Cistanche Tubulosa Ⅱ'dan Sükroz Sentazının Gen Klonlaması, Fonksiyonel Tanımlaması, Yapısal ve Ekspresyon Analizi

Sonuçlar ve analiz

1 Cistanche tubulosa'da sükroz sentaz genlerinin madenciliği ve CtSus geninin klonlanması

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>hava kısmı.

Erkek Sağlığına Yönelik Yüksek Kaliteli Cistanche Tubulosa

Bu nedenle Cistanche tubulosa'nın farklı bölümlerinin transkriptom verilerinde ilk taramada elde edilen iki aday sükroz sentaz geninin ekspresyon düzeyi FPKM değerleri Z-Score ile normalleştirildi ve diferansiyel analiz yapıldı (Şekil 1A). Sonuçlar, CtSus geninin haustoryumda en yüksek ekspresyon seviyesine sahip olduğunu ve yeraltı kısmındaki ekspresyon seviyesinin, Cistanche tubulosa'nın farklı kısımlarındaki glikozit bileşiklerinin birikim modeliyle tutarlı olarak yer üstü kısmındaki ekspresyon seviyesinden daha yüksek olduğunu gösterdi. CtSus1 geninin haustoryumdaki ekspresyon düzeyi ise düşüktü. Bu nedenle yukarıdaki sonuçlara dayanarak CtSus geni daha sonraki dizi amplifikasyonu, ekzojen ekspresyon ve fonksiyonel tanımlama için seçildi. Şablon olarak Cistanche tubulosa cDNA kullanılarak, PCR amplifikasyonundan sonra ~2500 bp'de tek bantlı bir ürün elde edildi (Şekil 1B). PCR ürünü jelden geri kazanıldı ve klonlama vektörüne bağlandı ve dizileme yoluyla hedef genin tam uzunluktaki kodlama bölgesi elde edildi. CtSus dizisinin uzunluğu 2418 bp idi.

Şekil 1 C. tubulosa'dan CtSus'un gen keşfi ve klonlanması ve kodlanmış proteinin biyoinformatik analizi. C: C. tubulosa'nın farklı kısımlarındaki CtSus ve CtSus1 genlerinin FPKM değerlerine göre Z-Skorları olarak normalize edilmiş ekspresyon seviyeleri; B: CtSus'un gen amplifikasyonu; M: DNA işaretleyici;C: SMART tarafından tahmin edilen CtSus proteininin konservatif alanı; D: Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum ve Albuca bracteata dahil olmak üzere diğer bitkilerden tanımlanan CtSus ve sükroz sentezlerinin çoklu sekans hizalaması. Sükroz sentez alanı ve şeker transfer alanı sırasıyla kırmızı ve mavi kutularla temsil edilir; E: Diğer bitkilerden elde edilen CtSus ve sükroz sentezlerin filogenetik analizi; F: E. coli'de pCold™ I vektörü kullanılarak CtSus'un heterolog ifadesinin SDS-PAGE analizi. Şerit 1: Protein işaretçisi; Şerit 2: Süpernatan fraksiyonu; Şerit 3: Çökelti kırılması. Kırmızı ok CtSus proteinini gösterir. G: Her iki rekombinant plazmidi içeren tek bir klonun koloni PCR'si. M: DNA işaretleyici; 1: pet-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

Tablo 2 CtSus ve diğer bitkilerden tanımlanan sükroz sentazları arasındaki amino asit dizisi benzerlikleri

2.3 Filogenetik analiz

MEGA yazılımı tarafından oluşturulan filogenetik ağaç, Cistanche tubulosa'dan gelen sakaroz sentaz CtSus ile diğer bitki kaynaklı sakaroz sentazları arasındaki filogenetik ilişkiyi analiz etmek için kullanıldı. Sonuçlar Şekil 1E'de gösterilmektedir. Bitki türevi sakaroz sentezleri, dikotlarda (bölge I ve II) ve monokotlarda (bölge III) farklı evrimsel dallar gösterir. CtSus dikot dalındadır ve CtSus ile en yakın akraba olan dizilerin tümü Lamiaceae bitkilerindendir (Cistanche tubulosa bir Lamiaceae Orobanchaceae bitkisidir), diğer dal ise esas olarak Solanales bitkilerinden oluşur, bu da ayrıca yüksek koruma ve korumayı gösterir. Bitki türevli sükroz sentaz genlerinin bitkilerin evriminde aynı sırayla homolojisi. Bunlar arasında, Orobanchaceae bitkisinin Phelipanche ramosa'sından elde edilen sakaroz sentaz PrSus (AEN79500.1), CtSus ile en yakından ilişkilidir.

3 CtSus'un ekzojen ifadesi ve aktivite analizi

3.1 CtSus geninin ekzojen ekspresyonu Dizilemeyle doğrulanan pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus ve pCold™ I-CtSus plazmitleri, ekspresyon yetkin E. coli Transetta'ya (DE3) aktarıldı, ve pozitif klonlar, dizi doğrulaması için koloni PCR ile tarandı. Elde edilen rekombinant ekspresyon suşları, protein ekspresyonu için IPTG düşük sıcaklık ile indüklendi, bakteriler santrifüjleme yoluyla toplandı ve süpernatantı ve çökeltiyi elde etmek için bakterileri parçalamak üzere lizis tamponu ilave edildi ve tespit için SDS-PAGE yapıldı. Sonuçlar, ifade vektörleri olarak pET-28a ve pET-24b kullanıldığında, CtSus'un E. coli'de ifade edilmediğini, ifade vektörü olarak pCold™ I kullanıldığında ise net bir CtSus olduğunu gösterdi. ~100 kDa bölgesinde rekombinant protein bandı tespit edildi; bu, teorik olarak tahmin edilen 92,2 kDa'lık bağıl moleküler kütlesiyle tutarlıydı (Şekil 1F).

3.2 Tam hücre dönüşümü

CtSus'un katalitik fonksiyonunun ön doğrulamasını yapmak amacıyla, CtSus ve glikosiltransferaz geni UGT71BD1'in ortak ekspresyon suşu oluşturuldu. UGT71BD1, Cistanche tubulosa'dan klonlanmış ve tanımlanmıştır ve feniletanoid glikozitler, farklı flavonoid türleri, stilben ve kumarin gibi aromatik bileşikleri reseptör olarak yaygın şekilde kabul edebilen ve UDP-glikoz kullanarak substrat fenolik hidroksil grubunun glukozilasyon reaksiyonunu katalize edebilen bir UDP-glukoziltransferazdır. şeker donörü olarak [18]. CtSus'un eklenmesi teorik olarak UGT71BD1 tarafından katalize edilen glukozilasyon reaksiyonu için daha yeterli glikosil donör UDP-glikozu sağlayabilir, böylece reaksiyon dengesinin glikosilasyon ürünlerinin oluşumuna doğru ilerlemesini teşvik eder ve böylece glikosilasyon ürünlerinin verimini arttırır. pCold™ I-CtSus plazmidi ve pET-28a-UGT71BD1 plazmidi eş zamanlı olarak ekspresyon yetkin E. coli Transetta'ya (DE3) dönüştürüldü. Her iki rekombinant plazmiti içeren tek klonlar koloni PCR ile tarandı ve dizi doğrulaması yoluyla pozitif rekombinant ekspresyon suşları elde edildi (Şekil 1G). İkili gen ortak ekspresyonu in vitro olarak indüklendi ve pET-28aUGT71BD1 tek gen ekspresyon suşu kontrol grubu olarak kullanıldı. CtSus'un UDP-glikoz donörünün oluşumunu katalize etmedeki aktivitesi, ilk olarak tam hücre dönüşümüyle doğrulandı. HPLC ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresinin sonuçları, substratlar olarak akonitin 1 ve resveratrol 2 ile tam hücre dönüşüm reaksiyonu gerçekleştirildiğinde, Şekil 2'de gösterildiği gibi 24 saatlik dönüşüm sonrasında bariz glikosilasyon ürünlerinin üretiminin tespit edildiğini gösterdi.

Şekil 2 Sırasıyla UGT71BD1'i barındıran rekombinant suş veya CtSus ile UGT71BD1 bağlanmasını barındıran rekombinant suş tarafından substrat 1 veya 2'nin tam hücre biyotransformasyonu. A: Substrat 1'in tam hücre biyotransformasyonunun HPLC kromatogramları. Tespit dalga boyu 360 nm idi; B: ürün 1a'nın HRESI-MS ve MS2 spektrumları; C: Substrat 2'nin tüm hücre biyotransformasyonunun HPLC kromatogramları; Tespit dalga boyu 330 nm idi. D: Ürün 2a ve 2b'nin HRESI-MS spektrumları

Ne zaman 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, moleküler formül C9H6O4) substrat olarak kullanıldı, ürün kromatografik zirvesi 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, öngörülen moleküler formül C15H16O9) 5,39 dakikada tespit edildi; bu, UV ile tutarlıydı. substratın ve kontrol ürününün emilimi. Aynı zamanda, 1a'nın bir glikoz molekülünü (162 Da) kaybetmesiyle üretilen 1a'nın MS2 spektrumunda m/z 179.033 4 [M+H]+'lık bir parça zirvesi tespit edildi; 1a, bir glikoz molekülüne bağlı substrat 1'in ürünüdür. Dönüşüm oranı, tepe alanının entegre edilmesiyle hesaplandı. Glikosile edilmiş ürün 1a'yı oluşturmak için substrat 1'i katalize eden UGT71BD1 tam hücrelerinin dönüşüm oranının %71,87 olduğu, CtSus ilavesinin ise reaksiyonun dönüşüm oranını %95,84'e (kontrol grubununkinin 1,3 katı) arttırdığı bulunmuştur. Substrat bileşik 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, moleküler formül C14H12O3) olduğunda, ürün kromatografik zirveleri 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, öngörülen moleküler formül C20H22O8) ve 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, tahmin edilen moleküler formül C26H32O13) substratın ve kontrol ürününün karakteristik UV absorpsiyonuyla tutarlı, sırasıyla 10,32 ve 6,52 dakikada tespit edildi . Bir glikoz molekülünün (162 Da) kaybıyla üretilen 3 [MH]-'de bir parça zirvesi tespit edildi; bu, 2a'nın, bir glikoz molekülüne bağlı substrat 2'nin ürünü olduğunu gösterir. Literatürdeki verilerle [18] ve kütle spektrometresi tahmin bilgileriyle karşılaştırıldığında ürün 2b'nin iki glikoz molekülüne bağlı substrat 2'nin ürünü olduğu belirlendi. Dönüşüm oranı entegre tepe alanı kullanılarak hesaplandı. CtSus eklenmesinin, substrat 2'nin glikosilasyon reaksiyonunun dönüşüm oranını %64,01'den %78,51'e artırabildiği, bunların arasında monosakarit ürünü 2a'nın veriminin %45,09'dan %63,58'e ve disakkarit ürünü 2b'nin veriminin arttığı bulunmuştur. %18,92'den %14,93'e değişti.

3.3 CtSus rekombinant proteininin saflaştırılması ve in vitro enzimatik aktivitenin tanımlanması

Tüm hücre dönüşümü deneyinin sonuçları, CtSus'un aktif glikoz donörü UDP-glikoz üretimini katalize etme aktivitesine sahip olduğunu göstermektedir. Bu katalitik aktiviteyi in vitro enzimatik katalitik reaksiyon yoluyla doğrudan doğrulamak amacıyla, pCold™ ekspresyon sistemindeki CtSus geninin füzyon proteini ayrıldı ve afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. Sonuçlar, ekspresyon vektörü olarak pCold™ I kullanıldığında, rekombinant proteinin büyük miktarlarda, ancak çoğunlukla çökeltide eksprese edildiğini gösterdi. Ekspresyon vektörü olarak pCold™ TF kullanıldığında, CtSus geni E. coli'de büyük miktarlarda eksprese edildi (Şekil 3A). Füzyon proteini HisTrap FF afinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve in vitro enzimatik katalitik reaksiyona tabi tutuldu. Sonuçlar Şekil 3B'de gösterilmektedir. Substrat olarak sükroz ve UDP kullanıldığında, negatif kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, 10.32 dakikada yeni bir ürün zirvesi tespit edildi. Tutulma süresi ve UV emilimi UDP-glikoz ile tutarlıydı. Ürünün standartla karşılaştırıldığında UDP-glikoz olduğu kanıtlandı. Bununla birlikte, pCold™ TF ekspresyon vektörü tarafından eksprese edilen füzyon proteini büyük bir tetikleyici faktör çözünür etiketi içerdiğinden (etiket protein boyutu 48 kDa'dır), proteinin katalitik aktivitesi üzerinde büyük bir etkiye sahip olacaktır. Bu nedenle füzyon proteininin etiketi, Faktör Xa enzimi tarafından daha da kesildi ve eksojen etiketleri olmayan CtSus proteini saflaştırıldı (Şekil 3A). Protein, in vitro enzimatik katalize tabi tutuldu ve sonuçlar, UDP-glikoz veriminin %3,53'ten %10,66'ya yükseldiğini gösterdi.

(Şekil 3B). Yukarıdaki sonuçlar, CtSus'un in vitro enzimatik kataliz yoluyla UDP-glikoz üretimini katalize etme aktivitesini doğruladı ve ayrıca büyük bir afinite etiketinin varlığının, CtSus'un çözünür ekspresyonuna yardımcı olduğunu, ancak aynı zamanda önemli ölçüde etkileyeceğini de gösterdi. Enzimin vitro katalitik aktivitesi.

Şekil 3 CtSus'un heterolog ifadesi ve fonksiyonel tanımlanması. A: CtSus proteinlerinin SDS-PAGE analizi. Şerit 1: Protein işaretçisi; Şerit 2: Tetikleme faktörlü rekombinant CtSus; Şerit 3: Kırmızı okla etiketlenmiş CtSus proteinini vermek için Faktör Xa proteaz kullanılarak faktör etiketi bölünmesini tetikleyin. B: Referans standardı UDP-glikoz ile sırasıyla sakaroz ve UDP varlığında UDP-glikoz sentezini katalize etmek için füzyon proteini ve tetikleyici faktör içermeyen CtSus proteinlerini kullanan in vitro enzimatik analizler. Haşlanmış protein aynı koşullar altında kontrol grubu olarak kullanıldı. Tespit dalga boyu 260 nm idi