RNA Dizilemesine Dayalı Olarak Böbrek Yaşlanmasında LncRNA'nın Rolünü Tahmin Edin Ⅱ
Jan 26, 2024
LncRNA Gm43360 ve potansiyel hedef mRNA'larının korelasyonu
LncRNA Gm43360, iki lncRNA-mRNA birlikte ifade ağını bağladığı için çalışma için seçildi. Adra1a'nın ekspresyon seviyesi Gm43360'ın ekspresyonuyla pozitif korelasyon gösterdi (rho=0.8650, p=0.026), Csnk1a1 (kazein kinaz 1A1) negatif korelasyon gösterdi (rho{{12) }}.8084, p=0.0084) (Şekil 5a). LncRNA Gm43360 ile potansiyel hedef mRNA'ları Adra1a ve Csnk1a1'in korelasyonunu daha da doğrulamak için, bu çalışmada lncRNA Gm43360'ın aşırı ekspresyon plazmidi tasarlandı. Csnk1a1'in ifadesi beklendiği gibi azaldı ve Adra1a ifadesi de azaldı ancak anlamlı değildi. Daha sonra, hedef mRNA'larının ifadesinin etkilenip etkilenmediğini tespit etmek için lncRNA Gm43360'ı siRNA ile yıktık. Beklendiği gibi, lncRNA Gm43360 devrilme hücrelerinde Csnk1a1, siRNA negatif kontrol grubuna göre arttı (Şekil 5b). On, lncRNA Gm43360'ın hücre döngüsündeki rolünü tespit ettik. Hücre sayma kiti-8 (CCK-8) sonuçları, lncRNA Gm43360'ın hücre canlılığını desteklediğini gösterdi (Şekil 5c). Sonuçlar, lncRNA Gm43360'ın negatif kontrolle karşılaştırıldığında S fazı hücrelerinin yüzdesini arttırdığını ve G1 fazı hücrelerinin yüzdesini azalttığını gösterdi (Şekil 5d). Te p53 ve p21 proteinleri hücre döngüsünün düzenlenmesinde rol oynuyordu ve bu nedenle hücre yaşlanmasının işaretleriydi. Aşırı ekspresyon grubunda p53 ve p21'in ekspresyon seviyeleri kontrol grubuna göre önemli ölçüde azaldı. P53 ve p21'in ekspresyon seviyeleri, siRNA grubunda siRNA kontrol grubuna göre önemli ölçüde arttı (Şekil 5e). lncRNA Gm43360'ın aşırı ekspresyonu, SA- -gal-pozitif hücrelerin sayısını azalttı ve -gal-pozitif hücreler, transfekte edilmiş Gm43360 grubunda arttı (Şekil 5f). Birlikte ele alındığında bu sonuçlar, lncRNA Gm43360'ın böbrek tübüler epitel hücrelerinin yaşlanmasını aşağıdaki yollarla inhibe ettiğini gösterdi:Csnk1a1 ifadesinin inhibe edilmesi.
BÖBREK İŞLEVLERİNE YÖNELİK %25 EKİNAKOSİT VE %9 AKTEOSİT İÇEREN DOĞAL ORGANİK SİSTANŞ EKSTRATINI ALMAK İÇİN BURAYA TIKLAYIN
Tartışma
Bu çalışmada, genç ve yaşlı fare böbreklerinden alınan mRNA ekspresyon verilerini değerlendirdik ve anormal şekilde eksprese edilen mRNA'ların fonksiyonlarını ortaya koyan biyo-bilgi analizleri gerçekleştirdik. 347 yukarı regüle edilmiş mRNA ve 355 aşağı regüle edilmiş mRNA'nın yanı sıra 130 yukarı regüle edilmiş lncRNA ve 91 aşağı regüle edilmiş lncRNA'yı gözlemledik.yaşlı fare böbrekleri genç fare böbrekleriyle karşılaştırıldığında. Ek olarak, bu mRNA'ların yaşlanmayla ilişkili yollarda da yer aldığı gösterilmiştir.oksidatif fosforilasyonAMPK sinyal yolu, Wnt sinyal yolu, Rap1 sinyal yolu ve yaşa bağlı hastalıklar, böbrek yaşlanmasının patogenezinde diferansiyel olarak eksprese edilen mRNA'ların fonksiyonlarını ortaya koymaktadır.
Uzun kodlamayan RNA NEAT1, renal tübüler epitel hücrelerinde böbrek fibrozisinin ilerlemesinde koruyucu bir faktördür [21]. Tesadüfen, sıralama sonuçlarımızda lncRNA NEAT1, yaşlı farelerin böbreklerinde genç farelere göre daha düşük seviyelerde eksprese edildi; bu, önceki bulgularla tutarlıdır. LincRNA-Gm4419, diyabetik nefropatide NF-kB/NLRP3 inflamatuar aracılı mekanizmalar yoluyla inflamasyonu ve fibrozisi hızlandırır [22]. Sıralama sonuçlarımızda ayrıca yaşlı farelerin böbreklerinde Gm4419 ekspresyonunun genç farelere göre daha yüksek olduğunu ancak anlamlı bir fark olmadığını bulduk. LncRNA Gm43360, kromozom 5'te bulunur (Chr5:122494022–122,494,908, 2887 bp). UCSC Genom Tarayıcısına göre Gm43360, protein kodlayan gen Atp2a2'nin intronunda bulunur. Ancak bugüne kadar lncRNA Gm43360'ın hastalıklarda rol oynadığına dair bir rapor bulunmuyor. Bu çalışmada, lncRNA Gm43360'ın yıkılması renal tübüler epitelyal hücre yaşlanmasını teşvik etti. Ek olarak, sekanslama sonuçlarında diferansiyel olarak eksprese edilen birçok lncRNA'yı belirledik ve bunları araştırdık.
LncRNA'lar, lncRNA düzenleyici mekanizmalara dayalı olarak cis-düzenleme veya trans-düzenleme olarak sınıflandırıldı. Cis-etkili lncRNA'lar, lncRNA'lar ve mRNA'lar arasındaki mesafeler 100 kb'den az olan promotörler, güçlendiriciler ve düzenleyici diziler gibi cis-etkili elementlere bağlı olarak komşu genlerin ekspresyonunu etkileyebilir. Trans-etkili lncRNA'lar, transfeksiyon bölgesini terk eden ve uzak bölgelerde çalışan lncRNA'ları ifade eder (yani lncRNA'lar ile mRNA'lar arasındaki mesafe 100 kb'den fazladır) [23]. lncRNA MAAT, cis-düzenleyici bir modül aracılığıyla komşu gen Mbnl1'in ekspresyonunu arttırır [24]. LncRNA Pnky, kortikal gelişimde trans-etkili bir düzenleyici olarak rol oynar [25]. Bu çalışmada lncRNA Gm43360 ve Csnk1a1 arasında transdüzenleyici bir ilişki vardı. Csnk1a1, hücre döngüsüne ve hücre bölünmesi sürecine [27] katılan bir proteini kodlayan bir tümör baskılayıcı gendir [26]. Csnk1a1 aşağı regülasyonu indükleryaşlanmayla ilişkili inflamatuarkolorektal tümörlerde büyümenin durmasıyla sonuçlanan yanıt [26]. Gm43360 yukarı doğru düzenlendiğinde Csnk1a1 aşağı doğru düzenlenmiştir; bu nedenle lncRNA Gm43360'ın katılması muhtemeldir.böbrek yaşlanmasıileCsnk1a1 ifadesinin düzenlenmesi.
Sonuçlar
LncRNA-mRNA ortak ifade ağına ilişkin araştırmamızböbrek yaşlanmasıbir lncRNA olan lncRNA Gm43360'ın böbrek yaşlanmasında koruyucu bir rol oynayabileceğini ortaya çıkardı ve böbrek yaşlanmasında rol oynayan mekanizmalara ilişkin anlayışımızı genişletti.böbrek yaşlanması
Malzemeler ve yöntemler
Örnekler Genç (3-aylık) ve yaşlı (24-aylık) erkek C57BL/6J fareleri, Xiamen Üniversitesi Deneysel Hayvan Merkezi'nden satın alındı ve standart bir ortamda büyütüldü. Tüm farelerin yiyecek ve suya serbestçe erişimi vardı. Fareler, kurban edilmeden önce bir ay boyunca yeni tesise alıştırıldı. Farelere, numune toplanmadan önce 750 mg/kg dozunda intraperitoneal enjeksiyon yoluyla üretan ile anestezi uygulandı. Genç ve yaşlı fareler aynı gün kurban edildi.Kalan fare böbreğiHer tahlilde sekanslama için doku kullanıldı. RNA-seq ve histopatoloji gerçekleştirildiböbrekleri ayırmakaynı fareden. Farelerden böbrek dokusu toplandı. Böbreklerden biri, sonraki bölüm gömme işlemi için hemen %10 nötr tamponlu formaline daldırıldı ve diğer böbrek, birkaç dokuya bölünerek hemen sıvı nitrojen içerisine yerleştirildi ve daha sonra -80 derecede saklandı. Çalışma, Xi'an Jiaotong Üniversitesi'nin (Shaanxi, Çin) Birinci Bağlı Hastanesinin Etik Komitesi tarafından desteklenmiştir (No. 2018-G-164). Tüm yöntemler hayvan etiği kurallarına ve düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Bu çalışma ARRIVE kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Böbrek histopatolojisi
Genç ve yaşlı farelerin böbrek dokusu numuneleri, gece boyunca %10 paraformaldehid solüsyonunda sabitlendi. Kesitlerin on tanesi dehidre edildi, parafine gömüldü ve 4-um kalınlığında kesitlere ayrıldı. PAS ve Masson'un trikromatik boyaması standart protokoller kullanılarak yapıldı. Görüntüler kamera tarafından çekildi ve boyama pozitif alan ölçüldü. Histopatoloji kamera görüntülerinin alanı Image-Pro Plus 6.0 ile hesaplandı.
SA‑‑gal boyama
SA{{0}}gal aktivitesi, üreticinin protokolüne göre bir SA- -gal boyama kiti (Hücre Sinyal Teknolojisi #9860) kullanılarak analiz edildi. Pozitif boyamanın alanı ölçüldü ve SA- -gal-pozitif hücreler, Image-Pro Plus 6.0 kullanılarak hesaplandı.
RNA ekstraksiyon kütüphanesi yapımı ve sıralaması
Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 bir sıralama kitaplığı oluşturmak için kullanıldı. Toplam RNA'nın ekstraksiyonundan sonra mRNA, iki saflaştırma turuyla Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, ABD) kullanılarak toplam RNA'dan (5ug) saflaştırıldı. Saflaştırmanın ardından mRNA, yüksek sıcaklıklarda (Magnezyum RNA Parçalanma Modülü (NEB, kat. e6150, ABD) 94 derece 5-7 dakikanın altında) iki değerlikli katyonlar kullanılarak kısa parçalara bölündü. Daha sonra bölünmüş RNA fragmanları, SuperScript™ II Ters Transkriptaz (Invitrogen, kat. 1,896,649, ABD) ile cDNA'yı elde etmek için ters kopyalandı; bunlar daha sonra E. coli DNA polimeraz I ile U etiketli ikinci iplikçikli DNA'ları sentezlemek için kullanıldı ( NEB, cat.m0209, ABD), RNase H (NEB, cat.m0297, ABD) ve dUTP Çözümü (Termo Fisher, kat.R0133, ABD). Daha sonra her bir ipliğin kör uçlarına bir A-baz eklenerek bunları indeksli adaptörlere ligasyon için hazırladık. Her adaptör, adaptörü A kuyruklu parçalanmış DNA'ya bağlamak için bir T-baz çıkıntısı içeriyordu. Parçalara çift indeksli adaptörler bağlandı ve boyut seçimi AMPureXP boncuklarıyla yapıldı. U etiketli ikinci iplikçikli DNA'ların ısıya dayanıklı UDG enzimi (NEB, cat.m0280, ABD) işleminden sonra, bağlanan ürünler aşağıdaki koşullarla PCR ile amplifiye edildi: 95 derecede 3 dakika süreyle ilk denatürasyon; 98 derecede 15 saniyelik 8 denatürasyon döngüsü, 60 derecede 15 saniyelik tavlama ve 72 derecede 30 saniyelik uzatma; ve ardından 72 derecede 5 dakika boyunca son uzatma. Nihai cDNA kitaplıkları için ortalama ekleme uzunluğu 300±50 bp idi. Son olarak, üreticinin protokolüne göre Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, Çin) üzerinde 2x150 bp eşleştirilmiş uç dizilimini (PE150) gerçekleştirdik [28].
Biyoinformatik analiz Temiz Okumaların sırası ve filtrelenmesi
Havuzlanmış RNA'dan teknolojiyle oluşturulan bir cDNA kütüphanesiböbrek örneklerifarelerin dizisi dizilendi ve Illumina NovaseqTM 6000 dizi platformuyla çalıştırıldı. Illumina çift uçlu RNA-seq yaklaşımını kullanarak, transkriptomu sıraladık ve toplamda milyon 2x150 bp çift uçlu okuma ürettik. Sıralama makinelerinden elde edilen okumalar, adaptörler veya düşük kaliteli bazlar içeren ham okumaları içerir ve bu, sonraki montaj ve analizi etkileyecektir. Bu nedenle, yüksek kaliteli temiz okumalar elde etmek için okumalar Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9) tarafından daha da filtrelendi. Parametreler aşağıdaki gibiydi:
1) bağdaştırıcıları içeren okumaların kaldırılması;
2) polyA ve poly içeren okumaların çıkarılması;
3) %5'ten fazla bilinmeyen nükleotid (N) içeren okumaların çıkarılması;
4) %20'den fazla düşük kaliteli (Q değeri 20'den az veya ona eşit) baz içeren düşük kaliteli okumaların kaldırılması.
On dizi kalitesi FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9) kullanılarak doğrulandı. temiz verilerin Q20, Q30 ve GC içeriği dahil. Bundan sonra, temizlenmiş, eşleştirilmiş uç okumaların toplam G bp'si üretildi. Ham dizi verileri, GSE154223 erişim numarasıyla NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) veri kümelerine gönderildi.
Referans genomu/ek açıklaması Mus_musculus.GRCm38'di. Analizler için kullanılan gen açıklamasının kaynağı ve sürümü Ensembl_v88'di.
Transkript derlemesi
İlk olarak Cutadapt [29] adaptör kontaminasyonunu, düşük kaliteli bazları ve belirlenmemiş bazları içeren okumaları çıkarmak için kullanıldı. FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/) kullanılarak on dizi kalitesi çok beslendi. Okumaları fare genomuna eşlemek için Bowtie2 [31] ve Hisat2'yi [32] kullandık. Her örneğin haritalanmış okumaları StringTie [33] kullanılarak birleştirildi. On, tüm transkriptlerböbrek örnekleriPerl komut dosyalarını kullanarak kapsamlı bir transkriptomu yeniden oluşturmak için birleştirildi. Nihai transkriptom oluşturulduktan sonra, tüm transkriptlerin ekspresyon seviyelerini tahmin etmek için StringTie [33] ve edgeR [34] kullanıldı.
LncRNA tanımlaması
Öncelikle bilinen mRNA'larla örtüşen transkriptler ve 200 bp'den kısa transkriptler atıldı. Daha sonra kodlama potansiyeline sahip transkriptleri tahmin etmek için CPC [35] ve CNCI [36] kullandık. TBM puanına sahip tüm transkriptler<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.
Diferansiyel olarak ifade edilen analiz genleri (DGE'ler) analizi
StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2'si diferansiyel olarak eksprese edilen genler olarak kabul edildi.
Hedef gen tahmini ve lncRNA'ların fonksiyonel analizi
LncRNA'ların işlevini araştırmak için lncRNA'ların cis-hedef genlerini tahmin ettik. LncRNA'lar komşu hedef genler üzerinde etkide bulunmada cis rolü oynayabilir. Bu çalışmada 100,000 upstream ve downstream'deki kodlayan genler Perl betiği ile seçilmiştir. Daha sonra, BLAST2GO komut dosyalarını kullanarak lncRNA'lar için hedef genlerin fonksiyonel bir analizini gösterdik [39]. Kamu alanına tam komut bağlantısı, main · dandan-li/Jie-Li (github.com) adresindeki Jie-Li/README.md idi.
Gen ontolojisi (GO) kategorileri ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) analizi
RNA dizilimine yönelik biyoinformatik analiz, OmicStudio araçları (//www.omicsudio.cn/tool) kullanılarak yapıldı. Tahmin edilen hedef genlerin biyolojik fonksiyonlarını analiz etmek için Gen Ontolojisi (GO) fonksiyonel zenginleştirme analizi ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) [37-39] zenginleştirme analizi kullanıldı. GO analizi, ana biyolojik süreçleri üç açıdan açıklığa kavuşturur: hücre bileşimi, moleküler işlevler ve biyolojik süreçler (http://www.geneontology.org/). Analiz ilk olarak diferansiyel olarak ifade edilen tüm genleri ve arka plan genlerini GO veritabanına koyar. Her öğe haritalanır, her öğedeki gen sayısı hesaplanır ve zenginleştirme sonucunun P değerini elde etmek amacıyla hipotez testi yapmak için hipergeometrik dağılım kullanılır. P değeri ne kadar düşük olursa zenginleştirme sonucu o kadar anlamlı olur. KEGG, hedef genlerle ilgili önemli yolları keşfetmek için diferansiyel olarak ifade edilen mRNA'ları genetik biyoloji yoluyla analiz eden bir veritabanı kaynağıdır (https://www.genome.jp/kegg/). Sonuçlar p değerleri ile ifade edilir; p değeri ne kadar düşük olursa zenginleştirme sonucu o kadar anlamlı olur.
qRT – PCR
GAPDH endojen kontrol olarak kullanıldı. Daha sonra bilinmeyen genlerin göreceli ekspresyon seviyeleri hesaplandı. Tüm primerler bu deney için özel olarak tasarlanmış ve sentezlenmiştir. GAPDH için primerler ticarileştirildi. Adra1a ve Csnk1a1 primerlerinin özgüllüğü, erime eğrisinin tek zirvesiyle belirlendi.
mRNA‑lncRNA ortak ifade ağı oluşturun
Transregülasyon araştırmaya dayanıyordu ve ardından trans enerjisi hesaplandı. Trans enerjisi ne kadar küçük olursa bağlanma olasılığı o kadar yüksek olur. Daha sonra mRNA-lncRNA'nın korelasyon katsayısı da hesaplandı. MRNA-lncRNA ağı, 0.9'u aşan bir Spearman korelasyon katsayısı seçilerek oluşturuldu. MRNA-lncRNA birlikte ifade ağı, Cytoscape yazılımı (v3.7.1) kullanılarak oluşturuldu.
Hücre kültürü
Fare böbrek proksimal tübüler epitel hücreleri (MRPT-EpiC'ler), %2 fetal sığır serumu (FBS, Kat. #0010) ve Epitel Hücre Büyüme Takviyesi hayvanı içeren epitel hücre ortamı hayvanında (EpiCM-a, Kat. #4131) kültürlendi. (EpiCGS-a, Cat. #4182) antibiyotiksiz olarak 37 derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde ve %5 CO2'de. Kültür ortamı her 2-3 günde bir değiştirildi. Logaritmik büyüme fazındaki hücreler, büyüme %90'a ulaştığında alt kültürlendi. Tripsin tarafından sindirilen hücre süspansiyonu, her bir kuyucukta 2*104 -5*104 hücre bulunan 6-kuyucuklu plakalara ekildi. Transfeksiyon için kullanılan hücrelerin tümü 2. ve 5. nesiller arasındaydı.
Plazmid yapımı ve hücre transfeksiyonu
lncRNA Gm43360 aşırı ekspresyon plazmidi GeneChem (Şangay, Çin) tarafından yapılmıştır. Plazmit omurgası GV658'di ve CMV promotörü lncRNA ekspresyonunu yönlendirdi. Klonlanmış nükleotid dizisi ek materyalde sağlanmaktadır. lncRNA Gm43360 yıkımı için, üç lncRNA ENS'nin siRNA'ları00000197656-hedeflemesi ZORUNLUDUR (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'-CCCUGUCACUCA UGAAGUUTT-3'; ve lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT-3'), GenePharma'da (Şangay, Çin) tasarlandı ve sentezlendi. Üreticinin protokolüne göre hücreler, oyuk başına 6 ul Lipofectamine™ 2000 Transfeksiyon Reaktifi (Invitrogen, ABD) ile 2500 ng plazmid veya 100 pmol siRNA ile transfekte edildi. Transfeksiyondan 48 saat sonra RNA ve protein ekspresyon seviyeleri tespit edildi ve her deney en az üç kez tekrarlandı. LncRNA Gm43360 aşırı ekspresyonunun ve yıkımının verimliliğini doğrulamak için gerçek zamanlı kantitatif PCR kullanıldı.
Western blot analizi
Kültürlenen hücreler buz soğukluğunda PBS ile yıkandı, 120 ul RIPA tamponu (Heart, Çin) ilave edildi ve buz üzerinde 30 dakika boyunca proteaz inhibitörü ve PMSF (Heart, Çin) ilave edildi. Hücreler farklı mikrosantrifüj tüplerinde toplandıktan sonra protein konsantrasyonu ölçüldü. Her numuneye yükleme tamponu eklendi ve daha sonra 7 dakika kaynatıldı. Numunenin otuz mikrogramı %12 SDS-PAGE (Beyotime, Çin) ile ayrıldı ve PVDF membranlarına (Thermo Fisher, ABD) elektrotransfer edildi. Daha sonra membranlar %5 süt ile bloke edildi. Membranlar spesifik birincil antikorlarla inkübe edildi: anti-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), anti-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP) ve anti-GAPDH (1:3000, Profintech) , 60004-1-Ig) gece boyunca 4 derecede. TBST ile yıkandıktan sonra membranlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil bir antikorla inkübe edildi. Protein bantları bir kemilüminesans kiti (Millipore, ABD) kullanılarak gözlendi. GAPDH ifadesi, protein seviyelerini normalleştirmek için kullanıldı.
Hücre çoğalması tahlili
Hücre çoğalmasının kapasitesi, hücre sayma kiti-8 (CCK-8) tahlili ile belirlendi. Transfeksiyondan kırk sekiz saat sonra, her bir kuyucuğa 90 ul yeni ortam ve 10 ul CCK-8 çözeltisi eklendi (Beyotime, C0042). Hücreler %5 CO2'de 37 derecede 1-4 saat inkübe edildi ve üniversal bir mikroplaka okuyucu (Bio-Tek, ABD) ile 450 nm'de ölçüldü.
Akış sitometri analizi
Hücreler, transfeksiyondan bir gün önce 6-kuyucuklu plakalara yerleştirildi. Transfeksiyondan kırk sekiz saat sonra hücreler, trypsinizlendi ve 1000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüjlendi. Daha sonra hücreler %70’lik etanol içerisinde 4 derecede en az 4 saat süreyle fikse edildi. Santrifüj sonrası hücrelere RNase A ve propidyum iyodür (PI) boyama solüsyonu eklendi ve hücreler daha sonra oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika inkübe edildi. Te lekeli hücreler, bir ACEA NovoCyte (Biosciences, ABD) kullanılarak analiz edildi.
istatistiksel analiz
Normal dağılıma göre ölçüm verileri ortalama±SD olarak sunulmuştur. İki farklı grup arasındaki fark, iki kuyruklu eşleştirilmemiş Öğrenci t testleri kullanılarak belirlendi ve < 0,05'lik bir p değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Tüm hesaplamalar GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., ABD) kullanılarak yapıldı.
Referanslar
1. Docherty MH, O'Sullivan ED, Bonventre JV, Ferenbach DA. Böbrekte Hücresel Yaşlanma. J Am Soc Nephrol. 2019;30(5):726–36.
2. Partridge L, Deelen J, Slagboom PE. Yaşlanmanın küresel zorluklarıyla yüzleşmek. Doğa. 2018;561(7721):45–56.
3. JX'i kaydırın. LncRNA H19, MAPK ve NF-kB sinyal yollarını düzenleyerek aterosklerozu teşvik eder. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017;21(2):322–8.
4. Wasson CW, Abignano G, Hermes H, Malaab M, Ross RL, Jimenez SA, Chang HY, Feghali-Bostwick CA, Del Galdo F. Uzun kodlayıcı olmayan RNA HOTAIR, sistemik olarak EZH2-bağımlı miyofibroblast aktivasyonunu tetikler NOTCH'un miRNA 34a'ya bağımlı aktivasyonu yoluyla skleroz. Ann Romatizmal Hastalığı. 2020;79(4):507–17.
5. Luo J, Wang K, Yeh S, Sun Y, Liang L, Xiao Y, Xu W, Niu Y, Cheng L, Maity SN, ve diğerleri. LncRNA-p21, EZH2/STAT3 sinyalini modüle ederek antiandrojen enzalutamid kaynaklı prostat kanseri nöroendokrin farklılaşmasını değiştirir. Nat İletişim. 2019;10(1):2571.
6. Wang Y, Yang L, Chen T, Liu X, Guo Y, Zhu Q, Tong X, Yang W, Xu Q, Huang D, ve diğerleri. Yeni bir lncRNA MCM3AP-AS1, miR-194-5p/FOXA1 eksenini hedefleyerek hepatoselüler karsinomun büyümesini destekler. Mol Kanseri. 2019;18(1):28.
7. Wu YY, Kuo HC. Nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde kodlamayan RNA'ların fonksiyonel rolleri ve ağları. J Biomed Sci. 2020;27(1):49.
8. Li Z, Wang Z. Yaşlanan Böbrek ve Yaşlanmaya Bağlı Hastalık. Adv Experiment Med Biol. 2018;1086:169–87.
9. Wang X, Vrtiska TJ, Avula RT, Walters LR, Chakkera HA, Kremers WK, Lerman LO, Rule AD. Yaş, böbrek fonksiyonu ve risk faktörleri böbreğin kortikal ve medüller hacimleriyle farklı şekilde ilişkilidir. Böbrek Uluslararası 2014;85(3):677–85.
10. Lin Q, Hou S, Dai Y, Jiang N, Lin Y. LncRNA HOTAIR, RAB3IP aracılığıyla Parkinson hastalığının ilerlemesini teşvik etmek için miR-126-5p'yi hedefler. Biol Kimya. 2019;400(9):1217–28.
Wecistanche Destek Hizmeti-Çin'deki en büyük cistanche ihracatçısı:
E-posta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Daha Fazla Özellik İçin Alışveriş Yapın Detaylar:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
