RNA M6 A Okuyucu YTHDF2, NK Hücresi Antitümörünü ve Antiviral Bağışıklığı Kontrol Ediyor Bölüm 3

IL-15 aracılı NK hücresinin hayatta kalması, çoğalması ve efektör fonksiyonları için YTHDF2 gereklidir

IL-15, NK hücrelerinin pleiotropik fonksiyonları için en önemli sitokin olmasa da biridir. Biz ve diğerleri daha önce IL-15'nin NK hücresi homeostazisinin, hayatta kalmasının ve efektör fonksiyonlarının düzenlenmesinde anahtar rol oynadığını keşfettik (Becknell ve Caligiuri, 2005; Carsonet ve diğerleri, 1997; Carson ve diğerleri, 1994; Wang ve diğerleri, 2019b;Yu ve diğerleri,2013).

Hücrelerin pleiotropisi, hücrelerin farklı ortamlarda farklı işlevleri yerine getirebilme yeteneklerini ifade eder. Hücre pleiotropisi bağışıklıkla yakından ilişkilidir çünkü bağışıklık sistemindeki birçok hücre çeşitli farklı roller oynayabilir.

Bağışıklık sisteminde T hücreleri çok kritik bir hücre türüdür. Patojenleri tanır ve onlara saldırır, aynı zamanda diğer bağışıklık hücrelerinin aktivitesini de düzenlerler. T hücrelerinin pleiotropisi çok önemlidir çünkü bağışıklık sistemi yeni bir patojenle karşılaştığında, T hücrelerinin etkili bir şekilde yanıt verebilmesi için kısa sürede farklı roller oynaması gerekir. Örneğin, bağışıklık sistemi bakteriyel bir enfeksiyonla karşılaştığında T hücrelerinin bakterileri öldürme rolünü oynaması gerekir; bağışıklık sistemi viral bir enfeksiyonla karşılaştığında T hücrelerinin diğer bağışıklık hücrelerini düzenleme rolünü oynaması gerekir.

Ayrıca bağışıklık sisteminde makrofaj adı verilen bir hücre sınıfının da pleiotropik etkileri vardır. Yabancı patojenleri fagosite edip parçalayabilirler ve ayrıca patojenlere saldırmak için diğer bağışıklık hücrelerini de etkinleştirebilirler. Makrofajların pleiotropisi önemlidir çünkü farklı ortamlarda farklı roller oynamaları gerekir. Örneğin viral enfeksiyonlarda makrofajların virüsle savaşmak için bazı maddeleri salgılaması gerekirken, bakteriyel enfeksiyonlarda makrofajların patojeni temizlemek için bakterileri yutup sindirmeleri gerekir.

Özetle hücresel pleiotropi ile bağışıklık arasında yakın bir ilişki vardır. Pleiotropik hücreler, farklı patojenlerin enfekte olduğu ortamlarda farklı roller oynayabilir, böylece bağışıklık sisteminin yanıt verme yeteneğini geliştirebilir ve vücudun çeşitli patojenlere karşı bağışıklığını geliştirebilir. Bu nedenle insan sağlığını korumak için hücrelerin pleiotropisine dikkat etmeli ve ayrıca bağışıklık gelişimini güçlendirmeliyiz. Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche Deserticola hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir, çünkü Cistanche Deserticola aynı zamanda asetilkolin ve büyüme faktörlerinin seviyelerini arttırmak gibi nörotransmitterlerin dengesini de düzenleyebilir. Bu maddeler hafıza ve öğrenme için çok önemlidir. Buna ek olarak, Cistanche Deserticola kan akışını iyileştirebilir ve oksijen dağıtımını destekleyebilir, bu da beynin yeterli besin ve enerji almasını sağlayarak beyin canlılığını ve dayanıklılığını artırır.

Belleğinizi geliştirmenin yollarını bilin'e tıklayın

Mevcut çalışmada, IL-15'nin NK hücrelerinde mRNA ve YTHDF2 protein düzeylerini yukarı regüle ettiğini gösterdik (Şekil 6 A; ve Şekil 1, D–F). Bu nedenle, NK hücrelerinin IL-15 aracılı hayatta kalması ve efektör fonksiyonları için YTHDF2'nin gerekli olduğunu tahmin ettik.

İlk olarak, YTHDF2 ifadesini doğrudan düzenleyen IL-15 sinyalinin aşağısındaki potansiyel transkripsiyon faktörlerini belirlemeye çalıştık. DNA Elementleri Ansiklopedisi'ni, JASPAR (http://jaspar.genereg) ile birlikte tüm genom boyunca bağlanma bölgelerine ilişkin tahminler sağlayan Kaliforniya Üniversitesi, Santa Cruz, Genom Tarayıcı Veri Tabanını (https://genome.ucsc.edu) kullanarak analiz ettik. .açık).

NK hücrelerinde IL-15'nin önemli bir aşağı akış faktörü olan STAT5'in, Ythdf2'nin transkripsiyon başlangıç ​​bölgesinin (TSS) 2 kb yukarı akışında dört bağlanma bölgesine sahip olduğunu bulduk; bu, IL-15'nin pozitif yönde olabileceğini gösterir. STAT5 aracılığıyla fare NK hücrelerinde Ythdf2 transkripsiyonunu düzenler.

STAT5 inhibitörü STAT5-IN-1 (Müller ve diğerleri, 2008) kullanarak, STAT5 inhibisyonunun, fare NK hücrelerinde hem mRNA hem de protein seviyelerinde Ythdf2'de bir azalmaya yol açtığını gösterdik (Şekil S4, A). ve B). YTHDF2'nin STAT5 tarafından düzenlenen bir aşağı akış faktörü olduğunu daha da doğrulamak için, STAT5'in fare NK hücrelerinde spesifik olarak silindiği Stat5fl/fl Ncr1-iCre farelerini (bundan sonra Stat5ΔNK fareleri olarak anılacaktır) kullandık (Wiedemann et diğerleri, 2020).

Stat5WT ve Stat5ΔNK farelerinden alınan splenicNK hücrelerini IL-15 ile tedavi ettik. YTHDF2'nin, hem RNA hem de protein seviyelerinde Stat5WT farelerindeki NK hücreleriyle karşılaştırıldığında Stat5ΔNK farelerindeki NK hücrelerinde önemli ölçüde azaldığını bulduk (Şekil 6, B ve C; ve Şekil S4, C ve D).

Lusiferaz raportör tahlili, hem STAT5a hem de STAT5b'nin Ythdf2 gen transkripsiyonunu doğrudan aktive ettiğini gösterdi (Şekil 6, D ve E). Kromatin immünopresipitasyonu (ChIP)-qPCR sonuçları, STAT5'in normal IgG kontrolüne göre dört bölgede önemli bir zenginleşmeye sahip olduğunu gösterdi; bu, fare NK hücrelerinde doğrudan bağlanmayı gösterir (Şekil 6 F). Sonuçlarımız birlikte, YTHDF2 ifadesinin NK hücrelerinde IL-15 sinyallemesinin aşağısındaki STAT5 tarafından düzenlendiğini göstermektedir.

Daha sonra Ythdf2-eksik NK hücrelerinin IL-15'ye verdikleri yanıtta kusurlu olup olmadığını merak ettik. Dalak NK hücrelerini Ythdf2ΔNK farelerinden ve Ythdf2WT farelerinden izole ettik ve bunları IL-15 varlığında min vitro kültürledik. Ythdf2WT farelerine kıyasla Ythdf2ΔNK farelerinde NK hücre büyümesinin önemli ölçüde azaldığını bulduk (Şekil 6 G). CellTrace Violet (CTV) etiketleme deneyi, NK hücrelerinin çoğalmasının Ythdf2 eksikliği nedeniyle bozulduğunu gösterdi (Şekil 6 H).

 Hücre döngüsü dağılım analizi, G0/G1 fazında Ythdf2ΔNK farelerinden gelen NK hücrelerinin fraksiyonunun önemli ölçüde arttığını, ancak S fazında Ythdf2ΔNK farelerinden gelen NK hücrelerinin fraksiyonunun önemli ölçüde azaldığını ortaya çıkardı (Şekil 6 I), bu da Ythdf2 eksikliğinin ortaya çıktığını düşündürmektedir. NK hücrelerinde G0/G1 faz durmasında.

Ek olarak, Ythdf2WT farelerine kıyasla Ythdf2ΔNK farelerindeki apoptotik (anneksin V+Sytox-Blue+/−) NK hücrelerinde iki ila üç kat artış vardı (Şekil 6 J), bu da NK hücrelerinin kaybından sonra kusurlu hayatta kaldığını gösterir. Ythdf2. Bu sonuçlar, YTHDF2'nin, NK hücrelerinin IL-15'ye in vitro duyarlılığını düzenlediğini göstermektedir. IL-15 zayıf bir şekilde çevrildiğinden ve kararlı bir durumda in vivo olarak salgılandığından (Corbel ve diğerleri, 1996; Fehniger ve diğerleri, 2001), Ythdf2-eksik NK hücrelerinin yanıtlarında kusurlu olup olmadığını araştırmak için IL-15'yi in vivo olarak farelere IL-15 ile tedavi ettik.

WT NK hücrelerine kıyasla Ythdf2-eksikliğinin, fareler IL-15 ile tedavi edildiğinde hücre çoğalmasının önemli ölçüde azaldığını ve hücre apoptozunun arttığını gösterdiğini bulduk (Şekil 6 K; ve Şekil S4, E–J).Bu veriler YTHDF2'nin, özellikle yüksek düzeyde IL-15 içeren bazı koşullar altında NK hücrelerinin IL-15'ye duyarlılığını düzenlediğini öne sürüyoruz. Ayrıca IFN-, granzim B ve perforinin mRNA ve protein seviyelerinin, IL-15'ye yanıt olarak Ythdf2WT NK hücreleriyle karşılaştırıldığında Ythdf2ΔNK NK hücrelerinde önemli ölçüde azaldığını bulduk (Şekil 6, L–N), bu da YTHDF2'nin ayrıca in vitro IL-15 aracılı NK hücre efektör fonksiyonlarına da katkıda bulunur.

Toplu olarak verilerimiz, YTHDF2'nin IL-15 aracılı NK hücresinin hayatta kalması, çoğalması ve efektör fonksiyonları için gerekli olduğunu göstermektedir. Daha sonra, YTHDF2'nin IL-15 aracılı NK hayatta kalmasını, çoğalmasını ve efektör fonksiyonunu düzenlediği aşağı yöndeki mekanizmaları araştırdık. Ythdf2ΔNK fareleri ve Ythdf2WT farelerinden alınan NK hücrelerinin benzer seviyelerde IL-15 reseptörleri CD122 (IL-15R) ve CD132'ye (IL-15Rc; Şekil S4 K) sahip olduğunu bulduk. IL-15 sinyaline, NK hücrelerinde en az üç aşağı yönlü sinyal yolu aracılık eder: Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR ve JAK1/3–STAT3/5 (Mishra ve diğerleri, 2014).

NK hücrelerinde hangi sinyal yolunun YTHDF2 tarafından düzenlendiğini araştırmak için, IL-15 ile uyarıldıktan sonra Ythdf2ΔNK farelerinden veya Ythdf2WT farelerinden NK hücrelerinde ERK, AKT, S6, STAT3 ve STAT5'in fosforilasyon seviyelerini inceledik.

Sonuçlar, Ythdf2 eksikliğinin, IL-15stimülasyonu üzerine ERK, AKT, S6 ve STAT3 fosforilasyonunu etkilemediğini gösterdi (Şekil S4, L ve M), ancak Ythdf{{'de STAT5'in fosforilasyon seviyelerinin azalmasıyla kanıtlandığı gibi, STAT5 aktivasyonunu önemli ölçüde inhibe etti. Ythdf2WT farelerindeki NK hücrelerindekinden daha 7}}eksik NK hücreleri (Şekil 6O), bu durum, aktive edilmiş NK hücrelerinde optimum IL-15/STAT5 sinyallemesi için YTHDF2'nin gerekli olduğunu gösterir.

IL-15'in aşağı akışında fosforile edilmiş STAT5'in Ythdf2 destekleyicisine bağlandığını gösterdiğimizden (Şekil 6, D–F) ve burada optimum STAT5 fosforilasyonu için YTHDF2'nin gerekli olduğunu gösterdiğimizden, verilerimiz aşağı yönde bir STAT5–YTHDF2 pozitif geri besleme döngüsü önerir NK hücrelerinin hayatta kalmasını, çoğalmasını ve efektör fonksiyonlarını kontrol edebilen IL-15.

Transkriptom çapındaki analiz, Tardbp'yi NK hücrelerinde bir YTHDF2 hedefi olarak tanımlar

YTHDF2'nin NK hücrelerini düzenlediği moleküler mekanizmayı ele almak için ilk önce IL-2 ile genişletilmiş Ythdf2WT ve Ythdf2ΔNK NK hücrelerinde RNA dizilimi (seq) gerçekleştirdik. NK hücrelerinde Ythdf2'nin silinmesi, 252 yukarı regüle edilmiş gen ve 365 aşağı regüle edilmiş gen dahil olmak üzere 617 farklı şekilde eksprese edilmiş genle sonuçlandı (Şekil S5 A).

Gen ontolojisi (GO) analizi, diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin, mitotiksitokinez, kromozom ayrımı, iğ, nükleozom, orta gövde ve kromozom dahil olmak üzere hücre döngüsü, hücre bölünmesi ve hücre bölünmesiyle ilgili işlemlerde önemli ölçüde zenginleştiğini gösterdi (Şekil 7). A).

Gen seti zenginleştirme analizi (GSEA), Ythdf2ΔNKNK hücrelerinde E2F hedeflerinin, G2 / Mcheckpoint'in ve mitotik iş mili ayırt edici gen setlerinin önemli ölçüde zenginleştiğini gösterdi (Şekil S5 B). Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 ve Plk1 (Bertoli ve diğerleri, 2013) dahil olmak üzere hücre döngüsü ve hücre bölünmesiyle ilişkili genler, Ythdf2ΔNK farelerinden NK hücrelerinde önemli ölçüde azaldı (Şekil 7 B) ).

Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 ve Tpx2 (Gorbsky, 2015) gibi iş mili ve kromozom segregasyon genleri de Ythdf2WT farelerinden alınan NK hücreleriyle karşılaştırıldığında Ythdf2ΔNK farelerinden alınan NK hücrelerinde önemli ölçüde aşağı regüle edildi (Şekil 7 C).

Ek olarak, Birc5 (Niu ve diğerleri, 2010), Septin4 (Larisch ve diğerleri, 2000) ve Rffl (Yanget diğerleri, 2007) dahil olmak üzere hücre hayatta kalma genleri, Ythdf2ΔNK farelerinden NK hücrelerinde önemli ölçüde azaldı (Şekil 1). 7D). Klrk1, Ncr1, CD226 ve Gzma (Bezman ve diğerleri, 2012) dahil olmak üzere NK hücre efektör fonksiyon genleri, Ythdf2ΔNK farelerinden alınan NK hücrelerinde de önemli ölçüde aşağı regüle edilmiştir (Şekil 7 D).

Bu veriler, NK hücre çoğalmasını, hayatta kalmasını ve efektör fonksiyonlarını düzenleyen YTHDF2in'in karakterize edilmiş rollerimizi desteklemektedir. Daha sonra, Ythdf2WT ve Ythdf2ΔNK farelerinden IL-2 ile genişletilmiş NK hücrelerinde m6A-seq gerçekleştirdik. Temel bileşen analizi, her genotipin üç biyolojik kopyasının bir arada kümelendiğini gösterdi (veriler gösterilmemiştir), bu da m6A-seq örneklerinin iyi tekrarlanabilirliğine işaret etmektedir.

Motif zenginleştirmenin hipergeometrik optimizasyonu (HOMER) analizi, m6A konsensüs motifini (GGAC) tanımlayarak m6A ile değiştirilmiş transkriptlerin başarılı bir şekilde zenginleştirildiğini gösterir (Şekil 7 E). m6A modifikasyonları ağırlıklı olarak protein kodlayan transkriptlerde konumlandırılmıştır ve zirveler, çevrilmemiş 59 bölgede (UTR) ve 39UTR'de, özellikle başlangıç ​​ve bitiş kodonlarının çevresinde zenginleştirilmiştir (Şekil 7 F ve Şekil S5 C).

m6A zirvelerine sahip genlerin GOzenginleştirme analizi, NK hücrelerindeki m6A işaretli transkriptlerin çoğunun, hücre döngüsü ve hücre proliferasyonuyla ilgili yollarda zenginleştiğini ortaya çıkardı (Şekil S5 D).

For more information:1950477648nn@gmail.com