Naringenin'in HepaRG Hücrelerinde MiRNA-mRNA Profilleri Üzerine Etkileri

Daha fazla ayrıntı için iletişim:tina.xiang@wecistanche.com

Soyut: Naringenin, doğalflavonoidNarenciye meyvelerinde yaygın olarak bulunan, doğal bir besin takviyesi olarak antioksidan, anti-inflamatuar ve hepatoprotektif özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte, insan karaciğerindeki naringenin düzenleyici mekanizması belirsizliğini koruyor. Bu çalışmada, kontrol ve naringenin ile tedavi edilen HepaRG hücreleri arasındaki ekspresyon farklılıklarını ayırt etmek için haberci RNA dizilimi (mRNA-seq), mikroRNA dizilimi (miRNA-seq) ve gerçek zamanlı qPCR kullanıldı. 1037 farklı şekilde eksprese edilmiş mRNA ve 234 miRNA elde ettik. Silico'daki hedef tahmin ve entegrasyon analizine göre, 20 potansiyel miRNA-mRNA çifti bulduk.karaciğermetabolizma. Bu çalışma, bir gıda katkı maddesi olarak naringenin nutrasötik değerini daha da karakterize eden HepaRG hücrelerinde mRNA-seq ve miRNA-seq'in entegre analizi yoluyla naringenin düzenlenmesinde miRNA-mRNA etkileşimlerinin bir perspektifini sağlayan ilk çalışmadır.

anahtar kelimeler: naringenin; mRNA-sekansı; miRNA-seq; HepaRG hücreleri

daha fazla ürün bilgisi almak için tıklayın

1. Giriş

naringeninDoğal bir flavonoid olan narenciye ve greyfurt, portakal, bergamot, domates ve incir gibi diğer yenilebilir meyvelerde bol miktarda bulunur [1]. Oral uygulamadan sonra, naringenin gastrointestinal kanalda ve karaciğerde yaygın olarak dağılır [2,3] ve moleküler yapısı nedeniyle serbest radikal süpürücü aktivite ile doğrudan bir antioksidan özellik sergiler ve karaciğerde endojen antioksidan sistemi indükler [4]. Hem in vitro hem de in vivo çalışmalardan elde edilen artan kanıtlar, naringenin gibi çeşitli koruyucu kapasiteleri tanımlamıştır.antienflamatuvar[5], antioksidan [6], anti-fibrozis [Z] ve hepatoprotektif 4,8| faaliyetler. Bu kapasiteler, diyet naringenininin metabolik sendromu ve fulminan hepatit, yağlıkaraciğer hastalığı, fibrozis, vb. 19,10]. Bununla birlikte, naringenin'in karaciğerin genel genleri üzerindeki düzenleyici etkileri hakkında az sayıda ayrıntılı çalışma vardır [4].

MikroRNA'lar (miRNA'lar), filogeni, farklılaşma, çoğalma ve apoptozda çok çeşitli biyolojik düzenleyici işlevler sergileyen, endojen genler tarafından kodlanan 18-26 nükleotid uzunluğunda, kodlama yapmayan, tek sarmallı RNA moleküllerinin bir sınıfıdır. [11]. Sekansa özgü tanıma yoluyla haberci RNA'ları (mRNA'lar) bağlayan miRNA, hedef mRNA'ların bozunması yoluyla transkripsiyon sonrası seviyede gen ekspresyonunu negatif olarak düzenler [12]. Eksojen uyarı altında miRNA ifadesi değiştirilir ve ardından hedef mRNA ifadesi düzenlenir. Sonunda, eksojen stimülasyonun neden olduğu zorluklarla başa çıkmak için kapsamlı fizyolojik işlevler değiştirilir [13]. miRNA-mRNA hedef ilişkilerini tahmin etmek için daha güvenilir bir yöntem, silico'da belirli bir işleme bağlamını kullanarak mRNA-seq analizini miRNA-seq analizi ile aynı anda entegre etmektir [14].

Bu nedenle amacımız naringenin'in global genler üzerindeki etkilerini incelemek ve karaciğerdeki miRNA-mRNA çiftlerinin olası düzenleyici mekanizmasını vurgulamaktı. Bu çalışmada, doğal bir besin takviyesi olarak naringenin potansiyeline dair kanıt sağlamak için mRNA-seq, miRNA-seq, biyoinformatik analizler ve gerçek zamanlı qPCR gerçekleştirilerek HepaRGhücrelerinde mRNA ekspresyon değişiklikleri ve miRNA ekspresyon profilleri araştırıldı.

2. Sonuçlar

2.1.Naringenin Yanıtında Transkriptom Dizilemesinin Analizi

mRNA ekspresyon değişikliklerini tanımlamak içinHepaRG hücrelerinaringenin yanıt olarak, kontrol grubunda (CK-1, CK-2, CK-3 ve CK-4) ve deney grubunda sekiz tamamlayıcı DNA(cDNA) kitaplığı (T-1, T-2, T-3 ve T-4) toplam RNA ile oluşturuldu ve Illumina HiSeq2500 dizilimine tabi tutuldu(Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou , Çin). Kontrol grubu ve deney grubu için dizileme ve montaj sonuçlarına genel bakış Tablo 1'de gösterilmektedir. Gen ekspresyonu değişiklikleri, tedavi edilen ve kontrol grupları karşılaştırılarak analiz edildi. Şekil la'da gösterildiği gibi, naringenin'e maruz kalan grup, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında 1037 farklı şekilde eksprese edilmiş gen (DEG'ler) eksprese etti. 1037°'lik bir ısı haritası, kontrol grubu ve naringenin grubunun küme analizini gösterdi (Şekil 1b;381 yukarı ve 656 aşağı regüle edilmiş gen; Tablo S1, Ek Malzemeler).

Gen Ontology(GO) sınıflandırma sistemine göre, 1037° üç ana fonksiyonel kategoriye (biyolojik süreç, hücresel bileşen ve moleküler fonksiyon) ve 61 alt kategoriye ayrılmıştır(Şekil 2). Biyolojik süreç arasında, hücresel süreç (731) en yaygın olarak temsil edildi, bunu tek organizma süreci (672) ve biyolojik düzenleme (595) izledi. Hücresel bileşen kategorisinde, kümelerin önemli bir kısmı hücre(727), hücre parçası (721) ve organele(580) atanmıştır. Bağlanma (666) ve katalitik aktivite (238) gruplarına dahil olan genler, özellikle moleküler fonksiyon kategorisinde temsil edildi.

Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) sınıflandırması, yol notundaki en küçük q-değerine ve en büyük GeneNumber'a göre ilk yirmi biyokimyasal yola daha da sınıflandırılan 1037 DEG için bulundu (Şekil 3). İlk beş yolun gen sayısı ve açıklamalı genlerinin oranı, sistemik lupus eritematozus (yüzde 33,8.4), alkolizm (yüzde 38,9.67), kanserlerde transkripsiyonel yanlış regülasyon (yüzde 22, 5.6), PI3K-Akt sinyal yolu (34, yüzde 8.65 ) ve tamamlayıcı ve pıhtılaşma basamakları (12, yüzde 3.05 o). Beş yol arasında 10'dan fazla zenginleştirilmiş gen vardı. Genel olarak, naringenin tedavisine tabi tutulmanın HepaRG hücrelerinin global gen ekspresyon profili üzerinde önemli bir etkisi oldu. Bu sonuçlar, bu yollarda yer alan genlerin naringenin düzenlemesinde önemli roller oynayabileceğini ima etti.

2.2. Naringenin Yanıtında miRNA Transkript Düzeylerinin Analizi

olup olmadığını belirlemeyi amaçladık.naringeninmaruz kalma, HepaRG hücrelerinde miRNA'ların ekspresyon seviyelerini değiştirir. Maruz kaldıktan sonra, küçük RNA'lar topladık ve Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou, Çin) kullanarak göreceli bolluklarını ölçtük. Tablo 2'de gösterildiği gibi, kirletici okumaları çıkarıldıktan sonra sırasıyla sekiz numunenin temiz okumaları üretildi. Ham verilerden yüksek kaliteye ve kaliteli filtrelemeye sahip küçük RNA dizilimi için okumalara genel bir bakış Tablo 2'de verilmiştir. Küçük RNA'ların uzunluk dağılımları, 21-23 nt RNA'ların en bol olduğu kütüphaneler arasında benzerdi (Şekil 4 ).

Tüm küçük RNA'lar, ribozomal RNA'yı (rRNA), küçük koşullu RNA'yı (scRNA), küçük nükleolar (snoRNA), küçük nükleer (snRNA) ve transfer RNA'sı (tRNA). Referans genoma uygun olarak, ekzonlara, intronlara ve tekrar dizilerine eşlenen bu küçük RNA'lar da çıkarıldı. Filtrelenen küçük RNA'lar, miRNA'ları tanımlamak için miRBase veritabanına (Sürüm 21) karşı arandı. 3373 miRNA'nın ısı haritası, Şekil 5a'daki kontrol grubu ve naringenin grubunun küme analizini göstermektedir. Naringenin maruziyetine karşı kontrol numunelerinde analiz edilen 3373 miRNA'nın Illumina HiSeq2500 profili, HepaRG hücrelerinde toplam 234 farklı şekilde eksprese edilmiş miRNA'nın (DEM'ler, 174up ve 60 aşağı regüleli; Tablo S2, Ek Malzemeler) saptanabildiğini gösterdi (Şekil 5b) .

2.3.Naringenin Yanıtında mRNA ve miRNA İfade Profillerinin Hedef Tahmini ve Entegrasyon Analizi

Transkripsiyon sonrası düzeyde hareket eden miRNA'lar, hedef RNA bölünmesiyle hücresel mRNA gen ekspresyonunu susturur ve/veya aşağı düzenler. 234 DEM'in hedef genlerini tahmin etmek için RNAhybrid(v2.1.2) artı ışıklık (v6) kullanarak hesaplamalı analizler yaptık. .01), Miranda (v3.3a) ve TargetScan (Sürüm:7.0). Silico'da 234 DEM ve 1037 DEG seviyelerinin eşzamanlı profili, miRNA'ların varsayılan hedef mRNA'larını tanımlayabilir. DEG'lerin kesişimini ve DEM'lerin hedef genlerini seçtik ve ardından bu kesişme genleri üzerinde biyoinformatik analizi yaptık. 216 DEM ve 681 DEG'nin katılımıyla naringenin tedavisi için toplam 5607 negatif miRNA-mRNA çifti elde edildi (Tablo S3, Ek Malzemeler). GO sınıflandırma sistemine göre 681 DEG 58 alt kategoriye ayrılmıştır(Şekil 6). İlk üç alt kategori, transkriptom dizileme analizine kıyasla üç ana fonksiyonel kategoride değişmedi (Şekil 2 ve 6).

5607 negatif miRNA-mRNA çiftinin 681°'si için yol zenginleştirme analizi, naringenin maruziyetinden sonra yol notunda en küçük q-değerine ve en büyük GeneNumber'a göre ilk yirmi yolu tanımladı (Şekil 7): PI3K-Akt sinyal yolu ile(25,8.96 yüzde ) sekizinci yol ve en bol ikinci yol.

2.4. Karaciğer Metabolizmasında Naringenin Düzenlemesinin Gerçek Zamanlı qPCR Validasyonu ve Potansiyel Düzenleyici miRNA-mRNA Çiftleri

Küresel gen işlevi açıklamalarına, literatür incelemesine ve bunların naringenin duyarlı miRNA'lar, 19° (ALOX15, CA9, TH, HKDC1, NDUFA4L2, RRM2, ACSL5, PLA2G4C, LIPT2, UGDH, FTCD, ABAT, AZIN2, HS6ST3) ile olan potansiyel ilişkisine göre , B4GALT6, GUSB, DCT, ALAS2 ve MAT1A), karaciğer metabolizmasındaki potansiyel rolleri için temsilciler olarak manuel olarak seçildi. Ek olarak, PI3K-Akt sinyal yolu önemli ölçüde zenginleştirilmiştir (RNA-seq analizinin KEGG'sinde dördüncü, Şekil 3; miRNA-RNA-seq analizinin KEGG'sinde sekizinci, Şekil 7); bu nedenle PI3K-Akt sinyal yolu arasındaki 11°'ler (PDGFRB. CSF1R. FGFR2, IL2RG, IL7R, ITGB4, GNG4, PCK1, CREB3L3, CREB3L1 ve NFkB1) tarandı.

Burada 30° ve 11 insan miRNA'sı (hsa-miR-1306-5p, hsa-miR-627-3p, hsa-miR-194-3p, hsa-miR{{9) arasındaki etkileşimi tanımladık. }}p, hsa-miR-6837-5p, hsa-miR-429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR{{19} }a-3p, hsa-miR-7-5p ve hsa-miR-200a-5p), 20 negatif miRNA-mRNA etkileşimi dahil (Şekil 9). Şekil 9'da gösterildiği gibi, tek bir miRNA birden fazla hedef mRNA'yı düzenleyebilir ve bunun tersi de olabilir (örn. ABAT HS6ST3, B4GALT6 ve DCT muhtemelen hsa-miR-429 tarafından eş zamanlı olarak düzenlenebilir; HS6ST3 eş zamanlı olarak hsa-miR tarafından düzenlenebilir -429, hsa-miR-100-3p,hsa-miR-519a-3p, hsa-miR-676-3p, hsa-miR-7-5 p ve hsa-miR-194-5p; bazı DEG'lerin eşleştirilmiş DEM'leri yoktu). Karaciğer metabolizması ile ilgili 19°'nin ve PI3K-Akt sinyal yolu arasındaki 11°'nin ekspresyon profilleri, gerçek zamanlı qPCR kullanılarak ayrıca doğrulandı(Şekil 9a,b). 11 insan miRNA'sının (iki yukarı ve dokuz aşağı regüle edilmiş) ekspresyon seviyesi, sıralama sonuçlarıyla tutarlı gerçek zamanlı qPCR ile naringenin kaynaklı değişiklikler için ayrıca değerlendirildi (Şekil 9c). İki analitik platform arasında bazı nicel farklılıklar olmasına rağmen, RNA-seq verileri ile gerçek zamanlı PCR arasındaki benzerlikler, RNA-seq verilerinin tekrarlanabilir ve güvenilir olduğunu gösterdi.

3. Tartışma ve Sonuçlar

Burada tartışılan bulgular, HepaRG hücrelerinde paralel mRNA ve miRNA ekspresyonu değişiklikleri ile ilgili ilk ayrıntılı bilgiyi ortaya koymaktadır.naringenin. Naringenin tarafından indüklenen 234 DEM ve 1037 DEG dahil olmak üzere bu verilerin bütünleştirici bir analizini yaptık ve bu, naringenin düzenleyici mekanizmadaki miRNA-mRNA etkileşimleri hakkında küresel bir fikir veriyor. Gen işlevi açıklamalarına ve literatür incelemesine göre, metabolizma ile ilgili 19 derece tarandı. Özellikle, PI3K-Akt sinyal yolu, hem transkriptom dizilimi analizinde (en bol üçüncü ve dördüncü sırada) hem de miRNA-mRNA ekspresyon profillerinin entegrasyon analizinde (en bol ikinci ve sekizinci sırada) önemli ölçüde zenginleştirildi. naringenin yanıtlarında. Ek olarak, PI3K-Akt sinyal yolundaki 11°, gerçek zamanlı qPCR analizi kullanılarak ayrıca doğrulandı. Bu çalışmada, DEM'ler ve DEG'ler veri setlerine ve miRNA hedefleme bilgilerine göre bir miRNA-mRNA düzenleyici ağ oluşturduk. Bazı çalışmalar miRNA-mRNA düzenleyici ağın aşağıdakilere yanıt verdiğini göstermiştir.karaciğer hasarıhepatoselüler karsinom ve oksidatif stres dahil [15]. Birkaç miRNA kaynaklı RNA aktivasyon fenomeni tanımlanmış olsa da [16], çoğu durumda miRNA'lar ve hedef mRNA'ları arasındaki negatif korelasyon, genellikle miRNA hedeflemesi için destek olarak kabul edilir [17]. Sonuçta, karaciğer metabolizması ve PI3K-Akt sinyal yolunun katılımıyla 20 miRNA-mRNA negatif korelasyon çifti tanımlandı.

Küresel genlerle ilgili olarak, işlevsel kümelerle ilgili 19 dereceyi vurgulamak için yol analizi kullanarak özel araştırma sorumuzu ele aldık: Lipid metabolizması (ALOX15, ACSL5, PLA2G4C ve B4GALT6), Enerji metabolizması (CA9 ve NDUFA4L2) dahil metabolizma , Kofaktörlerin ve vitaminlerin metabolizması (TH, LIPT2 ve FTCD), Amino asit metabolizması (RRM2, AZIN2, DCT, ALAS2 ve MAT1A), Glikan biyosentezi ve metabolizması (HS6ST3 ve GUSB) ve Karbonhidrat metabolizması"(HKDC1, PCK1, UGDH ve ABAT) Metabolizma açısından zenginleştirilmiş bu 19°'ler öncelikle insülin duyarlılığı, lipid birikimi, glikojen depolaması ve enerji harcamasında rol oynar.Önceki çalışmalar alkolün neden olduğu farelerde ALOX15'in aşağı regülasyonunu bildirmiştir[18], BALB/C farelerinde CA9 [19], THin alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD)[20], HKDC1[21] ve UGDH'nin yukarı regülasyonu [22] oksidatif stresi, lipid birikimini ve karaciğer hasarını önemli ölçüde azaltabilir. NDUFA4L2'nin bastırılmış ROS birikiminin devre dışı bırakılması hepatosellüler karsinom (HCC) hücrelerinde hücre ölümü ve apoptoz [23]. RRM2 susturma, NCI-H929 hücre proliferasyonunu inhibe etti [24] ve FTCD aşırı ekspresyonu, DNA hasarını teşvik ederek ve HCC hücrelerinde hücre apoptozunu indükleyerek hücre proliferasyonunu baskıladı [25]. ACSL5'in ablasyonu, insülin duyarlılığını iyileştirdi ve farelerde enerji harcamasını artırdı ve trigliserit emilimini geciktirdi [26]. DCT takviyesi, yaşa bağlı karaciğer yağlanması ve iltihabını iyileştirdi [27]. PLA2G4C yıkım hücrelerinde yağ asidi ve hepatit C virüsü stimülasyonu üzerine lipid damlacık oluşumu bozulmuştur [28]. LIPT2'nin aşağı regülasyonu, yağ asidi sentezini inhibe etti [29]. ABAT [30], AZIN2 [31], B4GALT6 [32], HS6ST3 [33] ve GUSB'nin [34] yukarı regülasyonu, yağ asidi ve glikojen ayrışmasını destekleyebilir. ALAS2 aşırı ekspresyonu, karaciğer hematopoietik kapasitesini [35l] iyileştirebilir ve hepatositlerde eksprese edilen MAT1A, bu hücrelerin farklılaşmış durumunu korumuştur [36]. Yukarıda açıklanan bulgularla uyumlu olarak, sonuçlarımızdaki bu metabolik genlerin düzenlenmesi, naringenin'e yanıt olarak metabolizmayı iyileştirmek için uygun olabilir.

PI3K-Akt sinyal yolu, naringenin yanıtında çok önemli bir rol oynayan metabolizma, inflamasyon ve oksidatif stres [37] ile ilgili moleküler mekanizma için ipuçları sunabilir. PI3K-Akt sinyal yolu, besin taşıyıcılarının ve metabolik enzimlerin doğrudan düzenlenmesi veya glikoz metabolizması, biyosentez dahil olmak üzere metabolik yolların [38,39] temel bileşenlerinin ekspresyonunu düzenleyen transkripsiyon faktörlerinin kontrolü yoluyla hücresel metabolizma üzerinde çeşitli aşağı yönde etkilere sahiptir. makromoleküllerin ve redoks dengesinin korunması. PDGFRB susturmasının hepatik stellat hücrelerin aktivasyonunu ve proliferasyonunu inhibe ettiği ve karaciğer fibrozunu iyileştirdiği bildirilmiştir [40]. CSF1R ve FGFR2'nin işbirlikçi inhibisyonunun, tümör mikroçevresinde immün kaçınma ve anjiyogenezi hedefleyerek antitümör etkilerini artırması beklenir [41]. ITGB4'ün yıkılması, kanserle ilişkili fibroblastlarda glikolizi bastırdı [42]. PCK1'in genetik olarak yıkılması, oksidatif akışta, oksidatif streste ve inflamasyonda [43] yağ asidi kaynaklı bir artışı önledi, bu da insülin tarafından yönetilen sinyal yollarıyla [44] ilişkilidir. Nükleer CREB3L3'ün aşırı ekspresyonunun sistemik lipolizi, hepatik ketogenezi ve artan enerji harcaması ile insülin duyarlılığını indüklediği gösterilmiştir [45]. CREB3L1'in inhibisyonunun, kanser istilasını ve metastazı engellediği bildirildi [46]. NFkB, bağışıklık gelişimi, bağışıklık tepkileri, iltihaplanma ve kanserin önemli bir düzenleyicisidir [47]. NFkB'nin baskılanmasının anti-inflamatuar sinyalleri ilettiği ve inflamasyonu azalttığı iyi bilinmektedir [48]. PI3K-Akt sinyal yolunda, sonuçlarımız naringenin PDGFRB, PCK1, CREB3L1 ve NFkB1'in mRNA ifadelerini ilgili miRNA'larla (has-miR-1306-5p ve hsa-miR{{40}) önemli ölçüde aşağı regüle ettiğini gösterdi. }p) önemli ölçüde aşağı regüle ediliyor. Bu nedenle, verilerimiz naringenin'in PI3K-Akt sinyal yolunun inhibisyonu yoluyla anti-inflamatuar, anti-oksidatif stres ve iyileştirici metabolizmada yararlı bir rol oynayabileceğini öne sürdü.

Bu çalışma, naringenin cevaben karaciğerde mRNA-seq ve miRNA-seq analizini entegre eden ve naringenin düzenlemesinde bir metabolizma perspektifi sağlayan ilk çalışmadır. Metabolizma ve PI3K-Akt sinyal yolu açısından, 11 DEM, 30 DEG ve 20 miRNA-mRNA çifti, naringenin aktiviteleri için daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyar. Bu araştırmanın bazı sınırlılıkları vardır; örneğin, naringenin'in miRNA-mRNA etkileşimlerindeki doza bağımlı ve zamana bağlı etkileri hala belirsizdi. Silico'da analiz edilen verilen miRNA'lar düzenleyici kapasiteler önerse de, işlevlerinin canlı bir sistem içinde belirli bir bağlamda daha fazla onaylanması gerekir. Özetle, mRNA ve miRNA ekspresyonunu analiz eden ve metabolizmanın profilini çıkaran ön araştırmalar sağladık. MiRNA-mRNA çiftlerinin düzenleyici mekanizması, naringenin nutrasötik değerini açıklamak için olası ek kanıtlar olabilir.

4. Malzemeler ve Yöntemler

4.1. Kimyasallar ve tepkimeler

HepaRG hücre dizisi orijinal olarak Biopredic International'dan (Rennes, Fransa) satın alınmıştır.RPMI-1640 ortamı ve penisilin-streptomisin-glutamin çözeltisi Gibco'dan (Gaithersburg, MD, ABD) elde edilmiştir. Fetal sığır serumu (FBS), Corning'den (Auckland, Yeni Zelanda) satın alındı. Naringenin ve dimetil sülfoksit (DMSO), Sigma-Aldrich'ten (St.Louis, MO, ABD) alındı. TRIzolTM reaktifi Thermo Fisher (Carlsbad, CA, ABD) tarafından sağlandı. Ultra saf su, bir Milli-O akademik su arıtma sistemi (Millipore, Bedford, MA, ABD) ile saflaştırıldı. Diğer tüm reaktifler, mevcut en yüksek analitik dereceli ticarileştirilmiş ürünlerdi.

4.2. HepaRG Hücre Kültürü

HepaRG hücreleri, altı oyuklu plakalarda 5 x 10 x hücre/cm- oranında ekildi ve RPMI-1640 ortamında büyütüldü, 48 saat boyunca 100 uM naringenin ile veya onsuz kültürlendi ve yüzde 10 FBS ve yüzde 1 antibiyotik ile desteklendi (100 U/mL penisilin ve 100 ug/mLstrepto-misin) 37 derecede nemlendirilmiş yüzde 5 CO, inkübatörde. CK-1, CK-2, CK-3 ve CK-4 kontrol kontrol grubuna atıfta bulunur; T-1, T-2, T-3 ve T-4, 100 μM naringenin tedavi grubunu ifade eder. 1, 2, 3 ve 4 sayıları, dört bağımsız tekrarlanan deneyden alınan örnekleri temsil eder.

4.3.Toplam RNA Ekstraksiyonu

HepaRG hücreleri, iki kez buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı ve üretici tarafından tavsiye edildiği gibi TRIzolTM reaktifi ile toplandı. Üreticinin protokolüne göre her örneğin RNA kalitesini ve miktarını ölçmek için Thermo Scientific NanoDropTM2000 c Spektrofotometreler (Wilmington, DE, ABD) kullanıldı.

4.4.RNA Dizileme

MRNA, Oligo(dT) boncukları ile zenginleştirildi, daha sonra zenginleştirilmiş mRNA parçalandı ve OiaOuick PCR ekstraksiyon kiti (Qiagen, Venlo, Hollanda) tarafından rastgele primerlerle cDNA'ya ters transkript edildi. 18-30 nt boyut aralığındaki RNA molekülleri, poliakrilamid jel elektroforezi ile zenginleştirildi. 3' ve 5' adaptörler eklendi, ardından zenginleştirilmiş RNA'lar, üreticinin talimatlarına göre (Qiagen, Venlo, Hollanda) QiaQuick PCR ekstraksiyon kiti tarafından ters transkript edildi. Ligasyon ürünleri, agaroz jel elektroforezi ile boyut olarak seçildi. Naringenin grubunda dört, kontrol grubunda dört numune vardı. Her numune iki cDNA kitaplığı üretti: biri mRNA-seq için, diğeri miRNA-seg için. PCR ile amplifiye edilmiş ürünler, sırasıyla 16 cDNA kütüphanesi oluşturacak şekilde zenginleştirildi ve Genedenovo Biotechnology Co. (Guangzhou, Çin) tarafından Ⅲlumina HiSeq2500 kullanılarak dizilendi. RNA ve küçük RNA dizileme verileri, NCBI Dizi Okuma Arşivinde (SRR13675952'den SRR13675963'e kadar erişim numaraları) depolanmıştır.

4.5. Gerçek Zamanlı qPCR

mRNA'nın cDNA'ya transkripsiyonu, üreticinin talimatlarına göre 3 ug toplam RNA'dan GoScriptTM Ters Transkripsiyon Sistemi (Promega, Madison, WI, ABD) ile gerçekleştirildi. miRNA analizi için, 2 ug toplam RNA'dan miRNA First Strand cDNA Sentezi (Tailing Reaction, Sangon Biotech, Şangay, Çin) ile cDNA-sentezi yapıldı.

GoTaq® qPCR Master Mix ile（Promega, Madison, WI, ABD), üretici tarafından önerildiği şekilde LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Almanya) üzerinde. Termal döngü prosedürü, 10 dakika boyunca 95°C'de bir ilk denatürasyon ile başladı. Bunu, 95 derecede 10 saniye boyunca 45 döngü denatürasyon, 60 derecede 20 saniye primer bağlama ve 20 sat 72 derece uzama izledi. Prosedür, 5 saniye boyunca 95 derecede, 1 dakika boyunca 65 derece C'de bir nihai amplifikasyon, bir ayrışma eğrisi adımının eklenmesi ve bir soğutma adımı ile sona erdi. Primerler Sangon Biotech'ten (Shanghai, China) satın alındı. İmzanın doğrulanması için kullanılan primer çifti dizileri Tablo 3 ve 4'te açıklanmıştır. Ct değerleri -aktin veya U6'ya göre hesaplandı.

4.6.Biyoinformatik Analiz ve İstatistik

DEG'ler ve DEM'ler, R tabanlı bir yazılım paketi kullanılarak tanımlandı. DEG'lerin ve DEM'lerin seçimi için eşik değeri, q-değeriydi (düzeltilmiş p-değeri) 0'dan küçük veya ona eşit.05 ve kat değişimi (FC) Büyük veya eşit 2 veya Daha az 0,5'ten büyük veya 0,5'e eşit. DEG'leri ve DEM'leri analiz etmek için moleküler fonksiyonlar, biyolojik süreçler ve hücresel bileşenleri içeren KEGG ve GO sınıflandırması kullanıldı.

Biyolojik tahlilin sonuçları, GraphPad Prism 8'deki dört bağımsız deneye dayalı olarak ortalama ± SD biçiminde sunulur.

Ek Malzemeler: Aşağıdakiler https://www.mdpi.com/1422-0 067/22/5/2292/s1 adresinde çevrimiçi olarak mevcuttur: Tablo S1, Naringenin'e yanıt olarak 1037 farklı şekilde eksprese edilmiş mRNA'nın tanımlanması; Tablo S2, Naringenin'e yanıt olarak diferansiyel olarak eksprese edilen 234 miRNA'nın tanımlanması; Tablo S3, Toplamda 216 DEM ve 681 DEG dahil olmak üzere, naringenin yanıt olarak 5607 negatif miRNA-mRNA çiftinin tanımlanması

Referanslar

1. Salihi, B.; Fokou, PVT Naringenin Terapötik Potansiyeli: Klinik Araştırmaların Gözden Geçirilmesi. İlaç 2019, 12, 11. [CrossRef] [PubMed]

2. Bai, Y.; Peng, W.; Yang, C.; Zou, W.; Liu, M.; Wu, H.; Fan, L.; Dudak.; Zeng, X.; Su, W. Sıçanlarda, Köpeklerde, İnsanlarda Naringin ve Aktif Metabolit Naringenin'in Farmakokinetiği ve Metabolizması ve Türler Arasındaki Farklar. Ön. farmakol. 2020, 11, 364. [CrossRef]

3. Joshi, R.; Kulkarni, YA; Wairkar, S. Naringenin'in farmakokinetik, farmakodinamik ve formülasyon yönleri: Bir güncelleme. Hayat Bilimi. 2018, 215, 43–56. [Çapraz Referans]

4. Hernández-Aquino, E.; Muriel, P. Naringenin karaciğer hastalıklarında faydalı etkileri: Moleküler mekanizmalar. Dünya J. Gastroenterol. 2018, 24, 1679-1707. [Çapraz Referans]

5. Wang, Q.; O, Y.; Sarılmak.; Wen, C.; Yue, S.; Chen, C.; Xu, L.; Xie, J.; Dai, H.; Xiao, H.; et al. Naringenin, farelerde NLRP3 / NF-KB yolunu aşağı regüle ederek alkolsüz yağlı karaciğer hastalığını hafifletir. Br. J. Pharmacol. 2020, 177, 1806-1821. [Çapraz Referans]

6. Khan, TH; Ganaie, MA Naringenin, Wistar sıçanlarında oksidatif ve inflamatuar hasarı düzenleyerek böbrek dokularında doksorubisinin neden olduğu toksisiteyi önler. Kemer Fizyol. Biyokimya. 2020, 126, 300–307. [Çapraz Referans]

7. Wang, J.; Din, Y.; Zhou, W. Albümin, SPARC'a bağlı yollar yoluyla hepatik fibroz tedavisi için kendi kendini modifiye eden lipozomlar. Int. J. Ecz. 2020, 574, 118940. [CrossRef]

8. Kometsi, L.; Vali, K.; Mofo Mato, EP; Hurchund, R.; Owira, PMO Naringenin, oksidatif stresi azaltarak, hepatik nükleer faktör eritroid 2-ilgili faktör 2 proteininin hipergliseminin neden olduğu yukarı regülasyonunu hafifletir. J. Ecz. farmakol. 2020, 72, 1394–1404. [CrossRef] [PubMed]

9. Rossino, MG; Casini, G. Diyabetik Retinopati Tedavisi için Nutrasötikler. Besinler 2019, 11, 771. [CrossRef] [PubMed]

10. Hernández-Aquino, E.; Quezada-Ramirez, MA; Silva-Olivares, A.; Casas-Grajales, S.; Ramos-Tovar, E.; Flores-Beltrán, RE; Segovia, J.; Shibayama, M.; Muriel, P. Naringenin, hepatik stellat hücrelerin ve profifibrojenik yolakların inaktivasyonu yoluyla karaciğer fifibrozunun ilerlemesini hafifletir. Avro. J. Pharmacol. 2019, 865, 172730. [CrossRef] [PubMed]