüştü (12). Ayrıca, LOXL2'nin, kötü prognozun değerlendirilmesi için önemli göstergeler olan hücre dışı ve hücre içi yollar yoluyla çok sayıda kötü huylu kanser türünün patogenezini ve ilerlemesini modüle ettiği gösterilmiştir (13,14).Herba Cistanchegeleneksel Çin tıbbında sıklıkla kullanılan, çöl bölgelerinde yaygın olarak bulunan tonik bir bitkidir (15,16).Cistanche tübüloza(C. tubulosa)Sincan Özerk Bölgesi'nde yaygın olarak ekilen doğal bir bitkisel ilaçtır. Herba Cistanche'den (CPhG'ler) elde edilen feniletanoid glikozitler, Herba Cistanche'ın ana aktif bileşenlerinden biri olarak hizmet eder. Daha önce Hu ve arkadaşları (17), CPhG'lerin H22 tümör taşıyan farelerde karaciğer hasarını azaltabileceğini ve kanser hücrelerinin büyümesini engelleyebileceğini belirtmişti. Altta yatan mekanizmanın serum ‑fetoproteinindeki bir azalmayla ilişkili olabileceği ve farelerde bağışıklığı artırabileceği öne sürülmüştür.

Bu çalışmada, HepG2 karaciğer kanseri hücrelerinin hipoksik bir modeli CoCl2 kullanılarak indüklendi. Bu temelde, bu çalışma, hipoksik koşullar altında CPhG'lerin varlığında OXA'nın kanser hücrelerinin çoğalması, apoptoz, göç ve istilası üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçladı. Ayrıca HIF‑1 , LOXL2, E‑cadherin ve Twist'in mRNA ve protein ekspresyon seviyeleri tespit edildi. Ayrıca, CPhG'lerin karaciğer kanseri patogenezi üzerindeki etkilerinin altında yatan kesin mekanizmalar araştırıldı.

cistanche özütünün faydası: karaciğer kanserini tedavi etmek

Malzemeler ve yöntemler

Hücre çizgisi. STR yöntemi kullanılarak tanımlanan karaciğer kanseri hücre dizisi HepG2, Sincan Tıp Üniversitesinin Birinci Bağlı Hastanesi Klinik Araştırma Enstitüsü (Urumqi, Çin) tarafından sağlandı. Hücreler, yüzde 5 CO2 içeren bir inkübatörde 37°C'de yüzde 10 fetal sığır serumu (FBS; Hyclone; Cytiva) içeren yüksek glukozlu DMEM (HyClone; Cytiva) içinde kültürlendi.

Preparation of CPhGs. C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd.. The content of CPhGs was >Ekinakozit ve verbascose içeriğinin sırasıyla yüzde 44.5 ve yüzde 16,1 olduğu yüzde 80. C. tubulosa (Schrenk) Wight'ın gövdeleri Ekim 2016'da Çin'in Sincan kentinden toplanmıştır. Bitki, Dr. Junping Hu tarafından tanımlandı. Tüm bu kupon örnekleri (no. 201610), Sincan, Çin, Xinjiang Tıp Üniversitesi, Eczacılık Okulu Bitki Herbaryumu'nda saklanmıştır.

Deneysel tasarım. HepG2 hücreleri (5x104/ml), çeşitli konsantrasyonlarda CPhG'ler (5, 25, 50, 100, 200 ve 500 µg/ml) ile 48 saat boyunca 37°C'de (tohumlamadan 24 saat sonra) işlendi. CPhGs‑L/M/H dozunu taramak için. HepG2 hücreleri (5x104/ml) aşağıdaki gruplara ayrıldı: i) Yüksek glukozlu DMEM'de kültürlenen kontrol grubu; ii) yüzde 0.1 DMSO (h/h) içinde kültürlenmiş DMSO grubu; iii) 100 uM CoCl2 içeren serumsuz DMEM'de kültürlenen CoCl2 grubu (hipoksi model grubu); iv) OKSA

5 uM OXA (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) içinde kültürlenen grup (pozitif kontrol grubu); v) 100 uM CoCl2 ile birleştirilmiş 5 uM OXA içinde kültürlenen OXA artı CoCl2 grubu; ve vi) 5 µM OXA ve 100 µM CoCl2 ile birleştirilmiş CPhGs‑L/M/H (sırasıyla 25, 50 ve 100 µg/ml) ile muamele edilmiş CPhGs grupları.

Hücre canlılığı tahlili. Hücre canlılığı, üreticinin talimatlarına (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) ve daha önce açıklandığı gibi (18) bir Hücre Sayım Kiti-8 (CCK‑8) testi kullanılarak belirlendi. Hücreler (2.0x103 hücre/kuyu), 96 oyuklu plakalara ekildi. Ardından, tohumlamadan ~24 saat sonra hücreler, her gruptaki tedavi koşullarına göre 48 saat süreyle işleme tabi tutuldu. Ortam daha sonra 100 µl yüksek glikozlu DMEM ile değiştirildi, ardından 10 µl CCK-8 reaktifi eklendi; hücreler 1 saat 37°C'de inkübe edildi. Optik yoğunluk, 450 nm'de çok algılamalı bir mikroplaka okuyucu (Thermo Fisher Scientific, Inc.) kullanılarak ölçüldü. Her koşul için altı kopya hazırlandı.

Apoptotik oranın belirlenmesi. Apoptotik hız, bir Annexin V/PI Apoptotik Tespit Kiti (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) kullanılarak belirlendi. HepG2 hücreleri (5x105) 6 oyuklu plakalara 37°C'de yüzde 5 CO2 içinde aşılandı. Ardından, tedaviden ~24 saat sonra hücreler, 4 saat boyunca serumsuz DMEM'de kültürlendi. Hücreler daha sonra yüzde 0.25 tripsinize (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) kullanılarak sindirildi, ardından önceden soğutulmuş PBS ile en az üç yıkama yapıldı. 4°C'de 5 dakika 167.7 xg'de santrifüj edildikten sonra hücreler 1X bağlama tamponu ile yeniden süspanse edildi ve konsantrasyon 1~5x106/ml'ye ayarlandı ve ardından 15 dakika boyunca 5 µl Annexin V‑FITC ve 5 µl PI ile boyandı oda sıcaklığında. Hücrelere daha sonra bir BD LSRFortessa akış sitometresi (BD Biosciences) ve FlowJo kullanılarak akış sitometrisi uygulandı.

10.6.2 yazılımı (Tree Star, Inc.).

Yara iyileştirme testi. CPhG'lerin hücre göçü üzerindeki inhibitör etkileri, yara iyileştirme deneyi ile incelendi (19). Hücreler, yüzde 100 birleşik tek tabaka elde edilene kadar 6 oyuklu plakalara ekildi. Daha sonra hücreler 200 µl'lik bir pipet ucu kullanılarak yaralanmış, PBS ile yıkanmış ve serumsuz bir ortamda tedavilerle inkübe edilmiştir. İlaç tedavisinden sonra yara iyileşme hızı sırasıyla 0, 12, 24 ve 48 saatte ölçülmüştür. Yara görüntüleri, x10 büyütme altında bir floresan mikroskop (Nikon Ti‑S, Japonya) kullanılarak elde edildi. Yara kapanması, her periyotta yara mesafesi ile ölçüldü ve 0 saatte ilk yara mesafesinin yüzdesi olarak ifade edildi.

Transwell testleri. Hücre istilası Transwell tahlilleri ile değerlendirildi. Hücreler (1x105 hücre/ml), FBS içermeyen 200 µl yüksek glikozlu DMEM içinde süspanse edildi. Hücreler daha sonra bir polietilen tereftalat filtre membranı (gözenek boyutu, 8.0 um) ile kaplanmış Matrigel kaplı üst kuyucuklara ekildi. Alt bölmeye yüzde 10 FBS içeren toplam 500 µl yüksek glikozlu DMEM yerleştirildi. 37°C'de 48 saat sonra filtrenin üst yüzeyindeki hücreleri çıkarmak için pamuklu çubuklar kullanıldı. Membranı istila eden hücreler, 30 dakika boyunca yüzde 4 paraformaldehit ile sabitlendi. Daha sonra hücreler, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yüzde 0.1 kristal menekşe ile boyandı. İstilacı hücreler, x100 büyütmede bir floresan mikroskop (Nikon Ti‑S) altında gözlendi.

Ters transkripsiyon-kantitatif PCR (RT-qPCR). Toplam RNA, TRIzol® reaktifi (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) kullanılarak HepG2 hücrelerinden özümlendi ve üreticinin protokolüne göre PrimeScript RT reaktif kiti (Takara Bio, Inc.) kullanılarak cDNA sentezi yapıldı. qPCR, üreticinin protokolüne göre TB green™ Premix Ex Taq™ (Takara Bio, Inc.) kullanılarak 7500 Real-Time PCR sisteminde (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) gerçekleştirilmiştir. qPCR için kullanılan primerler Tablo I'de listelenmiştir. PCR koşulları, 95˚C'de 30 saniye denatürasyon, ardından 95˚C'de 5 saniye boyunca 40 döngü denatürasyon ve 30 saniye boyunca 60˚C'de tavlamadan oluşmaktadır. Son olarak, amplifikasyon sonuçları 2‑ΔΔCq yöntemi (20) kullanılarak analiz edildi.

Western blot analizi. Proteinler, proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren RIPA lizis tamponu (Thermo Fisher Scientific, Inc.) içinde homojenizasyon yoluyla 48 saat süreyle muamele edilmiş hücrelerden özütlendi. Hücre protein içeriği, BCA yöntemi kullanılarak belirlendi. Proteinler (40 µg) daha sonra yüzde 10'luk bir jel üzerinde SDS‑PAGE ile ayrıldı ve bir PVDF membranına aktarıldı. Zar, 4°C'de 1 saat boyunca yüzde 5 yağsız süt içinde bloke edildi ve aşağıdaki birincil antikorlarla inkübe edildi: ‑aktin (1:5,000; kat. no. bs‑0061R; BIOSS), HIF ‑1 (1:1,000; kat. no. ab179483; Abcam), LOXL2 (1:500; kat. no. ab179810; Abcam), E‑cadherin (1:1,000 ; kat. no. bs‑10009R; BIOSS) ve Twist1 (1:500; kat. no. bs‑2441R; BIOSS) gece boyunca 4˚C'de. Membran daha sonra keçi anti‑tavşan IgG H&L ikincil antikorları (1:2.000; kat. no. ab205718; Abcam) ile oda sıcaklığında 4 saat inkübe edildi. TBS‑0.05 Tween‑20 ile yıkandıktan sonra lekeler, Gelişmiş Kemilüminesans sistemi (Amersham; Cytiva) kullanılarak görselleştirildi. Bantların nispi yoğunluğu, ImageJ2x yazılımı (sürüm 2.1.4.7; Rawak Software Inc.) kullanılarak dansitometrik analizle yarı nicelleştirildi ve sonuçların dansitometrik çizimleri -aktin yoğunluğuna normalleştirildi.

İstatistiksel analiz. Verilerin analizi için SPSS 19.0 yazılımı (SPSS, Inc.) kullanıldı. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulur ve tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'nin post hoc testi ile analiz edilmiştir. P<0.05 was="">istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık gösterdiği kabul edilmiştir. Tüm deneyler en az üç kopya halinde yapıldı.

Sonuçlar

CPhG'lerin hücre canlılığı üzerindeki etkileri. HepG2 hücreleri, 48 saat boyunca (tohumlamadan 24 saat sonra) çeşitli konsantrasyonlarda CPhG'ler (5, 25, 50, 100, 200 ve 500 ug/ml) ile muamele edildi. Şekil 1'de gösterildiği gibi, kontrol grubuna kıyasla 200 ve 500 µg/ml CPhG'lerle tedavi edilen hücrelerin canlılığında önemli bir düşüş vardı (P<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">

CPhG'ler, OXA'nın karaciğer kanseri üzerindeki etkilerini arttırır. CPhG'lerin OXA ile modüle edilmiş HepG2 hücre canlılığı üzerindeki etkileri daha sonra değerlendirildi (Şekil 2). ~48 saat sonra, CPhG'ler ve OXA'nın kombinasyonu, HepG2 hücrelerinin canlılığını OXA plus ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalttı.CoCl2 grubu. Spesifik olarak, CPhGs‑M artı OXA artı CoCl2 ve CPhGs‑H artı OXA artı CoCl2, OXA artı CoCl2 grubuna kıyasla HepG2 hücrelerinin canlılığını önemli ölçüde inhibe etti (P<0.05 and=""><0.01,>

CPhG'ler, karaciğer kanseri hücrelerinin göçünü ve istilasını engeller. CPhG'ler ve OXA ile tedaviyi takiben karaciğer kanseri hücrelerinin istilacı potansiyelini ve göç kabiliyetini daha fazla incelemek için yara iyileştirme ve Transwell testleri yapıldı. Yara iyileştirme testi, DMSO grubuna kıyasla HepG2 hücrelerinin migrasyonunun CoCl2, OXA ve CPhG'ler (200 veya 500 µg/ml) ile tedaviyi takiben azaldığını gösterdi (P<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co-treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="">

CPhG'ler ve OXA'nın apoptoz üzerindeki etkileri. CPhG'ler ve OXA kombinasyonu ile tedaviyi takiben

48 saat sonra HepG2 hücreleri Annexin V‑FITC ve PI ile boyandı, ardından hücresel apoptozu belirlemek için akış sitometrisi yapıldı. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, birlikte tedavi grupları (CPhGs‑L/M/H artı OXA artı CoCl2), CPhGs konsantrasyonundaki artışla birlikte apoptotik hücre oranında kademeli bir yükselme sergilemiştir. CPhG'ler ve OXA ile tedavi edilen hücrelerin çoğu, CPhG'ler ve OXA kombinasyonunun erken aşamada apoptozu indüklediğini gösteren Q4 bölgesinde lokalizeydi. OXA artı CoCl2 grubuyla karşılaştırıldığında, OXA, CoCl2 ve orta veya yüksek dozlarda CPhG'ler (P) ile tedavi edilen gruplarda hücrelerin apoptotik hızında önemli bir artış tespit edildi.<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">

mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist following CPhGs and OXA co‑incubation. There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist between the control and DMSO groups (P>0.05; Şekil 5A‑D). Tersine, CoCl2, DMSO'dakilere kıyasla LOXL2, HIF‑1 ve Twist'in mRNA ekspresyon seviyelerinde önemli bir artışa neden oldu.grup (P<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">

CPhG'ler ve OXA birlikte inkübasyonunun ardından HIF‑1 , LOXL2, E‑cadherin ve Twist'in protein ekspresyon seviyeleri. Western blotlamanın sonuçları, HIF‑1 , LOXL2 ve Twist'in protein ekspresyon seviyelerinin, DMSO grubundakilerle karşılaştırıldığında hipoksik koşullar altında yukarı doğru düzenlendiğini ortaya koydu. Buna karşılık,

E‑kadherinin protein ekspresyon seviyeleri, hipoksik koşullar altında aşağı regüle edildi (P<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" dmso="" group,="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2="" and="" twist="" induced="" by="">

Tartışma

Hipoksi, kanser mikroçevresinde yaygın bir özelliktir; Bu, esas olarak, yaygınlaşmasının gerçeği ile ilişkilidir.kanser hücreleri, anormal neodamarların vasküler oluşumu ile karşılaştırıldığında daha hızlıdır. Ayrıca proliferasyon, metastaz ve ilaç duyarlılığı gibi diğer biyolojik süreçler hipoksiden etkilenir (21). Tümör hipoksik mikroçevre, kanserin patogenezi ve ilerlemesi için çok önemlidir ve ayrıca karaciğer kanserinin ilaç direnci ve vaskülarizasyonunda önemlidir (22).

Bu çalışmada, HepG2 hücreleri, aralarında CPhG'lerin (200 ug/ml) önemli ölçüde hücre canlılığında bir azalmaya neden olabileceği çeşitli CPhG konsantrasyonları ile tedavi edildi. Özellikle, CPhG'ler hücresel canlılığı doza bağlı bir şekilde modüle edebilir. Hipoksik koşullar altında, OXA ve CPhG'lerin (50 veya 100 ug/ml) kombinasyonu, tek başına OXA tedavisine kıyasla HepG2 hücrelerinin canlılığını önemli ölçüde inhibe etti. Karaciğer kanseri hücrelerinin migrasyon ve invazyon analizlerinde de doza bağımlı benzer bir eğilim gözlendi. Şu anda, karaciğer hastalığının patogenezinde kanser hücresi apoptozunun rollerini araştırmak için kapsamlı çalışmalar yapılmıştır (23‑26). Apoptozu teşvik ederek karaciğer kanserini tedavi etmek için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir (27‑29); bu nedenle, müdahale

HepG2 hücre apoptozu, karaciğer kanserinin önlenmesi ve tedavisi için umut verici bir aday olarak hizmet edebilir. HepG2 hücrelerinin apoptozu, CPhGs‑M/‑H ve OXA kombinasyonu ile tedaviyi takiben, tek başına OXA ile tedavi edilen hücrelere kıyasla önemli ölçüde arttı. Bu nedenle, CPhG'lerin OXA'nın anti-tümör etkilerini önemli ölçüde artırabileceği belirtildi.

HIF‑1, E‑cadherin, N‑cadherin ve Vimentin'in ekspresyon seviyelerinin yanı sıra Snail1/2, Zeb1 ve Twist1 gibi bazı transkripsiyon faktörlerini yukarı doğru düzenleyebilir. Daha sonra bu, hücresel polarite kaybına, hücre-hücre bağlantılarının gevşemesine, hücre iskeleti proteininde değişikliklere ve kanser hücrelerinin baziler membran yoluyla dolaşım sistemine translokasyonuna neden olabilecek kanser hücrelerinin göçü ve istilasına yol açabilir. ve ardından metastaz (30). Bu çalışmada, CoCl2, HepG2 hücrelerinin canlılığının yanı sıra hücre göçü ve istilasında bir artışı tetikleyen bir hipoksi modelini indüklemek için kullanıldı. Ayrıca, HIF‑1'in mRNA ve protein ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde arttı, bu da CoCl2'nin bir

hipoksik mikro çevre. CPhG'ler ve OXA kombinasyonu ile tedavi, hipoksi tarafından indüklenen HIF‑1'in mRNA ve protein ekspresyon seviyelerini belirgin şekilde inhibe etti. Bu bulgular, CPhG'lerin karaciğer kanseri mikroçevresini doza bağlı bir şekilde zayıflatabileceğini ileri sürdü.

E‑cadherin, hücre-hücre adezyonunda, doku yapısının bütünlüğünün korunmasında ve sinyal iletiminde anahtar rolü olan Ca2 plus'a bağlı bir adezyon molekülüdür. Aşağı regülasyon veya hatta adezyon fonksiyonunun kaybı durumlarında, kanser hücreleri, kanser hücrelerinin artan istilasını ve ardından metastazı teşvik edebilen kontrolsüz çoğalma ve farklılaşma sergileyebilir (31). Ek olarak, E‑cadherin, çoklu epitelyal malignitelerin farklılaşması, istilası, metastazı ve prognozu ile yakından ilişkili olan kanser hücrelerinin EMT'sini inhibe etmek için çok önemlidir. Twist, Snail ve Zeb gibi EMT'yi indükleyen transkripsiyon faktörleri (EMT-TF'ler), EMT için çok önemlidir. Hipoksinin, EMT‑TF ifadesini indükleyen sinyal yollarını aktive ettiği rapor edilmiştir; özellikle, bu faktörlerin transkripsiyonel aktivasyonu yoluyla EMT'yi doğrudan teşvik edebilir (32). Büküm, yüksek oranda korunmuş bir sarmal-halka-sarmaldır

son yıllarda yeni tanımlanan transkripsiyon faktörü. Yüksek Büküm ekspresyonu, çok sayıda kanser hücre tipinde tespit edilmiştir (33). Bu nedenle, Twist ekspresyonu ile kanser hücrelerinin göçü veya metastazı arasındaki ilişkinin yanı sıra metastazın klinik olarak önlenmesi ve tedavisi arasındaki ilişkiyi araştırmak önemlidir (34). Bu çalışmada, hipoksi varlığında E‑cadherinin mRNA ve protein ekspresyon seviyelerinin aşağı regüle olduğu, buna karşın Twist'in mRNA ve protein ekspresyon seviyelerinin yükseldiği ortaya çıktı. Bu bulgular, hipoksinin EMT oluşumuna katkıda bulunabileceğini ima eden istila ve göç deneylerinin sonuçlarıyla tutarlıydı. OXA ile tedaviyi takiben, E‑kadherinin protein ekspresyon seviyeleri aşağı regüle edildi; bu, OXA'nın karaciğer kanseri hücrelerinin büyümesini inhibe etmede zayıf verimlilik sergilediğini, oysa EMT'yi destekleyebileceğini gösterdi. Bununla birlikte, CPhG'ler ile kombinasyon halinde, HepG2 hücrelerinin OXA'ya duyarlılığı, hipoksi varlığında belirgin bir gelişme gösterdi. Ayrıca, CPhG'ler ve OXA ile birlikte tedavi, hücresel canlılığı, göçü ve HepG2 hücrelerinin istilasını önleyebilir. Mevcut çalışma sadece tespit edildi

Twist ve E‑cadherin ifadesi; bu nedenle, gelecekteki çalışmalar, CPhG'lerin karaciğer kanserinde hipoksi ile indüklenen EMT üzerindeki inhibitör etkisini değerlendirmek için EMT ile ilgili daha fazla belirteç üzerinde odaklanmayı amaçlamaktadır.

HIF‑1'in LOXL2 ekspresyonunu desteklediği ve karaciğer kanserinin kötü prognozu ile yakından ilişkili olabilecek karaciğer kanseri hücrelerinin göçünü ve istilasını arttırdığı bildirilmiştir (30). Önceki bir çalışmada, komşu karaciğer kanseri dokularındaki LOXL2 ekspresyon seviyeleri, kanser dokularındakilerle karşılaştırıldığında belirgin şekilde arttı (35). Ayrıca karaciğer kanserinin invazyonu ve metastazı ile yakından ilişkiliydi. Küçük enterferans yapan RNA tarafından LOXL2 gen susturulması, HepG2 ve SMCC‑7721 hücrelerinin proliferasyonunu inhibe etti, bu da kanser hücrelerinin hücre döngüsü durmasına ve apoptozun artmasına neden oldu (36). Shao ve arkadaşları (35), karaciğer kanseri örneklerinde LOXL2 ile tedavi için ameliyat edilen 201 vaka arasında klinikopatolojik faktörler, VM ve prognoz arasındaki ilişkiyi araştırdı. LOXL2'nin, ilaç geliştirme için bir hedef olarak hizmet edebilecek karaciğer kanserinin patogenezinde ve ilerlemesinde önemli roller üstlendiği varsayılmıştır. Ayrıca, Peng ve arkadaşları (37) LOXL2'nin, mide kanseri hücrelerinin EMT'sinin patogenezine ve ilerlemesine katkıda bulunabilecek Salyangoz/E‑kadherin ve Src kinaz/Odak yapışma kinaz sinyal yollarını aktive edebileceğini göstermiştir. Bu çalışmada, hipoksik koşullar altında, LOXL2'nin mRNA ve protein ekspresyon seviyeleri artarken, OXA ile tedaviyi takiben ekspresyonu aşağı regüle edildi. Ayrıca, CPhG'ler ve OXA'nın bir kombinasyonu ile tedavi, OXA'nın karaciğer kanseri üzerindeki antitümör etkilerine etkili bir şekilde yardımcı olabilecek LOXL2 ekspresyonunun bariz bir şekilde aşağı regülasyonu ile sonuçlandı.

Mevcut çalışmanın bazı sınırlamaları vardır. Bu çalışmada, SMCC‑7721 hücre dizisi de dahil olmak üzere iki karaciğer kanseri hücre dizisi daha kullanılmış olmalıydı, ancak bunlar, yanlış tanımlandıkları ve HeLa hücrelerinden türetildikleri için bu hücre dizilerini satın almak mümkün olmadığı için kullanılamadı. Ek olarak, bu çalışma hücrelerdeki farklı CPhG konsantrasyonlarının antioksidan etkilerini analiz etmedi.

Sonuç olarak, CPhG'ler, HIF‑1 sinyal yolunu modüle ederek karaciğer kanseri hücrelerinin hipoksik tümör mikro-ortamını değiştirebilir. Ek olarak, karaciğer kanseri hücrelerinin OXA'ya duyarlılığı, CPhG'ler ve OXA'nın bir kombinasyonu ile tedaviye yanıt olarak önemli ölçüde yükselmiştir. Bu bulgular, karaciğer kanserinin kemoterapiye duyarlılığını artırmak için yeni bir tedavi stratejisi sağlayabilir.

Teşekkür

Uygulanamaz.

Finansman

Mevcut çalışma, Sincan Uygur Özerk Bölgesi'ndeki Bilimsel ve Teknolojik Yenilik Lideri için Yedek Aday Projesi (hibe no. 2019XS14), Xinjiang Doğal İlaç Aktif Bileşenleri ve İlaç Salınım Teknolojisi Ana Laboratuvarı (hibe no. XJDX1713) tarafından desteklenmiştir. Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe no. 81860735) ve Bethune Hayır Kurumu

'Bethune·Quest-eczacılıkla ilgili bilimsel araştırma kapasitesinin oluşturulması' Vakfı (hibe no. B‑19‑H‑20200622).

Veri ve materyallerin mevcudiyeti

Mevcut çalışma sırasında kullanılan ve/veya analiz edilen veri setleri, makul talep üzerine ilgili yazardan temin edilebilir.

Yazar katkıları

LMW ve JWZ deneyleri gerçekleştirdi, makalenin taslağını hazırladı ve tüm ham verilerin gerçekliğini doğruladı. JPH ve JHY bu çalışmayı tasarladı. Tüm yazarlar son makaleyi okudu ve onayladı.

Etik onay ve katılım onayı

Uygulanamaz.

Yayın için hasta onayı

Uygulanamaz.

rekabet eden çıkarlar

Yazarlar, rekabet eden çıkarları olmadığını beyan eder.

Referanslar

1. Hepatoselüler karsinom. Nat Rev Dis Primer 2: 16019, 2016.

2. Gingold JA, Zhu D, Lee DF, Kaseb A ve Chen J: Primer karaciğer kanserlerinde genomik profil oluşturma ve metabolik homeostaz. Trendler Mol Med 24: 395-411, 2018.

3. McGuire S: 2014 Dünya Kanser Raporu. Cenevre, İsviçre: Dünya Sağlık Örgütü, Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı, WHO Press, 2015. Adv Nutr 7: 418-419, 2016.

4. Gholamreza K, Jadidi‑Niaragh F, Jahromi AS, Zandi K ve Hojjat‑Farsangi M: Mevcut hedefe yönelik tedavi ajanlarına karşı tümör hücresi direnci mekanizmaları. Tümör Biol 37: 10021-10039, 2016.

5. Dong X ve Mumper RJ: Çoklu ilaca dirençli tümörleri tedavi etmek için nanomedikal stratejiler: Mevcut ilerleme. Nanotıp (Londra) 5: 597-615, 2010.

6. Xie Y ve Zhong DW: AEG‑1, PI3K/AKT/HIF‑1alfa/MDR‑1 yolunu düzenleyerek hipoksi ile indüklenen hepatoselüler karsinom kemo direnci ile ilişkilidir. HARİÇ J 15: 745-757, 2016.

7. Xiong H, Ni Z, He J, Jiang S, Li X, He J, Gong W, Zheng L, Chen S, Li B, ve diğerleri: LncRNA HULC, Sirt1'i stabilize ederek otofajiyi tetikler ve HCC hücrelerinin kemosensitivitesini azaltır. Onkogen 36: 3528‑3540, 2017.

8. Gade TPF, Tucker E, Nakazawa MS, Hunt SJ, Wong W, Krock B, Weber CN, Nadolski GJ, Clark TWI, Soulen MC, ve diğerleri: İskemi, hepatosellüler karsinomda durgunluk ve otofaji bağımlılığını indükler. Radyoloji 283: 702-710, 2017.

9. Siegel RL, Miller KD ve Jemal A: Kanser istatistikleri, 2017. CA Cancer J Clin 67: 7-30, 2017.

10. Dong LQ, Shen BQ ve Ma Y: Hepatosellüler karsinomda hipoksi mikroçevresinin araştırma ilerlemesi. Zhong Guo Pu Wai Ji Chu Yu Lin Chuang Za Zhi 25: 1254-1258, 2018 (Çince).

11. Moon HJ, Finney J, Ronnebaum T ve Mure M: İnsan lisil oksidaz benzeri 2. Bioorg Chem 57: 231-241, 2014.

12. Ferreira S, Saraiva N, Rijo P ve Fernandes AS: LOXL2 inhibitörleri ve meme kanseri ilerlemesi. Antioksidanlar (Basel) 10: 312, 2021.

13. Philp CJ, Siebeke I, Clements D, Miller S, Habgood A, John AE, Navaratnam V, Hubbard RB, Jenkins G ve Johnson SR: Hücre dışı matris çapraz bağlama, fibroblast büyümesini artırır ve akciğer fibrozunda matris proteolizine karşı koruma sağlar. Am J Respir Cell Mol Biol 58: 594-603, 2018.

14. Galván JA, Zlobec I, Wartenberg M, Lugli A, Gloor B, Perren A ve Karamitopoulou E: E‑cadherin baskılayıcılarının SNAIL, ZEB1 ve ZEB2'nin tümör ve stromal hücreler tarafından ifadesi tümör tomurcuklanan fenotipi etkiler ve stromal heterojeniteyi önerir pankreas kanserindeki hücreler. Br J Kanser 112: 1944-1950, 2015.

15. Gu C, Yang X ve Huang L: Cistanches herba: Bir nörofarmakoloji incelemesi. Ön Pharmacol 7: 289, 2016.

16. Fu Z, Fan X, Wang X ve Gao X: Cistanches Herba: Kimyası, farmakolojisi ve farmakokinetik özelliklerine genel bir bakış. J Ethnopharmacol 219: 233‑247, 2018.

17. Hu Q, You SP, Liu T, Wang B, Liu X ve Jiang Y: Cistanche'nin karaciğer kanseri karşıtı etkisi üzerine bir araştırma. Carcinog Teratog Mutajen 30: 194‑199, 2018.

18. Mao J, Tian Y, Wang C, Jiang K, Li R, Yao Y, Zhang R, Sun D, ​​Liang R, Gao Z, ve diğerleri: CBX2, hepatosellüler karsinomda YAP'ın fosforilasyonu yoluyla proliferasyonu ve apoptozu düzenler. J Kanser 10: 2706-2719, 2019.

19. Qin Y, Liu HJ, Li M, Zhai DH, Tang YH, Yang L, Qiao KL, Yang JH, Zhong WL, Zhang Q, ve diğerleri: Salidroside, hipoksik tümör mikro-ortamını iyileştirir ve platin ilaçlarının ilaç direncini tersine çevirir. HIF‑1 sinyal yolu. EBioMedicine 38: 25‑36, 2018.

20. Livak KJ ve Schmittgen TD: Gerçek zamanlı kantitatif PCR ve 2(‑Delta Delta C(T)) yöntemi kullanılarak bağıl gen ekspresyonu verilerinin analizi. Yöntem 25: 402-408, 2001.

21. Vaupel P: Tümör mikroçevresel fizyolojisi ve radyasyon onkolojisi üzerindeki etkileri. Semin Radiat Oncol 14: 198-206, 2004.

22. Chen C ve Lou T: Hepatosellüler karsinomda hipoksi ile indüklenebilir faktörler. Oncotarget 8: 46691-46703, 2017.

23. Schwabe RF ve Luedde T: Karaciğerde apoptoz ve nekroptoz: Bir ölüm kalım meselesi. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 15: 738-752, 2018.

24. Kanda T, Matsuoka S, Yamazaki M, Shibata T, Nirei K, Takahashi H, Kaneko T, Fujisawa M, Higuchi T, Nakamura H, ve diğerleri: Apoptoz ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalıkları. Dünya J Gastroenterol 24: 2661-2672, 2018.

25. Pittala S, Kremlin Y ve Shoshan‑Barmatz V: Mitokondriyal VDAC1 bazlı Peptid ile farelerde karaciğer kanseri ve ilişkili patolojileri hedefleme. Neoplazi 20: 594-609, 2018.

26. Jing ZT, Liu W, Xue CR, Wu SX, Chen WN, Lin XJ ve Lin X: AKT aktivatörü SC79, hepatositleri TNF aracılı apoptozdan korur ve d-Gal/LPS'nin neden olduğu karaciğer hasarını hafifletir. Am J Physiol Gastrointest Karaciğer Physiol 316: G387‑G396, 2019.