ABSTRACT

Arka plan:Heliciopsis terminallerinin gövdesinin (Proteaceae) ana bileşeni olarak bir bis resorsinol izole edildi. Son zamanlarda resorsinol, çeşitli kozmetik ürünlerinde aktif bir beyazlatıcı madde olarak uygulanmaktadır. Resorsinolün yapısal taklidi nedeniyle, bu çalışmada bir yaşlanma enzimi antagonisti olarak bis rezorsinolün faydaları gösterilmiştir.

İlgili araştırmalara göre cistanche, "ömrü uzatan mucizevi bitki" olarak bilinen yaygın bir bitkidir. Ana bileşeni, antioksidan, antienflamatuar ve bağışıklık fonksiyonunun teşviki gibi çeşitli etkilere sahip olan kistanosiddir. Cistanche ve cilt beyazlatma arasındaki mekanizma, cistanche glikozitlerinin antioksidan etkisinde yatmaktadır. İnsan derisindeki melanin, tirozinaz tarafından katalize edilen tirozinin oksidasyonu ile üretilir ve oksidasyon reaksiyonu oksijenin katılımını gerektirir, bu nedenle vücuttaki oksijensiz radikaller melanin üretimini etkileyen önemli bir faktör haline gelir. Cistanche, bir antioksidan olan ve vücuttaki serbest radikallerin oluşumunu azaltabilen ve böylece melanin üretimini engelleyen cistanoside içerir.

Beyazlatmak için Cistanche Tubulosa'ya tıklayın

Daha fazla bilgi için:

david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501

Yöntemler:Bis resorsinol, sırasıyla solvent ekstraksiyonu ve hazırlayıcı kromatografi ile H. terminallerinin gövdesinin ham etanolik ekstraktından saflaştırıldı. Bileşiğin kollajenaz, elastaz ve tirozinaz üzerindeki inhibitör aktivitesi, farklı bir spektroskopik teknik kullanılarak araştırıldı. Maddenin enzim aktif bölgeleri etrafındaki olası etkileşimlerini tahmin etmek için moleküler yerleştirme gerçekleştirildi.

Sonuçlar:Bis resorsinol ve kafeik asidin kolajenazındaki IC50 değerleri, sırasıyla 156.7 ± 0.7 ve 308.9 ± 1.6 µmol L-1 idi. Elastaz aktivitesi için, bis resorsinol ve ursolik asit için sırasıyla 33.2 ± 0.5 ve 34.3 ± 0.3 µmol L-1 IC50 belirlendi. Bis rezorsinol, 22.8 umol L-1'lik IC50 sergileyerek tirozinazı inhibe etti ve -arbutin için 78.4 umol L-1 mevcuttu. Bis rezorsinol, -5.89, -5.69 ve -6.57 kcal mol-1'lik ilgili bağlanma enerjileriyle kollajenaz, elastaz ve tirozinaza bağlanır. Bu bağlanma enerjileri, test edilen inhibitörlerle aynı aralıklardaydı. Yapısında bulunan aromatik fenol grupları enzimlerle bağlanma etkileşimlerini desteklemekle birlikte prensipten de sorumluydu. Hidroksil gruplarından kaynaklanan hidrojen bağlanması ve aromatik halka(lar)dan gelen π ile ilgili çekici kuvvetler, bis resorsinole bağlanma çok yönlülüğü sağlamıştır.

Çözüm:H. terminallerinden saflaştırılan bis resorsinol, yaşlanma enzimi antagonisti olarak kozmetik ürünlere dahil edilmek üzere yararlı olabilir.

konular Biyokimya, Biyoinformatik, Hücre Biyolojisi, Dermatoloji, Veri Madenciliği ve Makine Öğrenimi

anahtar kelimelerHeliciopsis terminalleri, Bisresorsinol, Kollajenaz, Elastaz, Tirozinaz, Yaşlanma karşıtı özellik, Moleküler yerleştirme, Enzim inhibisyonu

GİRİİŞ

A bis resorsinol, (8'Z)-3,5-dihidroksi-1-[16'-(3", 5"-dihidroksi fenil)-8'-heksadesen{{ 11}}′-yl] benzen, Proteaceae familyasına ait bir bitki olan Heliciopsis terminals (Kurz) Sleumer'in gövdesinden bol miktarda izole edilmiş ve Vietnam'da etnik halk tarafından hepatoprotektif etki için kullanılmıştır. Bugüne kadar, bu bileşiğin anti-enflamasyon, malondialdehit (MDA) üretiminin inhibisyonu ve hepatoproteksiyon için tıbbi faydaları in vitro ve in vivo olarak açıklığa kavuşturuldu (Giang ve diğerleri, 2{28}}19). Bir bis rezorsinol molekülünün, meta-C7H14C=CC7H14 bağlantısı (Şekil 1A) ile birbirine bağlanmış iki resorsinol molekülü (EC No 203-585-2) içerdiği açıktır. Resorsinol son zamanlarda beyaz terapi için bir yüz konsantre serum formunda uygulanmaktadır. Tüketici Güvenliği Bilimsel Komitesi, Brüksel, Belçika'ya (SCCS 1270/09, Avrupa Komisyonu, Tüketici Güvenliği Bilimsel Komitesi, 2010) göre rezorsinol, yüzde 1,25'e varan konsantrasyon aralıklarında kirpikleri renklendirmeye yönelik ürünlerde bir oksidan olarak düzenlenmiştir. ya da saç losyonlarında ve şampuanlarda yüzde 0,5'e varan konsantrasyon aralıklarında. Resorsinolün kozmetik uygulamaları bu nedenle çeşitlidir. Beyazlatıcı ajanlar için, epidermisin bazal hücre tabakasında bulunan melanositler tarafından melanin sentezinin inhibisyonu varsayılmıştır. Tirosinaz (EC 1.14.18.1), substrat olarak L-tirozinin kullanıldığı melanojenezi katalize etmek için anahtar bir enzimdir. Melanin cildi UV ışınlarından korumaya yardımcı olsa da, aşırı melanin üretimi hiperpigmentasyona, çillere ve yaşlılık lekelerine neden olabilir. Resorsinole ek olarak, farklı kimyasal yapılara sahip çeşitli sentetik ve doğal bileşiklerin anti-tirozinaz aktivite gösterdiği gösterilmiştir (Dobos ve diğerleri, 2015).

UV radyasyonu cilt yaşlanmasına neden olan önemli bir dış faktördür. Bunun yerine deriler, UV'ye maruz kaldıktan sonra dahili olarak üretilen reaktif oksijen türleri (ROS) ve lipid peroksitler tarafından zamanla yaşlanabilir. Lipit peroksit metabolizmalarından kaynaklanan ikincil ürünler, hücre dışı matrislerin (ECM'ler) elastin ve kollajen liflerine zarar verebilir. Bu nedenle, UV ışınlarına maruz kalmak ciltte su kaybına, elastikiyet kaybına ve ayrıca kırışıklıklara neden olabilir. Bildiğimiz kadarıyla, ECM'ler normal doku yapılarını korumak için periyodik olarak yeniden modellenir ve buna eşlik eden süresi dolmuş doku proteinleri, kollajenazlar gibi matris metaloproteinazlar ve elastazlar gibi serin proteazlar tarafından uygun şekilde parçalanır (Thring, Hili & Naughton, 2009). Ek olarak, yaşlanan enzimlerin hem miktarları hem de aktiviteleri oksidatif stres ile artmış, bu da kapsamlı ECM bozulmasına ve ilerleyici yaşlanmaya yol açmıştır (Sherratt ve diğerleri, 2019). Bu nedenle, metal iyonları ile kompleks oluşturabilen bileşiklerin buna bağlı olarak kollajenaz, elastaz ve tirozinaz inhibitörü olması beklenmektedir (Selvaraj ve diğerleri, 2014). Bis resorsinolün tirozinaz, kollajenaz ve elastaz üzerindeki biyolojik etkilerini in vitro olarak belirlemeyi amaçlayan bu projede moleküler düzeyde etkileşimlerini netleştirmek için bir yerleştirme tekniği gerçekleştirilmiştir. Bis resorsinol ile yaşlanma sürecini geciktirmek ve cilt görünümünü iyileştirmek umut vericidir.

MATERYAL & METOD

Kimyasallar ve aletler

Bileşik saflaştırma, tanımlama ve onaylama

H. terminallerinin gövdesinin etanolündeki ham ekstrakt, HNIP-18473 numaralı belge numunesi ile Vietnam Ulusal Üniversitesi, Hanoi, Vietnam Kimya Fakültesi'nden Profesör PM Giang'dan cömertçe elde edildi. Daha sonra metanol/n-heksan içinde üç kez tekrarlanarak paylaştırıldı. Metanol tabakası, neredeyse kuruyana kadar buharlaştırıldı ve ardından etil asetat/1-bütan içinde paylaştırıldı. Etil asetat tabakası, hacmi yüzde 80 azalana kadar buharlaştırıldı. Nihai viskoz sıvı daha sonra aşağıdaki gibi kloroform/metanol gradyan elüsyonu kullanılarak bir silis jel kolonu üzerinde saflaştırıldı: yüzde 100 kloroform, 30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 3 :2 ve sırasıyla 2:1 kloroform/metanol ve yüzde 100 metanol. 5:1 karıştırılmış solventten gelen elüsyon toplandı ve hacmin dörtte birine buharlaştırıldı, ardından metanol ve asetondan oluşan bir gradyan elüsyonu kullanılarak ODS kolonu üzerinde ayrıldı. Arzu edilen bileşik, yani bis resorsinol (Şekil 1), yüzde 70 aseton içeren elüentlerden elde edildi ve alet kitaplığı verilerine ilişkin MS, NMR ve IR spektroskopileri ile doğrulandı. Saflığının tahmini için ince tabaka kromatografisi kullanıldı.

Biyolojik aktivite deneyleri

İn vitro, bis rezorsinol ve bilinen inhibitörler için kollajenaz, elastaz ve tirozinaz üzerinde enzim inhibe edici deneylerden oluşan deneyler aşağıdaki gibi gerçekleştirildi.

kollajenaz inhibisyonu

En son anti-kollajenaz tahlili, daha önce Widyowati ve diğerleri tarafından açıklanandan değiştirildi. (2016). Kısaca, tamponlama seyreltici olarak 400 mmol L-1 NaCl ve 10 mmol L-1 CaCl2 ile desteklenmiş 50 mmol L-1 trisin tamponu pH 7.5 kullanıldı. Clostridium histolyticum'dan (EC.3.4.24.3) kollajenaz, tamponda 1 mg L-1 konsantrasyonuna kadar çözüldü. Enzim-substrat, MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala-Arg-NH2, önceden DMSO içinde çözülmüş ve ardından tampon içinde 1 mmol L-1 konsantrasyonuna seyreltilmiştir. DMSO içinde çözülmüş bir numune, tampon kullanılarak farklı konsantrasyonlara seyreltildi. Bir 2-ul numune solüsyonu, 100 µl enzim solüsyonu ile 37 ○C'de 10 dakika inkübe edildi. Ardından, bir 50-µl substrat eklendi ve iyice karıştırıldı. 405 nm'de floresan emisyonu (F) hemen kaydedildi ve uyarma için 320 nm'lik bir dalga boyu kullanılarak 30 dakika boyunca sürekli olarak izlendi. Pozisyon kontrolü olarak kafeik asit kullanıldı (Şekil 1). Su ile negatif kontrol yapıldı. Yüzde inhibisyon (yüzde) aşağıdaki denklemden hesaplandı:

yüzde İnhibisyon {{0}}{1 - (Fsam; 30 - Fsam; 0)÷(Fcont; 30 - Fcont; 0)} ×100.

Elastaz inhibisyonu

Abhijit & Manjushree'ye (2010) göre tahlil, bazı değişikliklerle uygulandı. Kısaca, tampon sistemi 0.2 mM Tris-HCl tamponuydu (pH 8.0). 1 µg mL-1 domuz pankreatik elastaz (EC.3.4.21.36) solüsyonu steril su içinde hazırlandı. Enzim substratı, N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (SANA), tamponda 80 mmol L-1 konsantrasyonuna kadar çözüldü. DMSO içinde çözülmüş bir numune, tampon kullanılarak çeşitli konsantrasyonlara seyreltildi. Bir 100-ul numune solüsyonu, 50 µl enzim solüsyonu ile karıştırıldı ve 15 dakika inkübe edildi. Daha sonra 50 µl enzim-substrat solüsyonu eklendi ve iyice karıştırıldı. OD410 hemen (0 dakika) ve inkübasyondan sonra gece boyunca (o/n) 37 derecede bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. Pozitif kontrol olarak ursolik asit kullanıldı (Şekil 1), negatif kontrol olarak su kullanıldı. Yüzde inhibisyon (yüzde), aşağıdaki denklemle hesaplandı:

yüzde İnhibisyon {{0}} {1 - [(Asam; o/n - Asam; 0)÷(Acont; o/n - Acont; 0)]} ×100:

tirozinaz inhibisyonu

Kullanılan tirozinaz inhibitör tahlili, daha önce açıklanan yöntemden uyarlanmıştır (Jiratchayamaethasakul ve diğerleri, 2020). Kısaca, tahlil 0,05 mol L−1 fosfat tamponu pH 6,8'de gerçekleştirildi. Mantar tirozinazı (EC.1.14.18.1), tampon içinde 100 birim mL-1 konsantrasyonuna kadar çözüldü. Bir enzim substratı olan L-tirozin, tamponda 0.25 mg mL-1'lik bir konsantrasyona hazırlandı. DMSO içinde çözülmüş bir test bileşiği, 0.625 ile 10 mg mL-1 arasında değişen konsantrasyonlara seyreltildi. 96-Kuyu plakalarından oluşan bir kuyuya, 10 µl numune ve 40 µl L-tirozin solüsyonu karıştırıldı ve 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. Daha sonra 50 µl enzim solüsyonu inoküle edildi ve iyice karıştırıldı. Reaksiyon daha sonra buz üzerinde 1 dakika inkübasyonla durduruldu. OD475, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. -Arbutin ve su sırasıyla pozitif kontrol (Şekil 1) ve negatif muadili olarak kullanıldı. Yüzde inhibisyon (yüzde), aşağıdaki denklemle hesaplandı:

MOLEKÜLER YERLEŞTİRME ÇALIŞMASI

Ligandların ve reseptörlerin hazırlanması

Bis rezorsinolün (CID 8917124) üç boyutlu (3D) yapıları ve substratlar ve inhibitörler dahil olmak üzere referans bileşikler, moleküler yerleştirme çalışması için PubChem veri tabanından indirildi. Online SMILES Translator ve Structure File Generator kullanılarak bir Protein Veri Bankası (PDB) format dosyasında bir ligand yapısı hazırlandı. Kolajenaz (PDB ID 2Y6I), elastaz (PDB ID 1BRU) ve tirozinaz (PDB ID 2Y9X) gibi enzimlerin kristal yapıları, RCSB protein veri tabanından elde edildi. Su ve bağlı moleküller, seçilen tüm protein yapılarından parçalara ayrıldı. Bu arada, AutoDockTools 1.5.6 ile kristalize protein yapılarına polar hidrojen atomları eklendi. Moleküler yerleştirme gerçekleştirilmeden önce hedef proteinlerin ve diğer kullanılan bileşiklerin dosyaları PDBQT formatında kaydedildi.

Aktif bölge kalıntılarının seçimi ve moleküler yerleştirme

Aktif site tahminlerinin grid ve docking protokolleri AutoDockTools 1.5.6 kullanılarak hazırlandı. Izgara siteleri, 0.375 Å aralıkla ayarlandı. Xyz boyutları kollajenaz için 126-135-160 Å3, elastaz için 130-120-126 Å3 ve tirozinaz için 80-80-80 Å3 olarak ayarlanmıştır. Izgara kutusu merkezleri (AutoDockTools'ta ofset değerleri ile) kollajenaz için 31.869 (5.{16}}), -19.41 (−25.{{20}}) ve 17.815 idi. , 30,048 (-0,972), 51,253 (-2,722), 17,6 elastaz için ve -8,407 (-1,000), -23,795 (-0,250), -36,019 (-3,500) ) sırasıyla tirozinaz için. Ligand bileşiği esnek bir molekül olarak ayarlanırken, protein yapısı sert bir varlık olarak kullanıldı. Yerleştirme çalışması, AutoDock4 sürüm 4.2 tarafından uygulanan Lamarckian genetik algoritması (GA) kullanılarak gerçekleştirildi. GA çalıştırmalarının sayısı 50 idi ve popüler boyutu 200'dü. Bağlanma enerjisi (ΔGbind) ADT ile analiz edildi. Etkileşim(ler), BIOVIA Discovery Studio (BIOVIA, 2020) kullanılarak görselleştirildi. Bileşik ve bir protein reseptörü arasındaki moleküler etkileşim, BIOVIA Discovery Studio yazılımı (BIOVIA, 2020) kullanılarak analiz edildi ve görselleştirildi. Protein bağlama bölgesi bileşiğinin yapısı, Visual Molecular Dynamics (VMD) paketi (Humphrey, Dalke & Schulten, 1996) kullanılarak görselleştirildi.

istatistiksel analiz

SONUÇLAR

Ana bileşen, sırasıyla solvent ekstraksiyonu ve ters fazlı HPLC teknikleri kullanılarak H. terminallerinin gövdesinden başarıyla saflaştırıldı. Elde edilen 1H-NMR ve 13C-NMR spektrumları, SciFinder (https://scififinder.cas.org/) aracılığıyla referans maddelerinkilerle karşılaştırıldı ve (8′Z)-1,{ {6}}dihidroksi-5- [16'-(3",5"-dihidroksifenil)-8'-hekzadesen-1'-il] benzen (Chaturvedula ve diğerleri, 2{{ 23}}02). Bisresorsinollerden biri olarak sınıflandırıldı. Bu yeni bis resorsinol, moleküler ağırlığı 463.2819 Dalton olan C28H40O4 moleküler formülüne sahipti. Ekstraksiyon verimi, gövdenin kuru ağırlığına göre yüzde 0.086 olarak hesaplandı. Elde edilen 'H ve 13C-NMR spektrumları ile ilgili olarak saflığı yüzde 98'den fazlaydı (bkz. Şekiller S1 ve S2).

In vitro biyoaktivite analizi

Bisresorsinolün kolajenaz, elastaz ve tirozinaz gibi yaşlanan enzimler üzerindeki antagonistik etkileri, farklı bir spektroskopik yöntem kullanılarak in vitro olarak belirlendi. Sonuçlar Tablo 1 ve Şekil 2'de özetlenmiştir. Kollajenaz inhibisyonu için, 50–550 µmol L-1 aralığındaki test numuneleri MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala Arg-NH2 kullanılarak hazırlanmıştır. enzim substratı olarak ve kafeik asit bir enzim inhibitörü olarak. 156.7 µmol L-1 konsantrasyonundaki bisrezorsinolün enzim aktivitesini yüzde 50 azalttığı (IC50) gösterildi. Bunun yerine, kafeik asidin IC50'si 308,9 ± 13,7 µmol L-1 idi. Bu nedenle, bisrezorsinolün anti-kollajenaz aktivitesi, kafeik asitten önemli ölçüde daha güçlüydü.

Daha fazla bilgi için: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501