RNA M6 A Okuyucu YTHDF2, NK Hücresi Antitümörünü ve Antiviral Bağışıklığı Kontrol Ediyor Bölüm 2

NK hücrelerinin antiviral fonksiyonu için YTHDF2 gereklidir

Ythdf2 eksikliğinin NK hücrelerinin antiviral aktivitesini etkileyip etkilemediğini belirlemek için, Ythdf2WT farelerine ve Ythdf2ΔNK farelerine 2,5 x 104 PFU MCMV enjekte ettik.

Sonuçlar, Ythdf2ΔNK farelerinin, Ythdf2WT farelerine kıyasla önemli kilo kaybı ve kanda, dalakta ve karaciğerde artan viral titrelerle gösterildiği gibi MCMV enfeksiyonuna daha duyarlı olduğunu gösterdi (Şekil 3, A ve B; ve Şekil S2, A ve B). .

Ayrıca enfeksiyondan sonra Ythdf2WT farelerindekilerle karşılaştırıldığında Ythdf2ΔNK farelerinin dalak ve kanındaki toplam NK hücrelerinin yüzdesinde ve mutlak sayısında önemli bir azalma gözlemledik (Şekil 3, C ve D; ve Şekil S2, C ve D). Daha ileri analizler, Ythdf2ΔNK farelerinden gelen NK hücrelerinin, Ythdf2WT farelerine göre önemli ölçüde daha düşük Ki67 ekspresyonuna sahip olduğunu gösterdi (Şekil 3, E-G).

Bununla birlikte, NK hücresi canlılığı, anneksin V boyamasıyla gösterildiği gibi, Ythdf2WT fareleri ve Ythdf2ΔNK fareleri arasında benzerdi (Şekil S2 E). Bu veriler, NK hücrelerinde YTHDF2 eksikliğinin, viral enfeksiyon sırasında hücrenin hayatta kalmasından ziyade hücre proliferasyonunda bir kusurla sonuçlandığını göstermektedir. NK hücreleri, aktive edici reseptörler Ly49H ve Ly49D yoluyla MCMV enfeksiyonunu inhibe eder ve süreç, performans veya IFN aracılı bir antiviral tepki ile karakterize edilir (Arase ve diğerleri, 2002; Lee ve diğerleri, 2009; Loh ve diğerleri, 2005; Orr). ve diğerleri, 2010; Sumaria ve diğerleri,2009).

Ythdf2ΔNK farelerinin, enfeksiyondan sonra Ythdf2WT farelerine kıyasla dalak ve kandaki Ly49H+ ve Ly49D+ NK hücrelerini önemli ölçüde azalttığını bulduk (Şekil 3, H–J; ve Şekil S2, F–K).

Daha ileri analizler, yüzde başına yalnızca Ly49D+Ly49H+ hücrelerinin Ythdf2WT fareleriyle karşılaştırıldığında Ythdf2ΔNK farelerinde bir fark göstermesine rağmen, Ly49D−Ly49H+ NK hücrelerinin, Ly49D+Ly49H− NK hücrelerinin ve Ly49D+Ly49H+ NK hücrelerinin mutlak hücre sayılarının Ythdf2ΔNK farelerinde dalak ve kanın tümü, enfeksiyondan sonra Ythdf2WT farelerine kıyasla önemli ölçüde azaldı (Şekil S2, L – W).

Verilerimiz, MCMV enfeksiyonunun YTHDF2 tarafından kontrol edilmesine esas olarak Ly49D+Ly49H+ NK hücrelerinin aracılık ettiğini göstermektedir. Ythdf2ΔNK farelerinde NK hücreleri tarafından granzim B ve IFN üretimi, Ythdf2WT farelerininkiyle karşılaştırılabilir düzeydeydi (Şekil S2, X ve Y).

Enfeksiyondan 7 gün sonra hem dalakta hem de kanda Ythdf2ΔNK farelerinde Ythdf2WT farelerine kıyasla performans üretiminin önemli ölçüde azaldığını bulduk (Şekil 3, K – M), bu, YTHDF2'nin esas olarak NK hücrelerinde MCMV'ye karşı performans aracılı antiviral aktiviteyi etkilediğini gösterir. Bu veriler YTHDF2'nin, MCMV enfeksiyonu sırasında NK hücre genişlemesi ve efektör fonksiyonu için kritik olduğunu öne sürüyor.

YTHDF2, NK hücre homeostazisini ve terminal olgunlaşmasını kararlı bir durumda kontrol eder

NK hücrelerinde Ythdf2 eksikliğinin tümör metastazlarını arttırdığına ve MCMV enfeksiyonunu kontrol etmek için NK hücre kapasitesinin bozulduğuna dair yukarıdaki bulgular, bizi kararlı bir durumda NK hücre bakımı için YTHDF2'nin gerekli olup olmadığını araştırmaya teşvik etti.

Şekil 4A'da gösterildiği gibi, NK hücrelerinin sıklığı ve mutlak sayısı Ythdf2WT fareleriyle karşılaştırıldığında Ythdf2ΔNK farelerinin periferik kanında, dalakında, karaciğerinde ve akciğerinde önemli ölçüde azaldı, ancak kemik iliğinde (BM) azalmadı.

Bununla birlikte, Ythdf2WT ve Ythdf2ΔNK fareleri (Şekil S3 A) arasında BM'deki (Fathman ve diğerleri, 2011) ortak lenfoid progenitörü, NK öncesi hücre progenatörü ve rafine NK hücre progenitörü (NKP) arasında önemli bir değişiklik yoktu; YTHDF2, modelimizde NK hücresinin erken gelişimini etkilemeyebilir.

Ythdf2ΔNK farelerinde NK hücrelerinin azalmasından sorumlu potansiyel mekanizmaları araştırmak için, kararlı bir durumda Ythdf2 silindikten sonra NK hücrelerinin hücre çoğalmasını, canlılığını ve trafik kabiliyetini araştırdık. Çoğalan NK hücrelerinin yüzdesi, Ki67 boyamasıyla kanıtlandığı gibi Ythdf2WT ve Ythdf2ΔNK fareleri arasında karşılaştırılabilir düzeydeydi (Şekil S3 B).

NK hücrelerinin canlılığı, anneksin V boyamasıyla gösterildiği gibi Ythdf2WT ve Ythdf2ΔNK fareleri arasında da eşdeğerdi (Şekil S3 C). YTHDF2'nin, NK hücrelerinin BM'den çevreye çıkışını etkileyip etkilemediğini kontrol etmek için, Ythdf2WT ve Ythdf2ΔNK farelerine, bağışıklık hücrelerini işaretlemek için iv olarak bir antiCD45 antikoru enjekte edildi ve 2 dakika sonra kurban edildi ve BM hücreleri analiz edildi.

Bu, sabit bir durumda BM'den periferik kana NK hücre trafiğinin bir göstergesi olan BM'nin sinüzoidal ve parankimal bölgelerindeki NK hücrelerinin sayısını ölçmemize olanak sağladı (Leong ve diğerleri, 2015). Sonuçlar, sinüzoidlerdeki Ythdf2WT fareleri ile karşılaştırıldığında Ythdf2ΔNK farelerinde CD45+ NK hücrelerinin sıklığında önemli bir azalma gösterdi (Şekil 4 B), bu da Ythdf2 eksikliğinin, NK hücrelerinin BM'den dolaşım sistemine in vivo çıkışını bozduğunu gösterir. .

Bağışıklık hücreleri, belirli viral enfeksiyonların neden olduğu veya kemoterapinin neden olduğu lenfopeni sırasında homeostatik proliferasyona uğrar (Sun ve diğerleri, 2011). YTHDF2'nin kararlı durumda NK hücre çoğalması için vazgeçilmez olduğunu bulmamıza rağmen, MCMV enfeksiyonu sırasında hücre çoğalmasında önemli bir azalma gözlemledik (Şekil 3, E-G). Bu nedenle YTHDF2'nin in vivo lenfopenik bir ortamda NK hücre homeostatik proliferasyonunu düzenlemedeki rolünü araştırdık.

CD45.2 Ythdf2ΔNK farelerinden veya CD45.1 kongenik farelerden eşit sayıda dalak NK hücresini lenfosit eksikliği olan Rag2-/−Il2rg-/- farelerine birlikte aktardık. Sonuçlar, hücre transferinden sonraki 3. günde CD45.2 Ythdf2ΔNK farelerine kıyasla CD45.1WT kontrol farelerinden daha büyük bir oranda NK hücresinin türetildiğini gösterdi (Şekil S3 D).

Daha ileri analizler, NK hücrelerinin Ythdf2ΔNK farelerinden azalmasının, hücre çoğalmasının bozulmasından (Şekil S3 E) kaynaklandığını, ancak hücre apoptozundan (Şekil S3 F) kaynaklanmadığını gösterdi; bu, YTHDF2'nin, lenfopenik koşullar altında in vivo NK hücre homeostatik çoğalmasını tahrik ettiğini ortaya koydu.

Fare NK hücrelerinin daha fazla farklılaşması, CD11b ve CD27 seviyelerine dayalı olarak olgunlaşmamış (CD11b−CD27+), orta olgun (CD11b+CD27+) ve terminal olgun (CD11b+CD27−) aşamalar halinde sınıflandırılabilir ( Chiossone ve diğerleri, 2009; Geiger ve Sun, 2016).

Ythdf2 ifadesinin olgunlaşmayla arttığını ve CD11b−CD27+, CD11b+CD27+, CD11b+CD27−'nin sırasıyla Ythdf2'nin en düşük, orta ve en yüksek ifade seviyelerini sergilediğini bulduk (Şekil S3 G), YTHDF2'nin NK hücresi olgunlaşmasında rol oynayabileceğini gösterir. Bu nedenle, hücre yüzey belirteçleri CD11b ve CD27 tarafından tanımlanan NK hücre olgunlaşmasında YTHDF2'nin rolünü araştırdık.

NK hücrelerinde Ythdf2 kaybının, terminal olgun NK hücrelerinin sıklığında önemli bir azalmaya ve/veya dalak, karaciğer, akciğer ve kandaki olgunlaşmamış ve orta olgun NK hücrelerinde artışa yol açtığını ancak BM'de bu durumun söz konusu olmadığını bulduk (Şekil 4 C ve NK hücreleri). Şekil S3 H), YTHDF2'nin terminal NK hücre olgunlaşmasını pozitif olarak düzenlediğini gösterir. Bu verilerle tutarlı olarak, terminal NK hücre olgunlaşma işaretçisi olan KLRG1 seviyeleri, dalak, karaciğer ve akciğerdeki Ythdf2ΔNK farelerinde önemli ölçüde düşüktü ancak BM ile karşılaştırıldığında anlamlı derecede düşüktü. karşılık gelen organ veya doku bölmelerindeki Ythdf2WT farelerininki (Şekil 4 D).

Ythdf2 eksikliği nedeniyle azalan olgun NK hücresi sayısının hücrenin içsel olup olmadığını belirlemek için, 1:1 oranında karıştırılmış CD45.1 WT ve CD45.2 Ythdf2ΔNK farelerinden BM hücreleri enjekte ederek Rag2−/−Il2rg−/− farelerinde kimeralar oluşturduk. oran. Transplantasyondan 8 hafta sonra akış sitometrisi ile gösterildiği gibi, CD45.2 Ythdf2ΔNK BM hücrelerinden, CD45.1 WT kontrol hücrelerine göre azaltılmış bir terminal olgun NK hücresi oranı elde edildi (Şekil 4 E), bu, NK hücresi terminal olgunlaşmasının YTHDF2 tarafından kontrol edildiğini gösterir. hücreye özgüdür.

T-box transkripsiyon faktörleri Eomes ve Tbet, NK hücresi olgunlaşması için kritik öneme sahiptir (Daussy ve diğerleri, 2014; Gordon ve diğerleri, 2012). Hücre içi boyama, Ythdf2WT farelerine kıyasla Ythdf2ΔNK farelerindeki NK hücrelerindeki Eomes protein seviyelerinde önemli bir azalma olduğunu ortaya çıkardı (Şekil S3 I). Ek olarak, Eomes'in protein ve mRNA seviyelerindeki azalmanın özellikle terminal olgun (CD11b+CD27−) NK hücrelerinde meydana geldiğini bulduk (Şekil S3,J-L).

Bununla birlikte, Eomes'in aksine, Tbet'in ekspresyonu, Ythdf2ΔNK ve Ythdf2WT fareleri (Şekil S3, I ve K) arasındaki NK hücrelerinde eşdeğerdi; bu, YTHDF2'nin muhtemelen Eomes'i hedef alarak NK hücresi terminal olgunlaşmasını düzenlediğini gösterir.