Bitkisel Madde Acteoside'ın Tümör Hücrelerine Karşı Seçici Sitotoksisitesi ve Mekanistik Anlayışları
Mar 14, 2022
İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com
Christina Cheimonidi ve diğerleri
ÖZ
Doğal ürünler aşırı yapısal çeşitlilik ile karakterize edilir ve bu nedenle yeni anti-tümör ajanlarının tanımlanması için benzersiz bir kaynak sunarlar. Burada, bitkisel maddeninasteositLippia citriodora yapraklarından gelişmiş fitokimyasal yöntemlerle izole edilmek, metastatik tümör hücrelerine karşı gelişmiş sitotoksisite gösterdi; çeşitli sitotoksik ajanlar ve hassaslaştırılmış kemoreztant kanser hücreleri ile sinerji içinde hareket etti.Acteosidefizyolojik hücresel bağlamlarda toksik değildi, oksidatif yükü arttırırken, proteostatik modüllerin aktivitesini etkilerken ve tümör hücre dizilerinde matris metaloproteinazları bastırdı. Bir melanom fare modelinde intraperitoneal veya oral (içme suyu yoluyla) ateozid uygulaması, tümörlerde antioksidan tepkileri yukarı regüle etti; yine de, yalnızca intraperitoneal uygulama, tümör büyümesini baskıladı ve anti-tümör reaktif bağışıklık tepkilerini indükledi. Kütle spektrometrisi tanımlama/kantitasyon analizleri, intraperitoneal iletiminasteositoral uygulamaya kıyasla, bileşik konsantrasyonunun, tedavi edilen farelerin plazma ve tümörlerinde önemli ölçüde daha yüksek olmasıyla sonuçlanmıştır; bu, in vivo anti-tümör etkisinin, uygulama yoluna ve tümörde elde edilen konsantrasyona bağlı olduğunu düşündürür. Son olarak, moleküler modelleme çalışmaları ve enzimatik aktivite deneyleri göstermiştir ki,asteositprotein kinaz C'yi inhibe eder. Sonuç olarak, acteoside, yeni anti-tümör ajanlarının geliştirilmesi için kimyasal bir yapı iskelesi olarak umut vaat ediyor.
Anahtar Kelimeler:Acteoside, Kanser, Doğal bileşik, Oksidatif stres, Proteostaz, İmmünomodülasyon
1. Giriş
Karsinojenez, çeşitli hücre sinyal yollarının deregülasyonu ile karakterizedir ve artan hücresel oksidatif, replikatif, metabolik, genotoksik ve proteotoksik stres ile ilişkilidir [1]. Bu stres fenotiplerini uyarlamak ve üstesinden gelmek için, malign hücreler, devam eden stresi baskılamayı veya (en azından) hafifletmeyi amaçlayan birkaç onkogenik olmayan yolu (onkogenlerden ayrı olarak) yukarı regüle eder. Tümör oluşumu sırasında sıklıkla yukarı doğru düzenlendiği bulunan çeşitli onkojenik olmayan yollar arasında, hücresel antioksidan yanıtlarla birlikte proteostaz ağının (PN) modülleri bulunur [2,3].
PN'nin temel bileşenleri, hücresel moleküler şaperonların ağı ile birlikte Otofaji-Lizozom yolu (ALP) ve Ubiquitin-Proteasom Yolu (UPP) olmak üzere iki ana bozunma mekanizmasıdır. ALP, esas olarak protein agregatlarının ve hasarlı organellerin bozulmasında rol oynar [4], UPP ise normal kısa ömürlü proteinleri ve onarılamayan yanlış katlanmış veya katlanmamış proteinleri [5-8] bozar. 26Seukaryotik proteazom, 19S düzenleyici partiküllerden (RP) ve 20 Skor partikülünden (CP) oluşur; ikincisi, fıçı benzeri bir yapı oluşturan dört istiflenmiş heptamerik halkadan (iki tipi çevreleyen iki tip) oluşur. Kimotripsin benzeri (CT-L), tripsin benzeri (TL) ve kaspaz benzeri (CL) proteazom peptidaz aktiviteleri sırasıyla 5, 2 ve 1 proteazomal alt birimde bulunur [6]. Proteazom inhibitörleri Bortezomib (Velcade®; ayrıca PS-341 olarak da adlandırılır) ve Carfifilzomib'in çeşitli hematolojik malignitelere [9] karşı kanıtlanmış klinik etkinliği, umut verici bir strateji olarak UPP'yi hedeflemenin "kavram kanıtını" sağlamıştır. kanser tedavisi. Karsinojenez sırasında sıklıkla yukarı regüle edilen hücresel antioksidan savunma yollarının karmaşık ağı [3,10], antioksidan enzimlerin yanı sıra sitoprotektif genomik tepkileri harekete geçiren çeşitli transkripsiyon faktörlerini içerir; bunlara çatal uçlu kutu O (Foxo) ve nükleer faktör eritroid 2-ilgili faktör (Nrf-2) dahildir. Nrf-2, antioksidan ve faz II genlerinin [11-13] ifadesini uyardığı için hücrelerin oksidatif ve/veya ksenobiyotik hasara karşı korunmasında merkezidir.
Biz ve diğerleri yakın zamanda, bu tümör bağımlılıklarını (yani, proteostatik modüller ve/veya antioksidan yanıt yolları) hedeflemenin veya dönüştürülmüş bir genotip bağlamında hücresel ROS seviyelerinin arttırılmasının, tümör hücrelerinin seçici olarak öldürülmesi için potansiyel bir terapötik pencere sunduğunu öne sürdük [3 ,14]; Destek olarak, hücresel ROS seviyelerini yükselten küçük bir molekül tarafından kanser hücrelerinin seçici olarak öldürüldüğü bildirilmiştir [2]. Anti-tümör reaktif immün yanıtların aktivasyonunu da içeren kombinatoryal yaklaşımların [15] PN ve antioksidan yanıtları inhibe ederek ve/veya hücresel ROS seviyelerini yükselterek sunulan terapötik pencereyi büyük olasılıkla en üst düzeye çıkarması beklenmektedir.
Çeşitli kaynaklardan (bitkiler, deniz organizmaları, mikroorganizmalar, vb.) elde edilen doğal ürünler (özler veya saf bileşikler) (NP'ler), aşırı yapısal çeşitlilikleri ve kimyasal karmaşıklıkları nedeniyle anti-tümör ajanları olarak hareket etme yetenekleri açısından taranır. birkaç hücresel sinyal yolunu pleiotropik olarak modüle ederler [16]. Bildirildiğine göre, NP'ler anti-inflamatuar, anti-tümör ve/veya anti-metastatik tepkileri aktive eder [16,17] ve ayrıca çoklu ilaç direncinden de kaçar [18,19]. Bunlar arasında, fenolik bileşikler (feniletanoid glikozitler dahil), çeşitli insan hastalıklarının önlenmesinde ve/veya tedavisinde rapor edilmiş rolleri nedeniyle büyük ilgi görmüştür.
Kullanım veya verbascoside [20] olarak da adlandırılan Acteoside, birçok dikotiledondan izole edilen bir feniletanoid glikozittir. Bildirildiğine göre, acteoside, antioksidan, anti-inflamatuar ve hücre apoptozu düzenleyici özellikler dahil olmak üzere bazı ilginç biyolojik aktiviteler uygular [21,22]. Bununla birlikte, potansiyel anti-tümör aktivitesi ele alınmamıştır. Burada, akteositin, fizyolojik hücresel bağlamlarda hiçbir belirgin toksik etki olmaksızın memeli kanser hücrelerine karşı artan sitotoksisite gösterdiğini bildiriyoruz. Ayrıca, ateozid, Vivo fare modelinde (diğerlerinin yanı sıra) anti-tümör reaktif bağışıklık tepkilerini aktive ederek melanom tümör büyümesini bastırdı.
2. Malzemeler ve yöntemler
2.1. Bitki materyali ve ekstraksiyon
kurutulmuş Lippia citriodora (Lamiaceae) yaprakları (4,5 kg), Yunanistan'ın Atina kentindeki yerel pazardan satın alınmıştır. Yapraklar toz haline getirildi ve metanol (2 x 20 L) ile 12 saat mekanik karıştırılarak özü çıkarıldı. Metanolik öz, kuruyana kadar buharlaştırıldı ve bir CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 L) karışımı ile yıkandı. Çözünmeyen kalıntı ayrıldı ve kurutularak yeşil-sarı bir toz (450 g) üretildi.
2.2. Acteoside ve UPLC-HRMS analizinin saflaştırılması
Yukarıda bahsedilen tortunun bir kısmı (10 g), bir hızlı santrifüj bölme kromatografisi (FCPC) cihazı (Kromaton, Fransa) kullanılarak karşı akım kromatografisine tabi tutuldu; 5/0.5/4.5 oranında bir EtOAc/EtOH/H20 karışımı iki fazlı bir solvent sistemi olarak kullanıldı. Toplanan fraksiyonlar, İnce Tabaka Kromatografisine tabi tutuldu; daha sonra kromatogramlar bir UV lambası (254 ve 365 nm) altında gözlendi ve metanol vanilin sülfat püskürtülerek ve ardından iki dakika ısıtılarak görselleştirildi. Yukarıda bahsedilen işlem ile toplam 2,1 g asteosit (saflık yüzde 90'dan büyük veya buna eşit) izole edildi. Akteositin tanımlanması nükleer manyetik rezonans (NMR) ve kütle spektrometrisi (MS) spektrumları ile gerçekleştirilirken, saflığı UPLC-MS ve NMR analizi ile belirlenmiştir; ayrıntılar için bkz. Malzemeler ve yöntemler.
2.3. hücre hatları
B16.F1, B16.F10, YAC-1 ve WEHI-164 fare hücre hatları ile birlikte insan akciğer embriyonik fibroblastları (IMR90 hücreleri), American Tissue Culture Collection'dan (ATCC) elde edildi. U2 OS ve Sa OS insan osteosarkom hücre dizileri, Prof. V. Gorgoulis (Tıp Fakültesi, Atina Ulusal ve Kapodistrian Üniversitesi, Yunanistan) tarafından bağışlanmıştır, KH OS osteosarkom hücreleri ve kemoreztant osteosarkom hücre dizileri [23] Dr. E. Gonos'un bağışı (Ulusal Helenik Araştırma Vakfı, Yunanistan). Fare kanseri hücre dizileri C5N ve A5, çok aşamalı bir fare derisi karsinogenez modeline [24,25] aittir ve Prof. A. Balmain (Comprehensive Cancer Center, California Üniversitesi, ABD) tarafından bağışlanmıştır. Kullanılan hücre hatlarının kültürleme koşulları Suppl. Malzemeler ve yöntemler.
yararıcistanche acteoside
2.4. Melanom fare modeli erkek
C57BL/6 fareleri (25-30 g ağırlık, 6-8 haftalık) Hellenic Pasteur Enstitüsü'nden alındı ve kontrollü sıcaklık (22 derece) ve fotoperiyot (12 saat aydınlık:12 saat karanlık) altında barındırıldı. ) su ve yiyeceğe ücretsiz erişim. Farelere deri altından 105 B16.F1 melanom hücresi (100 uL PBS içinde) aşılandı ve rastgele 3 gruba (n=5/grup) ayrıldı. Tümörler hissedilir hale geldiğinde(11. gün) fareler iki yoldan akteozid aldı; ya intraperitoneal olarak (IP) (200 μL PBS içinde seyreltilmiş 1 mg/fare; gün aşırı uygulanan toplam 6 doz) ya da içme suyuyla (OR) ağızdan (2.5 mg/fare; birbirini takip eden 13 gün boyunca toplam 13 doz). Kontrol farelerine PBS uygulandı. Tümör büyümesi, oluşturulan tümörlerin büyük ve küçük eksenleri dijital bir kumpas ile ölçülerek 2 günde bir kaydedildi. Ölçümler, formül kullanılarak tümör hacmine dönüştürüldü: tümör hacmi (cm3)=ana eksen x küçük eksen2 x 0,5. 28. günde hayvanlara servikal dislokasyon ile ötenazi uygulandı ve dalaklar aseptik olarak çıkarıldı. Deney, benzer bulgularla üç kez tekrarlandı.
Splenositler tek tek homojenize edilmiş dalaklardan izole edildi ve B16.F1, YAC-1 ve WEHI-164 hücre hedeflerine karşı sitotoksisiteleri için hemen test edildi. Sitotoksisite, efektör hücre degranülasyonunun bir sonucu olarak hücre yüzeyinde CD107 maruziyetinin saptanmasına dayalı olarak değerlendirildi. Splenositler (105 hücre/kuyu), yüzde 5 CO2 içinde 37 derecede, 100:1 efektör/hedef (E:T) oranında 96-kuyu U tabanlı mikroplakalarda hedeflerle birlikte kültürlendi. FITC-konjuge anti-CD107a ve anti-CD107b monoklonal antikorları (25 uL/mL) ve monensin (6 uL/mL; tümü BD Biosciences'dan) her oyuğa ilave edildi. Hücreler 6 saat sonra toplandı ve bir FACSCanto II akış sitometresi kullanılarak analiz edildi. Paralel olarak, tümörler Eksize edildi ve Suppl. Malzemeler ve yöntemler.
cistanche acteoside
