Antioksidan Spektrum-Etki İlişkisine Dayalı Cistanches Herba'nın Kalite Belirteçleri

Soyut

Amaç: Kalite belirteçleri (Q-işaretleyiciler) için bir araştırma yöntemi oluşturmakCistanches Herba(CH) temel alınarakantioksidan spektrum-etki ilişkisiFarmakolojik maddelerinin ve kalite kontrolünün incelenmesi için bir temel sağlar. Yöntemler: 10 CH grubu için parmak izi profillerini oluşturmak amacıyla ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) kullanıldı. H2O2 kullanılarak bir hücre oksidatif hasar modeli oluşturuldu ve CH'nin antioksidan kapasitesi, reaktif oksijen türlerinin yarı maksimum inhibitör konsantrasyonunun yanı sıra farmakolojik göstergeler olarak süperoksitdismutaz ve katalaz seviyelerine göre belirlendi. Spektrum-etki ilişkisi temel bileşen analizi, Pearson korelasyon analizi ve kısmi en küçük kareler regresyon analizi yoluyla oluşturulmuştur. Aktif bileşenler farmakolojik doğrulamaya tabi tutuldu. Sonuçlar: CH için parmak izi profilleri, UPLC kullanılarak 17 ortak tepe noktası tanımlanarak oluşturuldu. Spektrum-etki korelasyon analizine dayanarak dokuz bileşen seçildi. Farmakolojik doğrulama sonuçları, geniposidik asit, 8-epiloganik asit,ekinekozit, akteozit,izoakteozit, Vetübülosid Akonsantrasyona bağlı olarak antioksidan aktivite sergilemiştir. Sonuç: Bu çalışma, spektrum-etki ilişkisine dayanarak CH için Q-belirteçlerini araştırdı ve farmakolojik madde temeli ve kalite standardının iyileştirilmesi için referans bilgileri sağladı.

Anahtar Kelimeler:Cistanches Herba; Q-işaretleyici;spektrum-etki ilişkisi; antioksidan

BÖBREK FONKSİYONU İÇİN %30 EKİNAKOSİT VE %12 AKTEOSİT İÇEREN ORGANİK SİSTANŞ EKSTRESİ

CistancheOrobanchiaceae familyasının Cistanche cinsine ait bir bitki olan Cistanche Deserticola YCMa veya Cistanche tubulosa (Schenk) Wight'ın pullu yaprakları olan kurutulmuş etli sapıdır. İlk kez "Shen Nong's Materia Medica"da kaydedildi ve en üst sınıf olarak listelendi [1]. Doğası gereği sıcak, tadı tatlı ve tuzludur; böbrek ve kalın bağırsak meridyenlerine döner; böbrek yang'ını besleyici, özü ve kanı yenileyici, bağırsakları nemlendiren ve müshil etkisine sahiptir ve böbreği tonlamak ve özü yenilemek için önemli bir ilaçtır [2-3]. Böbrekler özü depolar, öz ve kan aynı kaynaktan gelir. Öz ve kanın eksikliği insan vücudunun genel yaşam aktivitelerini etkiler; özü üreten ilik kemiklerde depolanır, beyin ise ilik denizidir. Böbrek özü yetersizse, kemikler beslenmesini kaybeder ve beyin yetersiz kalır, bu da kemikte gevşek doku, diş kaybı, hafıza kaybı, demans ve bağışıklık fonksiyonunun azalması gibi dejeneratif değişikliklere neden olur [4-6]. Cistanche Deserticola, feniletanol glikozitler, iridoidler, lignanlar ve ekinezyasit, verbaskosit, izorbaskozit, genipinik asit ve 8-epistryanik asit dahil olmak üzere diğer yapısal bileşenleri içerir. , tubulin A, vb. [7]. "Çin Halk Cumhuriyeti Farmakopesi"nin 2020 baskısındaki Cistanche Deserticola'nın mevcut kalite kontrolü, yalnızca geleneksel Çin tıbbının çok bileşenli ve çok hedefli etki özelliklerini tam olarak yansıtamayan ekinezya ve verbaskozit içeriğini şart koşmaktadır. Kalite kontrol ve değerlendirmeye elverişli olmayan.

Geleneksel Çin tıbbının kalite kontrol düzeyini iyileştirmek ve geleneksel Çin tıbbının kalite değerlendirmesini optimize etmek için Akademisyen Liu Changxiao, geleneksel Çin tıbbının yeni kalite belirteci (Q-marker) kavramını önerdi [8]. Bunlar arasında, "etkinlik", Q-marker'ın "Beş İlkesinde" temel unsurdur [9] ve aynı zamanda geleneksel Çin ilaçlarının kalite değerlendirmesinin de temelini oluşturur.

Kalite standartları ile ilaç etkinliği arasındaki zayıf korelasyonun mevcut araştırma durumu göz önüne alındığında, geleneksel Çin ilaçlarının Q-belirteçlerinin araştırılması ve daha bilimsel ve makul kalite standartlarının oluşturulması, geleneksel Çin ilaçlarının kalitesinin iyileştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Spektrum-etki ilişkisi, geleneksel Çin tıbbının etkili maddelerini bulmak için geleneksel Çin tıbbının parmak izi kromatografik zirvelerini spesifik farmakodinamik verilerle ilişkilendirmektir, böylece geleneksel Çin tıbbının doğal kalitesini yansıtır [10]. Spektral verimlilik matematiksel modelinin oluşturulması, geleneksel Çin tıbbının QMarker'ını "bütünsel bir bakış açısıyla" açıklığa kavuşturabilir ve geleneksel Çin tıbbının daha sonraki kalite kontrolü, kalite standartlarının formüle edilmesi ve aktif bileşenlerin taranması için daha fazla referans sağlayabilir. Bu çalışma, geleneksel Çin tıbbının spektrum-etki ilişkisini incelemek için reaktif oksijen türlerinin (ROS IC50) yarı inhibisyon oranı, süperoksit dismutaz (SOD) ve katalaz (CAT) içerikleriyle birleştirilmiş parmak izlerini kullanır ve temel bileşen analizini kullanır. (PCA), Pearson korelasyon analizi (PCC) ve kısmi en küçük kareler regresyon analizi (PLS), kalite kontrolüne bir temel sağlamak amacıyla Cistanche Deserticola'nın Q-markerini kapsamlı bir şekilde analiz eder.

1 malzeme

1.1 Örnek

Cistanche DeserticolaSincan'ın Yutian İlçesinden ve İç Moğolistan'daki Cistanche Deserticola İyi Tarım Uygulamaları (GAP) ekim üssünden hasat edildi. Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd.'den araştırmacı Zhang Tiejun tarafından Cistanche tubulosa (Schenk) Wight ve Cistanche Deserticola olarak tanımlandı.

YC Ma, ayrıntılı bilgi Tablo 1'de gösterilmektedir.

1.2 Test ilacı

Ekinezya (parti numarası: 111670-201907, saflık: %91,8) ve verbaskosidin (parti numarası: 111530-201914, saflık: %95,2) her ikisi de Çin Gıda ve İlaç Kontrol Enstitüsü'nden satın alınmıştır; izoreskosit (parti numarası: 61303-13 -7), salidrosid (parti numarası: 10338-51-9), 8-epistriknoik asit (parti numarası: 82509-41-9), genipinik asit (parti numarası: Z24A10X95926) , tuberosin B (Parti numarası: 112516-04-08), 2-asetil öjenol glikozit (Parti numarası: 94492-24-7) Shanghai Yuanye Bioteknoloji Co., Ltd.'den satın alınmıştır, saflığı şuna eşit veya daha büyük: %98; Cistanche glikozit A (Parti numarası: MUST -20062806, saflık: %98,51) ve vaskülin A (parti numarası: MUST19110102, saflık: %98,57), Chengdu Mansite Bioteknoloji Co., Ltd.'den satın alınmıştır; kromatografik olarak saf asetonitril ve formik asit, Tianjin Concord Technology Co., Ltd. Company'den satın alındı; Arıtılmış Su (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). E Vitamini (VE, V8010, Pekin Solarbio Şirketi);

Dimetil sülfoksit (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company, ABD); CellTiter 96® AQueous tek çözeltili hücre çoğalması tespit kiti (G3580, Promega Company, ABD); CAT tespit kiti (S0051), SOD aktivite tespit kiti S0101M) ve ROS tespit kiti (S0033S), Shanghai Biyuntian Bioteknoloji Co., Ltd.'den satın alındı.

1.3 Aletler

Waters H-sınıfı-PDA ultra yüksek performanslı sıvı kromatografı (Waters Company, ABD); Sartorius BT25S elektronik terazi (Sartorius Company, Almanya); H1650 yüksek hızlı masaüstü santrifüj (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Mikroplaka okuyucu (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); WYS-41XDY biyolojik mikroskobu (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 hücre

Bu deneyde insan embriyonik böbrek hücreleri HEK 293 hücreleri kullanıldı ve Çin Bilimler Akademisi'nin hücre bankasından satın alındı.

2 yöntem

2.1 Parmak izi haritasının oluşturulması

2.1.1 Test çözeltisinin hazırlanması: 2 g Cistanche Deserticola tıbbi malzemesini tartın, miktarının 10 katı su ekleyin, her seferinde 1 saat olmak üzere 3 kez ısıtın ve geri akıtın, 1'de santrifüjleyin.0 ×105r·min-1 15 dakika boyunca (santrifüj yarıçapı 300 mm'dir), Süpernatanları birleştirin ve 100 mg·mL-1 kütle konsantrasyonuna sahip bir stok çözelti hazırlamak için konsantre edin, 10 kez seyreltin, ve bunu elde etmek için 0,22 μm'lik mikro gözenekli filtre membranından filtreleyin.

2.1.2 Karışık referans solüsyonunun hazırlanması

8-Epistrrik asit, salidrosid, ekinezyasit, cistanche glikozit A, genipinik asit, verbaskozit, antosiyanosit A, izorbaskozit ve 2'-asetil öjenol'ü alın. Glikozit ve anjiyosit B referans maddesi uygun miktarlarda ölçüldü ve doğru şekilde tartıldı. Kütle konsantrasyonu 20 µg·mL-1 olan karışık bir referans madde çözeltisini çözmek ve hazırlamak için %50 metanol çözeltisi ekleyin.

2.1.3 Kromatografik koşullar

ACQUITY UPLC®BEH C18 sütunu (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); mobil faz asetonitrildir (A) ~ 0.1% formik asit çözeltisi (B), gradyan elüsyon programı (0 ~ 6 dakika, %5 ~ %8 A; 6~10 dakika, %8~%15A) ; 10~13 dakika, %15~%19A, 13~20 dakika, %19~%25A); algılama dalga boyu 237 nm'dir; akış hızı 0,4 mL·dak-1'dir; sütun sıcaklığı 40 derecedir; enjeksiyon hacmi 3 μL'dir.

2.1.4 Referans tepe noktası seçimi

Cistanche Deserticola'nın ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) kromatogramında, en büyük tepe alanı oranına, orta düzeyde alıkonma süresine ve iyi ayırmaya sahip olan tepe, parmak izi spektrumunun referans tepe noktası olarak seçildi.

2.1.5 Metodolojik inceleme

Hassasiyet testi: T1 numunesini alın ve test çözeltisini 2.1.1'deki yönteme göre hazırlayın. Numuneyi 6 kez sürekli olarak enjekte edin ve parmak izini kaydedin. Sonuçlar, her bir zirvenin göreceli zirve alanı RSD'sinin 0.10%~%4.61 olduğunu ve göreceli tutma süresi RSD'sinin %0.08~%1.32 olduğunu gösterir; bu da cihazın iyi performansa sahip olduğunu gösterir. kesinlik.

Tekrarlanabilirlik testi: T1 numunesini alın ve 2.1.1'deki yönteme göre paralel olarak test çözeltisinden 6 numune hazırlayın ve numuneyi sürekli olarak enjekte edin. Sonuçlar, her bir kromatografik pikin bağıl tepe alanı RSD'sinin %1,35~4,80% olduğunu ve bağıl tutma süresi RSD'sinin %0,10~%1,80 olduğunu gösterir; bu da parmak izi gereksinimlerini karşılar ve tekrarlanabilirliğin kanıtlandığını gösterir. enstrümanın durumu iyi.

Stabilite testi: T1 numunesini alın ve test çözümünü 2.1.1 kapsamındaki yönteme göre hazırlayın, test için numuneleri 0, 2, 4, 8 ve 12. saatlerde enjekte edin ve parmak izini kaydedin. Her kromatografik zirvenin göreceli zirve alanının hesaplanan RSD'si 0%0,53~%4,82'dir ve bağıl alıkonma süresinin RSD'si 0%09~%2,17'dir; bu, gereksinimleri karşılar parmak izinin ve test ürününün 12 saat içinde stabil olduğunu gösterir.

2.2 Cistanche Deserticola'nın antioksidan etkisi üzerine araştırma

2.2.1 Cistanche Deserticola Ana Likörünün Hazırlanması

Madde 2.1.1'deki ana likörü alın, filtreleyin ve sterilize edin ve kullanımdan önce kültür ortamıyla gerekli konsantrasyona kadar seyreltin.

2.2.2 Cistanche Deserticola ve pozitif kontrol

VE'nin HEK 293 hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkisi normal grup (hücre süspansiyonu), Cistanche Deserticola uygulama grubu (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), VE grubu (20, 40, 60) olarak belirlendi. , 80, 100 µmol·L–1), her konsantrasyon için 6 kopya kuyu ayarlayın, 24 saat boyunca kültür yapın, hücre canlılığını tespit etmek için her bir kuyucuğa 20 µL CellTiter 96® AQueous tekli çözelti reaktifi ekleyin, 2 saat boyunca kültüre devam edin, ve 490 nm'de hücre canlılığını tespit etmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın. Her bir kuyucuğun absorbans (OD) değeri, formül (1)'e göre hücre hayatta kalma oranını hesaplamak için kullanıldı. Hayatta kalma oranı (%)=(ÖG deney grubu/ÖG boş grubu) × %100 (1)

2.2.3 H2O2 indüksiyonunda Cistanche Deserticola

ROS'un HEK 293 hücreleri üzerindeki etkisi. Hücreler normal gruba (hücre süspansiyonu) ve Cistanche Deserticola uygulama grubuna (6.25, 12.5, 25, 50, 100 µg·mL-1 Cistanche Deserticola ve 60 µm·L-1 H2O2) bölündü ve 24 saat kültürlendi. Sonraki işlemler için ROS tespit kitinin adımlarını izleyin, hücre boyamasını mikroskopla doğrudan gözlemleyin ve her grubun floresans yoğunluğunu tespit etmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın. Parametre ayarlarında 488 nm'lik bir uyarma dalga boyu ve 525 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullanıldı. Deney üç defa tekrar edildi.

2.2.4 Cistanche Deserticola çifti

HEK 293 hücrelerinde H2O2'nin SOD üzerindeki etkisi. Hücreler normal grup (hücre süspansiyonu), model grubu (60 µm·L–1 H2O2), VE grubu (60 µm·L–1 VE ve 60 µm·L–1 H2O2), Cistanche Deserticola uygulama grubu (100 µm·L–1 H2O2) olarak üçe ayrıldı. µg·mL–1 Cistanche Deserticola ve 60 µm·L–1 H2O2), 24 saatlik kültürden sonra hücreleri toplayın, hücreleri parçalamak için SOD örnek hazırlama solüsyonu ekleyin ve 4 derece ve 12000 r·min'de santrifüjleyin{{22} } dk (santrifüj yarıçapı 300 mm'dir), test edilecek örnek olarak süpernatantı alın ve sonraki işlemler için SOD tespit kitinin adımlarını izleyin. Deney üç defa tekrar edildi.

2.2.5 H2O2 indüksiyonunda Cistanche Deserticola

CAT'ın HEK 293 hücreleri üzerindeki etkileri 2.2.4'teki yönteme göre işlendi ve gruplar halinde gruplandırıldı. Tedaviden sonra, lizis solüsyonu ekleyin, 4 derecede ve 12000 dev/dak-1 hızda 10 dakika boyunca santrifüjleyin (santrifüj yarıçapı 300 mm'dir), süpernatantı alın ve aşağıdaki işlemleri izleyin Sonraki işlemler için CAT tespit kitinin adımlarını izleyin . Deney üç defa tekrar edildi.

2.2.6 İstatistiksel analiz

İstatistiksel analiz için SPSS 26.0 yazılımı kullanıldı. Her bir veri grubu (±±()) ile temsil edildi. Normal dağılıma uyan veriler üzerinde tek yönlü varyans analizi yapıldı. Varyansların eşit olması durumunda En Az Anlamlı Farklar yöntemi kullanıldı. Varyansların açıklanması durumunda ise En Az Anlamlı Farklar yöntemi kullanıldı. düzensiz, grafik oluşturmak için Dunnett'in T3 yöntemi GraphPad Prism 8 kullanıldı ve P kullanıldı.<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Cistanche Deserticola antioksidanının spektrum etkisi korelasyon analizi

2.3.1 PCA Parmak izleri tespit edilmiş 10 Cistanche Deserticola partisinin ortak piklerinin pik alanları Z değeri ile normalleştirildi ve SPSS 26.0 yazılımına aktarılan 10x17 sıralı bir veri matrisi haline getirildi. PCA için.

2.3.2 PCC

Cistanche Deserticola parmak izleri ve antioksidanlar arasındaki spektral verimlilik ilişkisini incelemek amacıyla iki değişkenli analiz gerçekleştirmek için SPSS 26.0 kullanıldı. Anlamlılık testi, P ile iki taraflı bir test (T) kullanılarak yapıldı.<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS

Cistanche Deserticola'nın standartlaştırılmış tepe alanı ve antioksidanının deneysel sonuçlarını SIMCA-P 14.1 yazılımına aktarın, tepe alanını X değişkeni olarak ayarlayın ve PLS gerçekleştirmek için farmakodinamik indeksi Y değişkeni olarak ayarlayın.

2.4 Cistanche Deserticola Q-marker antioksidan aktivite doğrulaması

2.4.1 Aktif bileşenlerin ana çözeltisinin hazırlanması. Genipinik asit, 8-epistrichnic asit, ekinezyasit, verbaskozit, izorebaskozit ve antosiyanosit A'yı doğru miktarlarda tartın ve bunları 10 mmol·L-1 referans çözeltisi içinde çözmek için DMSO ekleyin.

2.4.2 Aktif bileşenlerin HEK 293 sitotoksisitesine etkisi.

HEK 293 hücrelerini 24 saat inkübe ettikten sonra, her bir kuyucuğa 2.4.1'in altında farklı konsantrasyonlarda aktif madde solüsyonları ekleyin (0.781, 1.563, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µmol·L–1 ) 100 µL, sürekli stimülasyon

Hücreler 24 saat inkübe edildikten sonra hücre canlılığını tespit etmek için CellTiter 96® AQueous tekli çözelti reaktifi eklendi.

2.4.3 Aktif bileşenlerin H2O2-indüklenen HEK 293 hücreleri üzerindeki anti-oksidatif hasar etkisi.

Hücreler şu şekilde gruplandırılmıştır: normal grup, model grubu ve VE grubu 2.2.4'e göre gruplandırılmıştır. Deney grubu (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 aktivite bileşimi ve 60 µm·L–1 H2O2), 24 saat boyunca kültürlendi. Sırasıyla 2.2.3, 2.2.4 ve 2.2.5'teki yöntemlere göre hücre içi ROS seviyelerini, SOD ve CAT enzim içeriğini belirleyin.

Wecistanche Destek Hizmeti

E-posta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Daha Fazla Özellik İçin Alışveriş Yapın Detaylar:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop