Farelerde Cistanche feniletanol glikozitlerin antidepresan etkileri ve mekanizmaları üzerine araştırmalar
Dec 17, 2024
Soyut:
Bu çalışma, terapötik etkilerini ve mekanizmalarını araştırmayı amaçlamaktadır.Cistanche feniletanol glikozitler(CPHG'ler) Farelerde kronik öngörülemeyen hafif stres (CUMS) tarafından indüklenen depresyon benzeri davranış üzerine. Fareler rastgele kontrol grubu, model grubu, yüksek doz CPHGS grubu (700 mg/kg), orta doz CPHGS grubu (350 mg/kg), düşük doz CPHGS grubu (175 mg/kg) ve fluoksetin grubuna (15 mg/kg) ayrıldı. Dört haftalık karşılık gelen ilaç müdahalelerinden sonra nörodavranışsal testler yapıldı; Enzime bağlı immünosorban deneyi, serumdaki nörotransmitter seviyelerinin yanı sıra hipokampal dokudaki enflamatuar faktörlerin ve aracıların içeriğini tespit etmek için kullanıldı. Hipokampal dokudaki patolojik değişiklikleri gözlemlemek için hematoksilin-eozin ve NISSL boyaması kullanıldı. İmmünohistokimya ve immünofloresan yöntemleri, farelerin hipokampal dokusunda astrosit ve mikroglia yoğunluğunu ve ayrıca Toll benzeri reseptör 4/nükleer faktör κB/NOD-benzeri reseptör protein 3 (TLR4/NF-κB/nf-κB/nf-κB/NF-κB/NF-κB/NF-urs ekspresyon seviyelerini analiz etmek için kullanıldı. Sonuçlar, CPHG'lerin farelerde depresyon benzeri davranışı iyileştirebileceğini, tatlı su tercihini artırabileceğini ve hareketsizlik süresini azaltabileceğini, fare serumunda serotonin ve dopamin seviyelerini önemli ölçüde arttırırken, hipokampustaki enflamatuar aracıların ve faktörlerin ekspresyonunu inhibe edebileceğini gösterdi. İmmünohistokimyasal analiz, CPHG'lerin hipokampustaki astrositlerin yoğunluğunu artırabileceğini, mikroglia aktivasyonunu azaltabileceğini ve NLRP3 inflamomom ile ilişkili proteinlerin ekspresyonunu inhibe edebileceğini gösterdi. İmmünofloresan deneyleri, CPHG'lerin iltihap oluşumunu azalttığı mekanizmanın, hipokampal dokudaki TLR4/NF-κB sinyal yolunun aktivasyonunu azalttığını gösterdi. Özetle, CPHG'lerCUMS kaynaklı depresyon gibi davranış gibi, potansiyel olarak nörotransmitter seviyelerinin düzenlenmesi ve nöroinflamatuar yanıtların inhibisyonu yoluyla, depresyon tedavisinde uygulanması için deneysel kanıtlar sağlar.
Anahtar Kelimeler: Cistanche feniletanol glikozitler; depresyon; nöroinflamatuar yanıt; astrositler; TLR4/NFκB/NLRP3 Yolu
Bitkisel Cistanche Hammaddeler
Depresyon, düşük ruh hali, anhedonya, yavaş düşünme ve fizyolojik disfonksiyon gibi semptomlarla karakterize yaygın ve karmaşık bir duygusal zihinsel bozukluktur. Şiddetli vakalarda, intihar eğilimleri bile meydana gelebilir [1]. "Çinli sakinlerin beslenme ve kronik hastalık durumu raporuna (2020)", ülkemdeki depresyon yaygınlığı%2.1'e ulaştı ve Dünya Sağlık Örgütü tarafından dünyadaki en yüksek sakatlık oranlarına sahip hastalıklardan biri olarak listelendi [2]. Depresyon patogenezi çok karmaşık olduğundan, spesifik mekanizma bugüne kadar belirsizliğini koruyor ve bu da tedavisine büyük bir meydan okuma oluşturmaktadır. Son yıllarda, iç ve yabancı akademisyenler depresyonun bağışıklık inflamatuar aktivasyonu ile yakından ilişkili olabileceğini bulmuşlardır. Merkezi sinir sisteminde inflamatuar yanıt aktivasyonu sürecinde, hipokampal inflamatuar hücrelerin aktivasyonu karakteristik tezahürüdür. Sürekli olarak aktive edilmiş hipokampal inflamatuar hücreler, çoklu inflamatuar sitokinlerin salınmasına neden olur, böylece enflamatuar bir sitokin "kaskad etkisi" oluşturur, böylece depresyon gibi zihinsel hastalıkların patogenezine ve patolojik sürecine katılır [3]. Şu anda, bu hastalığın tedavisi esas olarak fluoksetin, venlaxin, duloksetin, vb. Gibi Batı tıbbına dayanmaktadır. Bununla birlikte, düşük klinik tedavi oranı, belirgin artık semptomlar, yüksek nüks oranı ve klinik uygulamasını sınırlayan organ disfonksiyonuna neden olmaya neden olmak gibi eksiklikler vardır [4]. Geleneksel Çin tıbbı, duygusal hastalıkların tedavisinde daha fazla hedef ve daha az yan etkinin avantajlarına sahiptir ve depresyon tedavisinde ve komplikasyonlarının tedavisinde geniş uygulama beklentileri vardır [5].
Cistanche Deserticolaher ikisi de Orobanchaceae ailesinin bitkileri olan Cistanche Deserticola Ycma ve/veya Cistanche tubulosa (Schenk) Wight fosfor yaprakları ile kurutulmuş etli kökdür. İyi bir yemek ve tıp ürünüdür. Modern farmakolojik araştırma, Cistanche Deserticola'nın nöroprotektif bir etkiye sahip olduğunu doğrulamıştır (Alzheimer hastalığını, Parkinson hastalığını vb. Esas olarak cistanche deserticola'daki feniletanol glikozitlerden oluşan "Cistanche Total Glikozitler" kapsülleri, nörolojik hastalıkların tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır [6]. Feniletanol glikozitler (CPHG'ler), toplam glikozitlerde önemli aktif bileşenlerdir. Anti-tümör, immünomodülasyon ve antioksidan gibi çoklu biyolojik fonksiyonlara sahiptirler ve iyi uygulama beklentileri gösterirler [7]. Önceki çalışmalar, CPHG'lerin monoaminlerin etkilerini koruyabildiğini ve substantia nigra'daki seramid metabolik yolunu ve striatumdaki dopamin (DA) içeriğini artırarak depresif belirtileri hafifletebileceğini göstermiştir [8]; Ayrıca, beyindeki monoamin nörotransmitter seviyesini iyileştirerek perimenopozal sendromlu farelerin depresif benzeri davranışını da ayarlayabilir [9]. Bununla birlikte, kronik öngörülemeyen hafif stres (CUMS) kaynaklı fare depresyon modelinin tedavisinde kullanımı hakkında herhangi bir rapor bulunmamıştır ve etki mekanizması açıklanmaya devam etmektedir. Önceki araştırmalara dayanarak ve anti-oksidatif stresdeki CPHG'lerin mevcut potansiyeli ile birleştiğinde, nöroinflamasyonu düzenleyen ve nöronal apoptozu inhibe eden bu çalışmada, CPHG'lerin ve NLRP3'ün antidepresan etkisini incelemek için CUM'ların indüklenen fare depresyon modelini, TLR4/NF-κB/nlrpb/nlrpb/nlrpb/nlrpb/nlrpb/nlrpb/nlrpb/nlrpb/nlrpb'ün daha fazla ilgisini keşfetmek için daha fazla keşfedilmesi için kullanılmıştır. CPHG'lerin antidepresan etkisi, klinik uygulamasını genişletme ve bir sağlık gıdası olarak geliştirme ve kullanma.
1 Malzeme ve Yöntem
1.1 Malzeme ve Aletler
CPHGS ekstraktı (%40'dan daha büyük veya eşit ekstraktta%85'e eşit veya eşit olan feniletanol glikozitler,%16'dan daha büyük veya eşit verbaskosid; parti numarası: 20231221, Xinjiang hotan dichen ilaç ilaç biyolojik Co., ltd.); fluoksetin hidroklorür kapsülleri (fluoksetin, FLX) (parti numarası: 8533c, Patheon Fransa Pharmaceutical Company, Fransa); 5- hidroksitriptamin (5- ht), DA algılama kiti (parti numarası: 20240305, 20240305, Shanghai Future Industrial Co., Ltd.); İndüklenebilir nitrik oksit sentaz (INOS), siklooksijenaz -2 ({-2, Cox -2), prostaglandin E2 (prostaglandin E2, PGE2), tumor nekroz faktörü alpha (tumor nekrozu, interfin, interthin 1, intert. (interlökin -1, il -1), il -18 (interlökin -18, il {-6}}}}}}}}}), interferon- (interferon (interferon- (interferon), interferon Enzime bağlı immünosorban test kitleri (parti No.: ER050A332132, ER035PD09812, ER048H753146, ER10X6398452, ER051H648219, ER09X28231, ER0971, ER0971, ER0771, ER0973, ER071, ER071, ER071, ER071, ER071, ER071, ER071, ER0771, ER0973, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); İyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1, IBa -1) monoklonal antikor, glial fibriler asidik protein (GFAP) monoklonal antibod, NOD3) NOD-benzeri reseptör protein 3 (NLRP3) monoklonal reseptör protein 3 (NLRP3) monoklonal reseptör protein 3 ( Gr 3417890-15, gr 3379124-30, gr 3285067-28, Abcam, İngiltere); Toll benzeri reseptör 4 (TLR4) monoklonal antikor, fosforile nükleer faktör-κB p65 (fosfo-nükleer faktör-p65, p-nf-κB p65) monoklonal antikor (toplu No. 10032512, 00128965, wuhan saning biyotekoloji Co,); % 4 paraformaldehit, immünofloresan boyama kiti (parti No. 20240106, 20240315, Shanghai Bio-Technology Co., Ltd.); hematoksilin ve eozin (hexa) eozin, He) boyama kiti, NISSL boyama kiti (parti numarası: 20240401, 20240402, liaoning meilun biyolojisi); İmmünohistokimya Evrensel Kit (Parti Numarası: 43731A, Pekin Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd.).
Me2 0 4e 1/10, 000 elektronik denge (Mettler Toledo, ABD); Milli-Q Laboratuvar Saf Su Sistemi (Merck, Almanya); Spectramax ID3 Çok Fonksiyonlu Mikroplaka Okuyucusu (Moleküler Cihazlar, ABD); Leicadm 2000 Floresan Dik Mikroskop (Leica, Almanya); 63008 Açık Alan, 63010 Yükseltilmiş artı labirent, 63022 Zorla Yüzme, DB001 Morris Water Labirent, Akıllı 3.0 Hayvan Davranışı Video Analiz Sistemi (Shenzhen Ruiwode Life Science Technology Co., Ltd.).
60 SPF C57BL/6 faresi, 18-22 g ağırlığındaki Pekin Weitong Lihua Deneysel Hayvan Technology Co., Ltd. (Üretim Lisansı No. SCXK (Pekin) 2020-0033, SYXK (Beijing) 2021-0011), 2021-0011), 2021-0011).
Fareler bir SPF ortamında tutuldu, ortam sıcaklığı (21 ± 2) derecesinde kontrol edildi, nem% 60 ±% 10 ve 12 saatlik açık-karanlık döngüsünde tutuldu. Fareler yiyecek ve suya serbest erişime sahipti ve deney 1 haftalık uyarlanabilir beslemeden sonra başladı. Deney hayvanları, Çin Tıbbı Shaanxi Üniversitesi Deney Hayvan Merkezinde tutuldu. Bu çalışmadaki tüm fare deney prosedürleri, Shaanxi Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Deney Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (SUCMDL20231015003).
1.2 Deneysel Yöntemler
1.2.1 Gruplama, Modelleme ve İlaç İdaresi
7- haftalık SPF C57BL/6 farelerinin 1 haftalık uyarlanabilir beslenmesinden sonra, sonraki deneylerin gereksinimlerini karşılayan elastik olmayan fareler, şeker suyu tercih testi ile tarandı ve rastgele bir kontrol grubu (CON), bir model grubuna (MOD), bir yüksek doz-H; 700 mg), CPHG grubu (CPHGS grubu (CPHGS grubu (CPHGS grubu (CPHGS grubu (CPHG'ler, CPHGS grubu (CPHG'ler, CPHGS grubu ( (CPHGS-M; 350 mg/kg), düşük doz CPHGS grubu (CPHGSL; 175 mg/kg) ve bir fluoksetin grubu (FLX; 15 mg/kg), her grupta 10 fare ile. Con dışında, diğer gruplardaki fareler 4 hafta boyunca cums stresine maruz kalmaya başladı [10]. Kısıtlama (1 saat), sallama (1 saat), kuyruk süspansiyonu (1 saat), 45- derece kafes eğim (24 saat), boş kafes (24 saat), gece lambası (12 saat), 5 dakika boyunca 4 derece sıcak su yüzme 5 dakika için 4 derece sıcak su yüzme dahil olmak üzere toplam 10 stres faktör kullanıldı. Her gün rastgele iki uyaran seçildi ve aynı uyaran art arda iki günde görünmedi. 4 haftalık modellemeden sonra, CPHGS-H, CPHGS-M ve CPHGS-L farelerine, vücut ağırlığına göre gavaj ile karşılık gelen CPHGS dozları verildi ve FLX farelerine gavaj (10 mg/kg) ile fluoksetin verildi. Farelerde CPHGS-M ve FLX'in dozu, yetişkinler ve fareler arasındaki vücut yüzeyi alanının eşdeğer katsayısına göre dönüştürüldü ve 2 kez dalgalanma düşük ve yüksek dozlarda CPHG'lerdi. Con ve mod farelerine gavaj ile eşit hacimde deiyonize su verildi. Fareler 4 hafta boyunca günde bir kez gavalandı. 8. haftada nörobehavioral testler yapıldı.
1.2.2 Nörodavranışsal Deney
1.2.2.1 Şeker suyu tercih deneyi
Sükroz tercih testinden (SPT) önce, fareler tek bir kafese yerleştirilmeli ve daha sonra 3 gün boyunca şeker suyuna adapte edilmelidir. İlk gün, 24 saat boyunca iki şişe% 1 sükroz suyu verildi ve ikinci gün 24 saat boyunca bir şişe şeker suyu ve bir şişe deiyonize su verildi. Üçüncü gün, şeker suyu ve saf su pozisyonları 24 saat boyunca değiştirildi ve deney 24 saat sonra sona erdi. Dördüncü gün, fareler 24 saat boyunca oruç tutuldu ve sudan yoksun bırakıldı. Beşinci gün, tartıldıktan sonra bir şişe şeker suyu ve bir şişe saf su verildi ve pozisyonlar 12 saat sonra değiştirildi. 24 saat sonra iki şişe çıkarıldı ve tekrar tartıldı ve şeker suyu tüketim oranı hesaplandı (şeker suyu tüketim oranı=şeker suyu tüketimi/(şeker suyu tüketimi + su tüketimi) ×%100).
1.2.2.2 Saha Testi Açık
Açık saha testi (OFT) 50 cm x 50 cm x 50 cm küp açık kutuda gerçekleştirildi. Kutunun merkezi, 25 cm'lik bir yan uzunluğa sahip bir kare olarak tanımlandı. Fareler kutunun ortasına yerleştirildi ve 5 dakika adapte olmasına izin verildi. Farelerin hareket yörüngesi son 5 dakika içinde analiz edildi. Değerlendirme göstergeleri, farelerin açık alandaki toplam hareket mesafesini, açık alanın ortasındaki etkinlik süresini ve merkeze kaç kez girdiklerini içeriyordu. 1.2.2.3 Kuyruk Süspansiyon Testi Kuyruk süspansiyon testi (TST), fareyi kuyruğu ile askıya almaktır, böylece başı yerden belirli bir mesafede tutulur. Farelerin 6 dakika içinde mücadelesi kaydedildi ve son 4 dakikada farelerin hareketsizlik süresi analiz edildi.
1.2.2.4 Zorla Yüzme Testi
Zorla yüzme testi (FST), fareleri (25 ± 2) derece su ile doldurulmuş şeffaf bir silindirik namluya (15 cm çapında × 50 cm yükseklik) yerleştirmektir ve su seviyesi 20 cm'ye ulaşır. Farelerin 6 dakika içinde sudaki mücadele edilmesi kaydedildi ve son 4 dakika içinde farelerin hareketsizlik süresi analiz edildi.
1.2.3 Örnek Toplama
8. haftanın sonunda fareler, intraperitoneal sodyum pentobarbital (%3, 10 mL/kg) enjeksiyonu ile derinden anestezi uygulandı. Anesteziden sonra, anestezi durumu, yavaş nefes alma, kas gevşemesi ve cerrahi ameliyata yanıt verilmesiyle doğrulandı. Daha sonra farelerin kanı göz çıkarılarak toplandı ve fareler servikal çıkık ile öldürüldü. Kalp salin ile perfüze edildi ve daha sonra beyin hızla açıldı ve sağlam beyin çıkarıldı. Önceden soğutulmuş salin ile durulandı ve yarısı 72 saat boyunca% 4 paraformaldehid ile sabitlendi; Diğer yarının hipokampal dokusu buz üzerinde ayrıldı ve daha sonra kullanım için sıvı azot içinde saklandı. 10 mg fare hipokampal doku örneği alın, 1: 9 kütle hacim oranına önceden soğutulmuş fizyolojik salin ekleyin ve bir buzlu su banyosunda mekanik olarak homojenleştirin. Homojenizasyondan sonra, 15 dakika boyunca 4 000 r/dk'da santrifüj (santrifüj yarıçapı 4.5 cm), tespit için süpernatanı toplayın.
1.2.4 Neurotransmitter indeksinin belirlenmesi
Uygun miktarda fare serumu ve hipokampal doku homojenat süpernatantını alın ve kit çalışma yöntemine göre 5- HT ve DA içeriğinin içeriğini tespit edin.
1.2.5 Hipokampal doku biyokimyasal indeksinin belirlenmesi
Hipokampal doku homojenatının süpernatantını alın ve protein konsantrasyonunu belirlemek için BCA kitini kullanın. Kit talimatlarına göre, enflamatuar aracıların (INOS, Cox -2 ve PGE2) ve enflamatuar faktörlerin (TNF, IL -1, Il {4}}, IL -6, IL -6, Ifn-), hippokampal homatın süpernatanında belirlenir. işaretleyici ve her maddenin içeriği hesaplanır ve veriler kaydedilir ve istatistiksel olarak analiz edilir.
1.2.6 Hipokampal doku boyaması
72 saatten fazla sabitlenmiş tüm beyin dokusu örnekleri alındı ve parafin kesitleri 4 uM kalınlığında yapıldı. After dewaxing with xylene, the samples were hydrated with gradient ethanol (immersed in 100% ethanol I and II for 5 min, and in 95%, 90%, 80% and 70% ethanol for 2 min respectively), and washed three times with PBS, stained with eosin for 5 min, rinsed in tap water for 5 min, counterstained with hematoxylin for 1 min, differentiated with 1% hydrochloric Asit etanol 2 saniye boyunca ve 10 dakika boyunca musluk suyunda durulandı. Gradyan etanol (2 dakika boyunca% 80 etanol, 2 dakika boyunca% 95 etanol, her biri 5 dakika boyunca etanol I ve% 100 etanol II), ksilen ile şeffaflaştırılmış, nötr sakız ile kapatılmış ve hava ile kurutulmuş. Her fare grubundaki hipokampal doku hücrelerinin morfolojik değişiklikleri bir mikroskop altında gözlendi.
1.2.7 Hipokampal dokunun NISSL boyaması
"1.2.5" altında hazırlanan parafin kesitleri dewaksed ve nemlendirildi, daha sonra 10 dakika boyunca NISSL boyama çözeltisi ile boyandı, her seferinde 3 dakika boyunca damıtılmış su ile yıkandı, gradyan etanol (2 dakika boyunca% 80 etanol,% 95 etanol için% 95 etanol 2 dakika boyunca 2 dakika boyunca 2 dakika boyunca 2 dakika, 5 dakika II,% 5 dakika II, etanol I II, nötralize edilmiş, nötralize edilmiş ve nötralize edilmiş ile kaplı ve nötralize edildi. Her fare grubundaki hipokampal doku hücrelerinin morfolojik değişiklikleri bir mikroskop altında gözlendi.
1.2.8 Hipokampal doku immünohistokimyası
Parafine gömülü hipokampal doku örnekleri, evrensel immünohistokimya kitinin talimatlarına göre immünohistokimya (IHC) boyaması ile işlendi. Dewaxing, hidrasyon, antijen onarımı, peroksidaz bloke edilmesi ve bloke edilmesinden sonra, IBA -1 (1: 400), GFAP (1: 400), LRP31: 300) ve kaspsae1 (1: 400) birincil antikorlar, gece boyunca gece boyunca ilave edildi ve inkübe edildi. DAB renk gelişimi, nükleer boyama, dehidrasyon ve sızdırmazlıktan sonra, Iba1, GFAP, NLRP3 ve kaspların pozitif ekspresyonu bir ışık mikroskobu altında gözlendi ve görüntüler J ile analiz edildi.
1.2.9 Hipokampal dokunun immünofloresan tespiti
Parafine gömülü hipokampal doku örnekleri, immünofloresan kitinin talimatlarına göre immünofloresan boyama ile işlendi. "1.2.5" altında hazırlanan parafin bölümleri dewaxed, nemlendirildi, antijen onarıldı ve bloke edildi ve daha sonra TLR4 (1: 400) ve P-NF-κB p65 (1: 200) birincil antikorlar, bölümlere ilave edildi ve gece boyunca 4 derece inkübe edildi. Birincil antikor ertesi gün çıkarıldı, üç kez PBS ile yıkandı ve ikincil antikor (1: 500) ilave edildi ve karanlıkta 1 saat süreyle inkübe edildi. Üç kez yıkandıktan sonra, bölümler DAPI içeren bir fiksatif ile kapatıldı. Hipokampal doku alanının floresan sinyali floresan mikroskopisi ile gözlendi ve görüntüler Image J ile analiz edildi.
1.3 Veri İşleme
Deneysel veriler istatistiksel olarak SPSS 26 istatistiksel yazılım kullanılarak analiz edildi. 0 ve GraphPad Prism 9. 0. Veriler ortalama ± standart sapma (x ± S) olarak ifade edildi ve analiz, tek yönlü ANOVA kullanılarak gerçekleştirildi. İki grup arasındaki karşılaştırma Dunnett'in testi kullanılarak yapıldı. P<0.05 indicated that the difference was statistically significant.
