PEDV'nin Rekombinant Lactobacillus Casei Aşısının Yapılışı ve Farelerde İmmün Yanıtları
Sep 06, 2023
Soyut
Arka plan: Domuz salgını ishali (PED), domuz salgını ishal virüsünün (PEDV) neden olduğu, kusma, ishal, anoreksi ve dehidrasyon ile karakterize olan ve dünya çapında büyük ekonomik kayıplara neden olan bulaşıcı bir bağırsak hastalığıdır. Şu anda aşı bağışıklığı PED'lerin yayılmasını kontrol etmede hala en etkili yöntemdir. Bu çalışmada, PEDV'nin PEDVS proteinini ve Brucella abortus soyunun OMP16 proteinini ifade eden yeni bir rekombinant L. casei-OMP16-PEDVS suşu oluşturduk. Rekombinant L. casei-OMP16-PEDVS aday aşısının immünojenitesini bilmek için BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ ile karşılaştırıldı 9}} PEDVS ve BL21-PEDVS rekombinant proteini.
Sonuçlar: Sonuçlar, L. casei-OMP16-'nin serumunda daha yüksek seviyelerde IgG, nötrleştirici antikor, IL-4, IL-10 ve INF- ve dışkısında IgA tespit edebildiğimizi gösterdi. PEDVS ile bağışıklanmış fareler; bu, L. casei-OMP16-PEDVS aday aşısının daha yüksek düzeyde humoral bağışıklık, hücresel bağışıklık ve mukozal bağışıklık oluşturabildiğini gösterdi.
Çözüm: Bu nedenle L. casei-OMP16-PEDVS, PEDV enfeksiyonunun profilaksisi için umut verici bir aday aşıdır.
Anahtar Kelimeler: PEDV, Lactobacillus casei aşısı, PEDV S proteini, OMP16, İmmün yanıtlar
erkekler için cistanche faydaları-bağışıklık sistemini güçlendirir
giriiş
Domuz salgın ishal (PED), domuz yavrularında ishal, kusma, anoreksi, dehidrasyon ve kilo kaybı gibi semptomlarla seyreden domuz salgın ishal virüsünden (PEDV) kaynaklanır [1, 2]. Her yaştaki domuzlar farklı semptomlarla enfekte olabilmekte ve domuz yavrularında ölüm oranı %100'e kadar çıkmaktadır [3], bu da tüm dünyada büyük ekonomik kayıplara yol açmaktadır. PEDV'nin yayılmasını kontrol etmek için, alüminyum hidroksit ile adjuvanlanmış inaktif aşı, iki değerlikli inaktif oylanmış Bulaşıcı Gastroenterit Virüsü (TGEV) ve PEDV aşısı ve zayıflatılmış PEDV aşısı gibi çoğu aşı türü üretilmektedir [4]. Bu aşılar PED'lerin kontrolünde önemli bir rol oynasa da hepsinin kusurları var. İnaktif aşılar hücresel immün yanıtları aktive edemez, zayıflatılmış aşı çok güvenli değildir ve mukozal immün yanıtların virüse özgü IgA antikorlarının yeterli üretimini sağlayamaz. Bu nedenle PED'leri kontrol altına alacak yeni bir aşının geliştirilmesi gerekli ve acildir.
Lactobacillus casei'nin sıklıkla, insan ve hayvanların sağlığı üzerinde yararlı etkileri olan, oral immünizasyonda antijenlerin hedefe yönelik dağıtımı için bir tür güvenli vektör sistemi olduğu düşünülmektedir [5]. Bu arada, T yardımcı hücre tepkisini düzenlemek ve mukozal bağışıklık için spesifik IgA'ların salgılanmasını uyarmak için bir dağıtım sistemi olarak kullanılabilir [6]. Öte yandan Lactobacillus casei rekombinant aşısının uygulaması daha kolay, aşırı duyarlılık reaksiyonu olasılığı daha az ve geleneksel aşılara göre daha uygun maliyetli. Raporlara göre Lactobacillus casei rekombinant aşıları insan papilloma virüsü, Streptococcus pneumonia ve Escherichia coli'nin önlenmesinde ve kontrolünde başarıyla kullanılmıştır [7-9]. PED aşılarının tasarlanması konusunda da benzer girişimler var. Araştırmacılar, domuz salgını ishal virüsü S1 genini ifade eden bir rekombinant Lactococcus lactis suşunun, aşılanmış farelerde yüksek seviyelerde IL-4 ve IFN-'yi indükleyebildiğini bulmuşlardır [10]. PEDV'nin COE antijeni ile birleştirilmiş mikro katlı hücre hedefleyici peptid Co1'i eksprese eden Lactobacillus casei bazlı anti-PEDV aşısı da etkili bir immün tepkiyi indükleyebilir [11]. PEDV aşısının etkinliğini artırmak. Bu çalışmada, ağızdan uygulama yoluyla PEDV enfeksiyonuna karşı daha güçlü mukozal, humoral ve hücresel bağışıklık tepkilerini uyarabilen yeni bir Lactobacillus casei rekombinant PED aşısı oluşturduk. Coronaviridae ailesinin bir üyesi olan PEDV, 150–220 kDa glikosile edilmiş spike (S) proteini, 20–30 kDa membran (M) proteini, 7 kDa zarf (E) proteini, 58 kDa'yı içeren dört yapısal proteinden oluşur. nükleokapsid (N) proteini [12]. Burada, S proteini, S1 (1-735 amino asit) ve S2 (736-son amino asit) alanlarına bölünebilir [13] ve S1 proteini, reseptör bağlanma bölgesini ve ana nötralize edici epitopları içerir [13] 14]. Aşı adjuvanı bir immünomodülatör görevi görür ve birlikte verilen antijenlere karşı immün yanıtları indükleyebilir ve güçlendirebilir. Brucella abortus suşunun OMP16 proteininin in vivo dendritik hücreleri aktive ettiği, bir th1 immün tepkisini indüklediği ve umut verici bir kendi kendine adjuvan aşı olduğu doğrulandı [15-17]. Bu nedenle çalışmamızda Lacto basil vakası rekombinant aşısına OMP16 proteini yerleştirildi. Şimdiye kadar PEDV'nin Lactobacillus casei re rekombinant aşısı ile ilgili az sayıda çalışma rapor edilmiştir. Bu nedenle bu çalışma, PED'in yayılmasını önlemek için daha iyi humoral bağışıklık, hücresel bağışıklık ve mukozal bağışıklık sağlayabilen yeni bir Lactobacillus casei adayı oral aşı oluşturmayı amaçlamaktadır.
Çin otu cistanche bitkisi-Antitümör
Malzemeler ve yöntemler
Bakteriyel suşlar, virüsler, kültür koşulları, plazmidler ve primerler
Cistanche tozu
Bu çalışmada kullanılan bakteri suşları, plazmidler ve primerler Tablo 1'de listelenmiştir. Lactobacillus casei ATCC 393'ün standart referans suşu, 37 derecede de Man Rogosa ve Sharpe (MRS) besiyerinde kültürlendi [18]. BL21 (DE3) ve DH5, Luria-Bertani (LB) ortamında 37 derecede kültürlendi [19]. Rekombinant Lactobacil lus casei, BL21 (DE3) ve DH5 suşları sırasıyla uygun antibiyotiklerle ilgili ortamda kültürlendi. Brucella abortus, Tryptic Soy Broth (TSB) veya Tryptic Soy Agar (TSA) ortamında (Difco Laboratories, Detroit, MI, ABD) 37 derecede büyütüldü. PEDV suşları ile enfekte edilen Vero hücreleri, 10 ug/mL trypsin (Gibco, Langley, VA, ABD) ile desteklenen DMEM'de (Gibco, Langley, VA, ABD) kültürlendi [20]. pVE5523 ve pET28a (+) plazmitleri sırasıyla Lactobacillus casei ve Escherichia coli'nin ekspresyon vektörleriydi.
Tablo 1 Bu çalışmada kullanılan bakteri suşlarının, plazmitlerin ve primerlerin özellikleri
Rekombinant Lactobacillus casei ve BL21 suşlarının yapısı
Rekombinant ekspresyon plazmitleri, Tablo 1'deki plazmidler ve primerler temel alınarak oluşturuldu. İlk olarak, PEDV S geninin kısmi dizisi (493-708 amino asit), PEDV S' geninin kısmi dizisi (493-708 amino asit), ve Brucella abortus OMP16 geninin (26-168 amino asit) kısmi dizisi, sırasıyla PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2 ve OMP16-F/R primer çiftleri kullanılarak çoğaltıldı. Daha sonra, ortasına bağlayıcı polipeptit (GGGGSGGGGGGGGGS) sıkışmış yeni bir OMP16-PEDVS parçası oluşturmak için OMP16 ve PEDVS parçalarında örtüşme uzatma yöntemi kullanıldı. Daha sonra, PEDVS fragmanları, rekombinant pET28a-PEDVS plazmidini oluşturmak için EcoRI/XbaI kısıtlama enzimleriyle pET28a plazmitine yerleştirildi ve yeni OMP16-PEDVS fragmanları, EcoRI/XbaI ve SalI/EcoRV'ye sahip pET28a ve pVE5523 plazmitlerine yerleştirildi. rekombinant plazmit pET28a-OMP16-PEDVS ve pVE5523-OMP16-PEDVS'yi sırasıyla üretmek için kısıtlama enzimleri. Rekombinant plazmidler (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS ve pVE5523-OMP16-PEDVS), aşağıdakilere dayalı olarak transformasyon veya elektroporasyon yoluyla BL21 (DE3) veya Lactobacillus casei ATCC393'e dönüştürüldü. rapor edilen makale [21].
Western blot ile protein ekspresyonunun analizi
BL21-pET28a-PEDVS, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS ve L. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS suşlarının protein ifadesi bildirilen yönteme dayanarak bazı değişikliklerle tespit edilmiştir [21-23]. Rekombinant BL21-pET28a-PEDVS ve BL21-pET28a OMP16-PEDVS suşları, LB sıvı besiyerinde kültürlendi ve pET28a-PEDVS ve pET28a-OMP{{22}'yi toplamak için IPTG kullanıldı. } PEDVS proteinleri. Boş vektör negatif kontrol olarak kullanıldı. Hücre lizizi ve santrifüj işleminden sonra süpernatan ve çökelti toplandı. Daha sonra hedef proteinler, önceki çalışmaya dayalı olarak Nikel afinite kromatografi kolonu kullanılarak saflaştırıldı [24]. Bu arada, rekombinant L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS suşunun kültürel süpernatantı da 4 derecede 10 dakika boyunca 9000xg'de santrifüjleme yoluyla toplandı. Daha sonra sodyum dodesil sülfat (SDS) yükleme tamponlu numuneler 10 dakika kaynatıldı. Proteinler %12 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektro-forezi (SDS-PAGE) ile ayrıldı ve daha sonra PVDF membranlarına (Millipore, Mississauga, ON, Kanada) aktarıldı. Membranlar %5 yağsız süt ile 2 saat boyunca 37 derecede bloke edildi ve daha sonra gece boyunca 4 derecede S proteininin murin monoklonal antikoru ve HRP konjuge keçi anti-fare IgG'si (ABclonal, Wuhan, Çin) ile 2 saat boyunca inkübe edildi. 37 derece. Protein bantları, Clarity™ Western ECL Blot Substrate (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) kullanılarak görselleştirildi.
Bağışıklama ve numune toplama
Rekombinant Lactobacillus casei aşısının immünojenitesi, Shandong Ziraat Üniversitesi hayvan merkezinden satın alınan altı haftalık dişi spesifik patojen içermeyen (SPF) BALB/c fareleri [10, 18] kullanılarak değerlendirildi. Toplam 50 fare, her grupta 10 fare olacak şekilde rastgele 5 gruba ayrıldı. Fareler, rekombinant Lactobacillus casei aşısı ve saflaştırılmış protein (sırasıyla pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+Freund'un tam adjuvanı) ile bağışıklandı. Bağışıklama protokolü Tablo 2'ye göre gerçekleştirildi ve 13 gün sonra bir takviye bağışıklama verildi. Serolojik çalışma için serum, aşılamadan sonraki 0, 14 ve 28. günlerde (dpi) kuyruk damarı delme yoluyla toplandı ve kullanılıncaya kadar -20 derecede saklandı. Dışkılar aşılamadan 1 gün önce ve her takviye zamanında toplandı. IgA tespiti için dışkılar toplandıktan hemen sonra 1:4 oranında 0,05 M sodyum EDTA ile seyreltildi (ağırlık/hacim) ve uygun şekilde karıştırıldıktan sonra 14 saat boyunca 4 derecede inkübe edildi. Süpernatan 12,000×g santrifüj ile toplandı ve kullanılıncaya kadar -20 derecede saklandı. 28. dpi'de; her gruptan üç fare feda edildi ve bağırsak, daha önce açıklanan yazara göre IgA tespiti için işlendi [10, 18, 23].
Antikor seviyelerinin belirlenmesi analizi
Serumdaki IgG ve dışkıdaki IgA seviyeleri ELISA yöntemleriyle bazı modifikasyonlarla ölçüldü [18, 23]. Yöntemler şu şekildeydi: Polistiren mikrotitre plakaları, 100 μL 10 ug/mL PEDVS proteini, OMP16-PEDVS proteini veya 100 μL rekombinant L. casei-OMP16-PEDVS suşu ile gece boyunca 4 derecede kaplandı. . Toplanan örnekler %5 yağsız süt ile bloke edildikten sonra seri olarak PBS içerisinde seyreltildi, üç kopya halinde ilave edildi ve 37 derecede 1 saat inkübe edildi. Daha sonra her bir kuyucuğa (1:5000) HRP-konjuge keçi anti-fare IgG veya IgA antikoru (Invi trogen, ABD) eklendi ve 37 derecede 1 saat inkübe edildi. Polistiren mikrotitre plakaları her aşamada 5 kez yıkandı. Son olarak her kuyucuğa 100 μL TMB substratı (tetrametilbenzidin ve H2O2) eklendi ve 10 dakika sonra 50 μL stop solüsyonu eklendi. 630 nm'deki OD değerleri, çok modlu bir plaka okuyucu (EnVision) kullanılarak ölçüldü.
Virüs nötralizasyon deneyleri
Serumdaki PEDV'nin nötralize edici antikor titreleri, bazı modifikasyonlarla yöntemlere göre incelendi [25, 26]. Kısaca, fare serumu ısıyla inaktive edildi (30 dakika boyunca 56 derece) ve daha sonra her numunenin üç kopyası ile 96 oyuklu plakalarda (Corning, ABD) seri olarak iki kat seyreltildi. Daha sonra eşit hacimde 200 adet TCID50 / 50 μL PEDV suşu 96 kuyucuklu plaklara eklendi ve 37 derecede 1 saat inkübe edildi. Karışım, Vero hücre tek katmanlarıyla kaplanmış yeni 96 yuvalı plakalara eklendi ve 37 derecede 1 saat süreyle inkübe edildi. Hücreler daha sonra yıkandı ve 37 derecede %5 CO2'li bakım ortamında inkübe edildi. 2 gün sonra ters bir mikroskop kullanılarak sitopatik etki (CPE) gözlemlendi ve nötr boyutlandırma konsantrasyonu, serumdaki antikorların en düşük konsantrasyonu olarak tanımlandı.
Tablo 2 BALB/c farelerinin bağışıklık protokolü
Sitokin tespiti
Sitokinlerin salgılanmasını tespit etmek için laboratuvar farelerinden süpernatanlar elde edildi (0, 14 ve 28 gün). Salgılanan IL-4, IL-10 ve IFN- seviyeleri, sırasıyla üreticinin tavsiyelerine göre ticari ELISA kitleri (Elabscience Bioteknoloji Co., Ltd., Wuhan) kullanılarak belirlendi. Sitokin, sırasıyla kitler tarafından sağlanan standart reaktiflerden hazırlanan farklı standart eğrilerden ölçülmüş ve çok modlu bir plaka okuyucu (EnVision) kullanılarak her plakadan 450 nm'de optik yoğunluk (OD) değeri tespit edilmiştir [23, 27].
istatistiksel analiz
Tüm veriler en az üç bağımsız deneyden elde edildi ve sonuçlar, ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunuldu. İstatistiksel analiz, Graph Pad Prism 7.0'de (GraphPad Software Inc., ABD) iki kuyruklu t testleri ve tek yönlü analiz kullanılarak gerçekleştirildi. Anlamlı fark ∗ p < 0.05 olarak tanımlandı ve anlamlı farkın çeşitli dereceleri ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗ ve p < olarak belirlendi. sırasıyla 0,001.
Sonuçlar
Rekombinant Lactobacillus casei ve BL21 suşlarının doğrulanması
Oluşturulan rekombinant plazmitleri doğrulamak için, rekombinant ekspresyon plazmitleri pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS ve pVE5523-OMP16-PEDVS, NcoI/XhoI kısıtlama enzimleri kullanılarak sindirildi ve enzim sindirimi sonuçları Şekil 1'de gösterilmiştir. Elektroforetogramlardaki hedef bantların boyutları beklenen sonuçlarla aynıydı ve dizileme sonuçları, rekombinant ekspresyon plazmidlerinin herhangi bir mutasyon sergilemediğini gösterdi. Bu sonuçlar, pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS ve pVE5523-OMP16-PEDVS rekombinant plazmitlerinin başarılı bir şekilde oluşturulduğunu gösterdi. Western blot sonuçları, rekombinant proteinler pET28a-OMP16-PEDVS ve pET28a-PEDVS'nin BL21-pET28a OMP16-PEDVS ve BL21- süpernatanında ifade edildiğini gösterdi. sırasıyla pET28a-PEDVS suşları. pVE5523-OMP16-PEDVS proteini aynı zamanda L. casei-pVE5523- OMP16-PEDVS suşunun kültürel süpernatanında da doğrulandı. Şekil 2'deki spesifik bantlar, rekombinant proteinler pET28a-OMP16- PEDVS, pVE5523-OMP16-PEDVS ve pET28a-PEDVS'nin tamamının başarıyla toplandığını gösterdi (Şekil 2).
Şekil 1 Rekombinant plazmitlerin enzim sindirimi sonuçları. C: pVE5523-OMP16-PEDVS plazmidinin enzim sindirimi sonuçları. M: D8000 DNA Merdiven İşaretleyici; 1: pVE5523-OMP16-PEDVS plazmidi. B: pet28a-OMP16-PEDVS ve pET28a-PEDVS plazmidinin enzim sindirimi sonuçları. M: D8000 DNA Merdiven İşaretleyici; 1: pet28a-OMP16-PEDVS plazmidi; 2: pET28a-PEDVS plazmidi
Aday aşılarla aşılanan farelerin serumundaki IgG antikor seviyeleri
Oluşturulan aşı adaylarının spesifik immünojenitesini değerlendirmek için BALB/c fareleri seçildi ve 5 gruba bölündü. Daha sonra ticari ELISA kitleri ile serumdaki IgG ve dışkıdaki IgA düzeyleri ölçüldü. Sonuçlar, aşılanan gruplar arasında IgG seviyelerinde önemli bir farklılık olmadığını ve aşılamadan önce tüm farelerde neredeyse hiç IgG antikorunun bulunmadığını ortaya çıkardı. Ancak ilk aşılamadan sonra önemli farklılıklar bulundu ve 28. günde serumdaki IgG antikor seviyeleri 14. güne göre daha yüksekti. 5 grup fare arasında, L. casei-OMP16- PEDVS ve BL21-OMP16-PEDVS-F ile aşılanan fareler benzer ve en yüksek immünojenisiteyi gösterdi. Bu nedenle, L. casei-OMP16- PEDVS ve BL21-OMP16-PEDVS-F en yüksek immünojeniteyi üretebilir, ardından BL21-OMP16- PEDVS gelebilir ve BL21-PEDVS (Şekil 3).
cistanche takviyesi faydaları-bağışıklığı artırır
Cistanche Enhance Immunity ürünlerini görüntülemek için buraya tıklayın
【Daha fazlasını isteyin】 E-posta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Aday aşılarla aşılanan farelerin dışkısındaki IgA antikor seviyeleri
Üretilen aşı adaylarının spesifik immünojenitesini değerlendirmek için farelerin dışkısındaki IgA antikorlarının seviyeleri de değerlendirildi. Sonuçlar, aşılamadan önce özel bir anti-PEDVS IgA antikorunun mevcut olmadığını gösterdi. Bununla birlikte, L. casei-OMP16-PEDVS ile aşılanmış fareler BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7}'nin dışkısında büyük miktarlarda IgA antikoru }PEDVS ve BL21-PEDVS grubu fareler, aşılamadan 14 gün sonra. Bağışıklamadan 28 gün sonra, L. casei-OMP16-PEDVS ile aşılanmış farelerin IgA antikor seviyeleri en yüksek maksimuma ulaştı. Bu arada diğer üç gruptaki IgA antikor seviyelerinde belirgin bir artış görülmedi. Bu nedenle aday aşı L. casei OMP16-PEDVS, BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ ile karşılaştırıldığında aşılanmış farelerde daha yüksek antikor seviyelerini uyarabilir. {18}}PEDVS ve BL21- PEDVS ile aşılanmış fareler (Şekil 4).
Şekil 2 Rekombinant ekspresyon proteinlerinin doğrulanması. M: protein işaretleyici; 1: salgı proteini rekombinant L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS suşu oluşturur; 2: BL21- pET28a-OMP16-PEDVS türünden saflaştırılmış protein; 3: BL21-pET28a-PEDVS türünden saflaştırılmış protein
Bağışıklanmış farelerde serumun nötrleştirici antikor seviyeleri
L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS aday aşılarının koruyucu etkisini değerlendirmek BL21-PEDVS ve farelerde nötrleştirici antikor seviyeleri ölçüldü. Sonuçlar aşılamadan önce hiçbir nötralize edici antikorun tespit edilmediğini gösterdi. Nötralize edici antikor aşılamadan 14 gün sonra tespit edildi ve takviye aşılamadan 14 gün sonra arttı. L. casei-OMP16-PEDVS alan farelerdeki antikor tepkisi, ağızdan BL21-OMP16-PEDVS-F, BL uygulanan farelerdekinden daha güçlü bir anti-PEDV nötrleştirme aktivitesine sahipti 21-OMP16-PEDVS ve BL21-PEDVS. Bu nedenle aday aşı L. casei OMP16-PEDVS, en yüksek nötrleştirici antikor seviyesini uyarabilir ve bunu BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ takip edebilir. 24}}PEDVS ve BL21-PEDVS (Şekil 5).
Sitokin seviyeleri
L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS'nin hücresel bağışıklık tepkisi düzeyini karşılaştırmak için, ve BL21-PEDVS ile aşılanmış fareler, IL- 4, IL-10 ve IFN- sırasıyla belirlendi. Sonuçlar, farelerin serumundaki sitokinler IL-4, IL-10 ve IFN- seviyelerinin çok düşük olduğunu ve aşılamadan önce önemli bir fark olmadığını gösterdi. Oysa IL-4, IL-10 ve IFN- sonuçlarında da benzer değişiklikler gözlendi. Bağışıklamadan 14 gün sonra, L. casei-OMP16-PEDVS ile bağışıklanmış farelerdeki IL-4, IL-10 ve IFN- düzeyi, BL21-'den daha yüksekti OMP16-PEDVS F, BL21-OMP16-PEDVS ve BL21-PEDVS ile aşılanmış fareler. Güçlendirici aşılamadan 14 gün sonra, L. casei-OMP16- PEDVS ile aşılanmış farelerde diğer farelerle karşılaştırıldığında daha yüksek bir IL-4, IL-10 ve IFN- düzeyi tespit edildi üç grup. Bu nedenle aday aşı L. casei-OMP16-PEDVS, en yüksek IL-4, IL-10 ve IFN- düzeylerini ve ardından BL21-OMP{{'yi uyarabilir. 40}} PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS ve BL21-PEDVS (Şekil 6).
Şekil 3 Bağışıklaştırılmış farelerin serumundaki aday aşıların IgG antikor seviyeleri. Serum, bağışıklamadan önceki veya sonraki 0, 14 ve 28. günlerde toplandı ve ticari ELISA kitleri aracılığıyla incelendi ve 450 nm'lik bir absorbansta ölçüldü. Çubuklar, üç bağımsız deneyin ortalama ± standart sapmasını temsil eder. * p < 0.05, ** p < 0,01 ve **** p < 0,0001 sırasıyla artan anlamlı fark derecelerini temsil eder ve ns, anlamlı fark olmadığı anlamına gelir
Tartışma
Ekim 2010'da PEDV varyantlarının neden olduğu büyük ölçekli bir PED salgını meydana geldi ve bu durum Çin'de ve tüm dünyada çok büyük ekonomik kayıplara yol açtı [1]. Ancak geleneksel aşıların tümü, PEDV varyantına yeterli koruma sağlayamayan CV777 klasik suşu temel alınarak tasarlanmıştır [4]. PEDV'nin yayılmasını kontrol etmek ve ekonomik kayıpları azaltmak için PEDV varyant suşlarının yeni aşıları da tasarlanmaktadır. Şu anda, PEDV inaktif aşısı ve PEDV varyant suşlarının zayıflatılmış aşısının tamamı Çin hükümeti tarafından onaylanmıştır ve PED'in kontrol altına alınması konusunda ümit verici beklentiler sergilemektedir. Ancak iki tür yeni aşıda da kusurlar mevcut. PEDV, domuzları sindirim sistemi yoluyla enfekte eder ve bağırsak dokusu tropizmine sahiptir. Bu nedenle mukozal bağışıklık, PEDV'nin bağırsak epitel hücrelerine girişini önlemede sistemik bağışıklıktan daha etkilidir ve aşıların bağırsak yolunda mukozal korumayı etkili bir şekilde sağlaması gerekir. Dolayısıyla bu çalışmada, daha güçlü anti-PEDV'ye özgü IgG ve IgA antikorlarını uyarabilen yeni bir aşı türü inşa ediyoruz. Lactobacillus casei, bir aşı dağıtım aracı olarak potansiyel immün modülatör özelliklere sahiptir ve bu bakterinin hücre duvarı üzerindeki biyoaktif bileşiklerin ekspresyonu, uygun immün yanıtları uyarabilir [28, 29]. İnsan papilloma virüsü, Streptococcus pneumonia ve Escherichia coli'nin birçok heterolog antijeninin hayvan modellerinde aşı olarak ekspresyonunda yaygın olarak kullanılır ve bunların tümü mükemmel immünojenite gösterir [7-9]. İnaktif aşı ve zayıflatılmış aşıyla karşılaştırıldığında Lactobacillus casei vektör aşısı aynı zamanda daha yüksek IgA seviyelerini ve hücresel bağışıklık tepkisini uyarabilir. Çalışmalar, IgA'nın bağırsaktaki ilk savunma hattının, domuz yavrularını PEDV enfeksiyonundan korumada IgG'den daha iyi olacağını göstermiştir [10, 30]. Bu nedenle PED'in bir çeşit Lactobacillus casei vektör aşısının geliştirilmesi ümit vericidir. Raporlara göre PEDV'nin S proteini, S1 (1-735 amino asit) ve S2 (736-son amino asit) alanlarına bölünebilir [13] ve S1 proteini, reseptör bağlanma bölgesini ve ana nötrleştirici epitoplar [14]. Çekirdek nötralize edici epitop (COE), PEDV'ye karşı güçlü nötralize edici antikorları indükleyebilir [31, 32]. Antijenite analiziyle birleştirildiğinde, rekombinant plazmidi oluşturmak için S1 geninin kısmi bir dizisi (1477-2124 bp) seçildi. Seçilen küçük parçanın yalnızca iyi bir bağışıklık oluşturuculuğa sahip olmakla kalmayıp aynı zamanda Lactobacillus casei'nin salgılanan ifadesine de katkıda bulunduğu kanıtlanmıştır. Öte yandan Pasquevich, Brucella abortus dış membran proteini 16'nın dendritik hücreleri in vivo olarak aktive edebildiğini, bir th1 immün tepkisini indükleyebildiğini ve sistemik ve oral edinilmiş bruselloza karşı ümit verici bir kendi kendine adjuvanlı aşı olduğunu buldu [15]. Brucella spp.'den lipitlenmemiş dış membran proteini omp16'yı inceleyen benzer araştırma. nazal bir adjuvan olarak th1 immün tepkisini indükleyebildiği ve inek sütü proteinlerine karşı th2 alerjik tepkisini modüle edebildiği de kanıtlanmıştır [16]. Bu nedenle, çalışmamızda bağışıklık fonksiyonunu arttırmak amacıyla rekombinant plazmit oluşturmak için omp16 geninin kısmi bir dizisi seçildi. Yeni Lactobacillus casei aşısının humoral bağışıklık tepkilerini tetikleyip tetikleyemeyeceğini bilmek için IgG, IgA ve nötralize edici antikor seviyeleri ölçüldü. L. casei-OMP16- PEDVS rekombinant aşısı ile aşılanmış farelerin IgG antikor düzeyi, BL21-OMP16-PEDVS-F re rekombinant aşısı ile aşılanmış fareler ile anlamlı bir fark göstermedi. Ancak IgA ve nötrleştirici antikor seviyeleri BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S ve BL{{47'dekilerden daha yüksekti }}PEDVS rekombinant aşıyla değiştirilmiş fareler. Sonuçlar, L. casei-OMP16-PEDVS'nin, özellikle IgA antikor düzeyleri olmak üzere daha güçlü humoral bağışıklık tepkilerini tetikleyebileceğini gösterdi. Çalışmalar, IgA'nın bağırsaktaki ilk savunma hattı olduğunu ve domuz yavrularını PEDV enfeksiyonundan korumada IgG'den daha iyi olacağını göstermiştir [30]. Araştırma aynı zamanda L. casei-OMP16-PEDVS rekombinant aşısının PEDV'ye daha iyi immünolojik koruma sağlayabileceği sonucunu da doğruladı. Rekombinant L. casei-OMP16-PEDVS tarafından indüklenen bağışıklık tepkisinin tipini araştırmak amacıyla, T aktivitesini değerlendirmek üzere IL-4, IL-10 ve IFN- seviyeleri tespit edildi. lenfositler. Rapora göre, IFN-, patojenler vücudu istila ettiğinde ortaya çıkan hücresel bağışıklık tepkisinde önemli bir rol oynar; IL-4, humoral bağışıklık tepkisinde önemli bir rol oynar ve bağışıklık toleransını ve mukozal bağışıklığı destekler [33], IL -10, mukozal mikrobiyal enfeksiyona karşı mücadelede ve bağırsakta mukozal bariyer bütünlüğünün korunmasında önemli roller oynar [34]. Bu arada, sitokin tespitinin sonuçları, L. casei-OMP16-PEDVS rekombinant aşısı ile aşılanan farelerin, IL-4, IL-10 ve IFN-'nin daha güçlü ekspresyonunu indükleyebildiğini gösterdi; L. casei-OMP16-PEDVS rekombinant aşısının sırasıyla daha güçlü humoral bağışıklık tepkisi, IgA antikor düzeyi ve hücresel bağışıklık tepkisi oluşturabileceği sonuçlarını destekledi.
Şekil 5 Aşılanmış farelerin serumundaki aday aşıların nötrleştirici antikor seviyeleri. Serum, bağışıklamadan önceki veya sonraki 0, 14 ve 28. günlerde toplandı ve nötrleştirme testi yoluyla incelendi. Çubuklar, üç bağımsız deneyin ortalama ± standart sapmasını temsil eder. * p < 0.05, ** p < 0.01 ve **** p < 0.0001 sırasıyla artan anlamlı fark derecelerini temsil eder ve ns anlamlı fark olmadığı anlamına gelir fark
Şekil 6 Bağışıklanmış farelerin serumundan sitokin seviyelerinin saptanması. Serum, bağışıklamadan önceki veya sonraki 0, 14 ve 28. günlerde toplandı ve ticari ELISA kitleri aracılığıyla incelendi. Absorbans değeri, IL-4 (a), IL-10 (b) ve IFN- (c) için sırasıyla 450 nm absorbansta ölçüldü. Çubuklar, üç bağımsız deneyin ortalama ± standart sapmasını temsil eder. * p < {{10}}.05, ** p < 0,01 ve **** p < 0,0001 sırasıyla artan anlamlı fark derecelerini temsil eder
Çözüm
Özetle, L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS ve BL{{7 }}PEDVS aday aşıları bu çalışmada oluşturulmuştur. Bu arada, bu aday aşıların farelerde humoral bağışıklık tepkisi ve hücresel bağışıklık tepkisi düzeyleri değerlendirildi. Sonuçlar, L. casei-OMP16-PEDVS ile aşılanan farelerin, diğer farelerle karşılaştırıldığında daha yüksek seviyelerde IgG, IgA, nötralize edici antikor, IL-4, IL- 10 ve INF- üretebildiğini gösterdi. BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS ve BL21-PEDVS ile aşılanan fareler. Bu nedenle rekombinant L. casei OMP16-PEDVS aday aşısı, PEDV enfeksiyonunun profilaksisi için güvenli, etkili ve kullanışlı bir rekombinant mukozal aşının geliştirilmesine zemin oluşturabilir.
cistanche tubulosa-bağışıklık sistemini iyileştirir
Referanslar
1. Wang D, Fang L, S X. Çin'de domuz salgını ishali. Virüs Res. 2016; 226:7–13.
2. Sueyoshi M, Tsuda T, Yamazaki K, Yoshida K, Nakazawa M, Sato K ve diğerleri. Domuz salgını ishalinin immünohistokimyasal bir araştırması. J Comp Pathol. 1995;113(1):59–67.
3. Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, Liang PS, Song CXJEID. Çin'de emziren domuz yavrularında domuz salgını ishal salgını. Acil Enfekte Dis. 2012; 18(1):161–3.
4. Tong YE, Feng L, Li W. Bulaşıcı gastroenterit virüsüne ve domuz salgını ishal virüsüne karşı iki-kombine zayıflatılmış bir aşının geliştirilmesi. Chin J Önceki Veteriner Med. 1999;21(6):35–9.
5. Pouwels PH, Leer RJ, Boersma WJ. Lactobacillus'un oral immünizasyon için bir taşıyıcı olarak potansiyeli: antijenlerin hedeflenen dağıtımı için vektör sistemlerinin geliştirilmesi ve ön karakterizasyonu. J Biyoteknoloji. 1996;44(1–3):183.
6. Tsai YT, Cheng PC, Pan TM. Biyoteknoloji: Laktik asit bakterilerinin bağışıklık fonksiyonlarını ve faydalarını iyileştirmeye yönelik immünomodülatör etkileri. Appl Microbiol Biyoteknoloji. 2012;96(4):853–62.
7. Adachi K, Kawana K, Yokoyama T, Fujii T, Tomio A, Miura S, ve diğerleri. İnsan papilloma virüsü (HPV) tip 16 E7'yi eksprese eden bir Lactobacillus casei aşısıyla oral immünizasyon, HPV16 E7'ye karşı mukozal sitotoksik lenfositleri indüklemek için etkili bir stratejidir. Aşı. 2010;28(16):2810–7.
8. Campos IB, Darrieux M, Ferreira DM, Miyaji EN, Silva DA, Arêas APM ve diğerleri. Pnömokok Yüzey Proteini A'yı eksprese eden Lactobacillus casei ile farelerin nazal immünizasyonu: antikorların indüksiyonu, kompleman birikimi ve Streptococcus pneumoniae tehdidine karşı kısmi koruma. Mikroplar Bulaşır. 2008;10(5):481–8.
9. Wen LJ, Hou XL, Wang GH, Yu LY, Wei XM, Liu JK ve diğerleri. K99 ve K88 fimbrial protein üreten rekombinant Lactobacillus casei suşları ile aşılama, fareleri enterotoksijenik Escherichia coli'ye karşı korur. Aşı. 2012;30(22): 3339–49.
10. Guo M, Yi S, Guo Y, Zhang S, Niu J, Wang K, ve diğerleri. Bir varyant domuz salgını ishal virüsü S1 genini eksprese eden bir rekombinant laktococcus lactis suşunun oluşturulması ve bunun farelerde immünojenisite analizi. Viral İmmünol. 2019;32(3):144–50.
11. Wang X, Wang L, Zheng D. PEDV'nin COE antijeni ile kaynaşmış mikrokatlı hücre hedefleyici peptid Co1'i eksprese eden Lactobacillus casei bazlı anti-domuz salgını ishal virüsü (PEDV) aşısı ile oral immünizasyon. J Appl Microbiol. 2017;124(2):368–78.
12. Duarte M, Tobler K, Bridgen A, Rasschaert D, Ackermann M, HL. Nükleokapsid ve spike protein genleri arasındaki domuz salgını ishal virüsü genomunun dizi analizi, polimorfik bir ORF'yi ortaya çıkarır. Viroloji. 1994;198(2):466.
13. Lee DK, Park CK, Kim SH, Lee C. Kore'de izole edilen domuz salgını ishal virüslerinin başak protein genlerindeki heterojenlik. Virüs Res. 2010;149(2): 175–82.
14. Sun DB, Feng L, Shi HY, Chen JF, Liu SW, Chen HY, ve diğerleri. Domuz salgını ishal virüsünün spike protein bölgesi (aa 636789), nötrleştirici antikorların indüksiyonu için gereklidir. Acta Virol. 2007;51(3):149–56.
15. Pasquevich KA, Garcia Samartino C, Coria LM, Estein SM, Zwerdling A, Ibanez AE, ve diğerleri. Brucella abortus dış membran proteini 16'nın protein kısmı, dendritik hücreleri in vivo olarak aktive eden, bir Th1 immün tepkisini indükleyen ve sistemik ve oral edinilmiş bruselloza karşı umut verici bir kendi kendini adjuvanlayan aşı olan yeni bir bakteriyel patojenle ilişkili moleküler modeldir. J İmmünol. 2010;184(9):5200.
16. Ibanez AE, Smaldini P, Coria LM, Delpino MV, Pacífico LGG, Oliveira SC, ve diğerleri. Brucella spp.'den sıvılaştırılmamış dış zar proteini Omp16 (U-Omp16). nazal adjuvan olarak bir Th1 immün tepkisini indükler ve inek sütü proteinlerine karşı Th2 alerjik tepkisini modüle eder. PLoS Bir. 2013;8(7):e69438.
17. Pasquevich KA, Estein SM, Samartino CG, Zwerdling A, Coria LM, Barrionevo P, ve diğerleri. Bağışıklık: Adjuvan olarak rekombinant Brucella türü dış membran proteini Omp16 veya Omp19 ile aşılama, spesifik CD4+ ve CD8+ T hücrelerini indüklemenin yanı sıra Brucella abortus enfeksiyonuna karşı sistemik ve oral koruma sağlar. Bağışıklığı enfekte edin. 2009;77(1):436–45.
18. Ma S, Wang L, Huang X, Wang X, Chen S, Shi W, ve diğerleri. Domuz salgını ishal virüsünün çekirdek nötralize edici epitopunu sağlamak için bağırsak mikrokatlı hücrelerini ve dendritik hücreleri hedef alan oral rekombinant Lactobacillus aşısı. Mikrob Hücre Fabrikaları. 2018;17(1):20.
19. Chu S, Zhang D, Wang D, Zhi Y, Zhou P. Asimilatör nitrat ve nitrit redüktazın heterolog ekspresyonu ve biyokimyasal karakterizasyonu, Bacillus megaterium NCT-2'nin ikincil tuzlanma toprağındaki adaptasyonunu ve potansiyelini ortaya koymaktadır. Uluslararası J Biol Makromol. 2017;101:1019.
20. Guo N, Zhang B, Hu H, Ye S, Chen F, Li Z, ve diğerleri. Caerin1.1, virüse doğrudan bağlanma yoluyla domuz salgını ishal virüsünün in vitro büyümesini bastırır. Virüsler. 2018;10:9.
21. Chen Z, Lin J, Ma C, Zhao S, She Q, Liang Y. Biyoteknoloji: Lactobacillus casei MCJ'den izole edilen çift replikasyon kökenli bir plazmit olan pMC11'in karakterizasyonu ve her replikon ile mekik vektörlerinin oluşturulması. Appl Microbiol Biyoteknoloji. 2014;98(13):5977.
22. Xiaona W, Li W, Xuewei H, Sunting M, Meiling Y, Wen S, ve diğerleri. Domuz Salgını İshal Virüsü COE Antijeni ile Birleştirilmiş Dendritik Hücre Hedefleyici Peptidi Eksprese Eden Probiyotiklerin Oral Dağıtımı: PEDV'ye Karşı Umut Veren Bir Aşı Stratejisi. Virüsler. 2017;9(11):312.
23. Bhuyan AA, Memon AM, Bhuiyan AA, Zhonghua L, Zhang B, Ye S, ve diğerleri. BVDV E2 proteinini eksprese eden rekombinant Lactobacillus casei'nin yapısı ve bunun farelerde bağışıklık tepkisi. J Biyoteknoloji. 2018;270:51–60.
24. Noi NV, Chung YCJB, Ekipman B. Escherichia coli'de domuz salgını ishal virüsü spike (PEDV-S1) proteininin rekombinant S1 alanının ekspresyonunun optimizasyonu ve saflaştırılması. Biyoteknoloji Biyoteknoloji Ekipmanı 2017;31(2):1–11.
25. Li C, Li W, Esesarte E, Guo H, Elzen P, Aarts E, ve diğerleri. Domuz salgını ishal virüsü spike proteininin hücre bağlanma alanları, nötrleştirici antikorların temel hedefleridir. J Virol. 2017;91(12):1–16.
26. Wen Z, Xu Z, Zhou Q, Li W, Wu Y, Du Y ve diğerleri. Kaplanmış PEDV yüklü mikrokürelerin ağız yoluyla uygulanması, sütten kesilmiş domuz yavrularında PEDV'ye özgü bağışıklık ortaya çıkardı. Aşı. 2019;09(014):161–6.
27. Gao Q, Zhao S, Qin T, Yin Y, Yang Q. Domuz salgını ishal virüsünün domuz monositinden türetilmiş dendritik hücreler ve bağırsak dendritik hücreleri üzerindeki etkileri. Veteriner Mikrobiol. 2016;106:149–58.
28. Bonet MEB, Chaves AS, Mesón O. Lactobacillus casei'nin bir probiyotik suşunun oral yoldan uygulanmasıyla indüklenen immünomodülatör ve antiinflamatuar aktivite. Enflamasyon. 2006;4(1):31–41.
29. Grangette C, Müller-Alouf H, Geoffroy MC, Goudercourt D, Turner M, Mercenier A. İki rekombinant laktik asit bakterisinin intragastrik uygulamasından sonra tetanoz toksine karşı koruma: suş canlılığının ve in vivo kalıcılığın etkisi. Aşı. 2002;20(27–28):3304–9.
30. Song DS, Oh JS, Kang BK, Yang JS, Moon HJ, Yoo HS, ve diğerleri. Vero hücreli zayıflatılmış domuz salgını ishal virüsü DR13 suşunun oral etkinliği. Res Vet Sci. 2007;82(1):134–40.
31. Makadiya N, Brownlie R, Jan V, Berube N, Allan B, Gerdts V, ve diğerleri. Bir aşı antijeni olarak domuz salgını ishal virüsü spike proteininin S1 alanı. Virol J. 2016;13:1.
32. Chang SH, Bae JL, Kang TJ, Ju K, Chung GH, Lim CW, ve diğerleri. Hücreler: Domuz salgını ishal virüsüne karşı nötrleştirici antikorları indükleyebilen epitop bölgesinin tanımlanması. Mol Hücresi. 2002;14(2): 295–9.
33. Sumi T, Fukushima A, Fukuda K, Kumagai N, Nishida T, Yagita H, ve diğerleri. B7-1 ve B7-2'nin fare deneysel alerjik konjonktivit gelişimine farklı katkıları. İmmünol Lett. 2007;108(1):62–7.
34. Xue M, Zhao J, Ying L, Fu F, Li L, Ma Y, ve diğerleri. IL-22, STAT3 sinyal yolunu aktive ederek domuz enterik koronavirüsleri ve rotavirüs enfeksiyonunu baskılar. Antivir Res. 2017;142:68–75.
