Sıçanlarda Yüksek Doz Sisplatine Bağlı Oksidatif Karaciğer Hasarı Üzerine Taxifolin'in Etkisi

Lütfen iletişime geçinoscar.xiao@wecistanche.comdaha fazla bilgi için

Soyut

Arka fon. cisplatin, hücrede serbest radikal aktivitesinde artışa neden olan spesifik olmayan platin bazlı (türev) bir kemoterapötik ajandır. Taksifolinin antioksidan aktivitesi daha önce gösterilmiş ve taksifolinin hidroksi radikalini inhibe ettiği deneysel çalışmalarda bildirilmiştir. Hedefler. Güncel literatürde taksifolinin sisplatin kaynaklı oksidatif karaciğer hasarı üzerindeki koruyucu etkisini inceleyen hiçbir çalışmaya rastlanmamıştır. Deneysel bir çalışmada taksifolinin sisplatin kaynaklı hepatotoksisite üzerine koruyucu etkisini belirlemeyi amaçladık.

Malzemeler ve yöntemler. Toplam 18 albino Wistar erkek sıçan 3 gruba ayrıldı: sağlıklı kontroller (HC grubu), 8 gün boyunca uygulanan 5 mg/kg sisplatin (CIS grubu) ve 8 gün boyunca uygulanan 50 mg/kg taksifolin artı 5 mg/kg sisplatin (TCG Alınan karaciğer dokusunda malondialdehit (MDA), toplam glutatyon (TSH), toplam oksidan (OS) ve toplam antioksidan(TAS) kapasite seviyeleri ölçüldü.Sonuçlar Karaciğer MDA ve TOS seviyeleri CIS grubunda anlamlı olarak daha yüksekti. kontrast ve TAS seviyeleri tek başına sisplatin uygulanan CS grubunda anlamlı olarak daha düşüktü (p<0.00), compared="" to="" other="" groups.="" in="" the="" tcg="" group,="" administered="" cisplatin="" +="" taxifolin,="" mda="" and="" tos="" levels="" were="" significantly="" lower,="" whereas="" tsh="" and="" tas="" levels="" were="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" cis="" group=""><>

Daha fazla bilgi için lütfen buraya tıklayın

Koşullar. Bu sonuçlar, taksifolinin sisplatin ile ilişkili karaciğer hasarını önlemede faydalı olabileceğini düşündürmektedir. Anahtar Kelimeler: kanser, hepatotoksisite, sisplatin, taksifolin antioksidanı

Arka fon

Sisplatin mide, testis, yumurtalık, mesane, böbrek, üreterovezikal, baş ve boyun kanseri tedavisinde kullanılan spesifik olmayan platin bazlı (türev) bir kemoterapötik ajandır.1 Birçok organ ve sistemde ciddi toksik etkilere neden olduğu bildirilmiştir. tedavi sırasında.2-4 Sisplatinin kemoterapi-peutik etkinliği dozla birlikte artar. Ancak doz artışı nefrotoksisite, ototoksisite, nörotoksisite, hepatotoksisite, bulantı, kusma ve hastaların yüzde 67'sinde ishal gibi yan etkilere neden olarak klinik kullanımını sınırlar. karaciğer, oksidatif strese yol açar.7 İntravenöz olarak uygulanan sisplatin（180-480mg/m²） böbrek ve bağırsak dışında karaciğerde de yüksek konsantrasyonlara ulaşabilir ve önemli toksisiteye neden olabilir.8 Bu nedenle, en kritik yan etkilerin hepatotoksisite ve nefrotoksisite olduğunu bildirmiştir. Hepatotoksisite, serum transaminaz (alanin aminotransferaz(ALT) ve aspartat aminotransferaz (AST)) düzeylerinde bir artış olarak kendini gösterir. Tümör baskılayıcı olarak kullanılan tedavi dozunun bile hepatotoksisiteye neden olduğu gösterilmiştir.10 Sisplatinin yaralanma mekanizması iyi bilinmemekle birlikte, bazı kanıtlar bunun reaktif oksijen türlerinin (ROS) aktivitesine bağlı oksidatif stresten kaynaklandığını düşündürmektedir. ROS'un neden olduğu oksidatif stres, endojen bir antioksidan olan glutatyonda (GSH) azalmaya neden olur.

Ayrıca, ROS hücre zarı lipid peroksidasyonunu etkiler ve malondialdehit (MDA) gibi daha toksik ürünlerin ortaya çıkmasına neden olur."1 Bu, antioksidan tedavisinin sisplatin kaynaklı hepatotoksisiteyi önlemeye veya azaltmaya yardımcı olabileceğini düşündürmektedir. Çalışmalar, çeşitli antioksidanların sisplatin hepatotoksisitesine karşı koruyucudur.12 Ancak, sisplatinin neden olduğu hepatotoksisite, kullanımının istenen dozda sınırlandırılmasının önemli nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir.Bu nedenle, sisplatin hepatotoksisitesini hafifletmek için çeşitli araştırmalar sürdürülmektedir.Çalışmamızda, taksifolin olup olmadığını araştırdık. (3,3',4'5,7-pentahidroksiflava-none), soğan, deve dikeni, Fransız deniz kabuğu ve Douglas köknar kabuğunda bulunan bir flavonoid, sisplatinin hepatotoksisitesine karşı koruyucu bir etkiye sahiptir.13 Antioksidan taksifolinin aktivitesi belgelenmiştir.14 Deneysel çalışmalarda, taksifolinin hidroksil radikalini(OH), hücreyi Aron'u inhibe ettiği ve hücresel DNA'yı oksidatiften koruduğu rapor edilmiştir. e antioksidan aktivite ile hasar.15 Bu veriler, taksifolinin karaciğer dokusunu sisplatinin neden olduğu oksidatif hasara karşı koruyacağını düşündürmektedir.

Hedefler

Taksifolinin sisplatin kaynaklı karaciğer toksisitesi üzerindeki koruyucu etkilerine ilişkin literatür incelemelerinde hiçbir veri bulunamadı. Bu nedenle çalışmamız, sıçanlarda sisplatin kaynaklı hepatotoksisite üzerine taksifolinin koruyucu etkisinin olup olmadığını biyokimyasal analizlerle araştırmayı amaçlamıştır.

Materyaller ve yöntemler Çalışma hayvanları

On sekiz albino Wistar erkek sıçan (255-266 g) Atatürk Üniversitesi Tıbbi Deneysel Uygulama ve Araştırma Merkezi'nden (Erzurum, Türkiye) temin edildi. Deneyden önce hayvanlar laboratuarda 1 hafta süreyle normal oda sıcaklığında (22 derece) barındırıldı ve beslendi. Hayvan deneyleri, Laboratuar Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı için Ulusal Kılavuza göre yapıldı ve Atatürk Üniversitesi yerel hayvan etik kurulu tarafından onaylandı (onay No.75296309-050.01.04-E. 1800138920, 4 Mayıs 2018). Deneysel prosedür Deney hayvanları, sağlıklı kontrol (HC) grubu, 5 mg/kg sisplatin(CIS) grubu ve 50 mg/kg taksifolin artı 5 mg/kg sisplatin (TCG) grubuna ayrıldı. Bu deneyde gruptaki (n=6) ratlara oral gavaj yoluyla 50 mg/kg taxifolin (Evalar, Biysk, Rusya) verildi. CIS (n=6) ve HC(n=6) gruplarında çözücü olarak distile su oral olarak uygulandı. Literatürde sisplatinin toksisitesine karşı etkisi araştırılan ilaçlar genellikle deney hayvanlarına sisplatinden 1 saat önce uygulanmıştır. Taksifolin ve distile su uygulamasından bir saat sonra, TCG ve CIS gruplarından hayvanlara intraperitoneal olarak (İP) her 2 dozda toplam 4 doz cisplatin (Ebewe-Liba, İstanbul, Türkiye) enjekte edildi. gün.7 Taxifolin ve distile su aynı yöntemle 8 gün süreyle günde bir kez belirtilen doz ve hacimde uygulandı. Bu süre sonunda hayvanlar yüksek doz(50mg/kg) tiyopental(İE Ulagay, İstanbul, Türkiye) anestezisi ile sakrifiye edilerek karaciğer dokuları çıkarıldı. Çıkarılan karaciğer dokusunda malondialdehit, TSH, toplam oksidan durum(TOS) ve toplam antioksidan durum(TAS) seviyeleri ölçüldü. Ek olarak, anestezi uygulanmamış sıçanların lateral kuyruk damarından kan örnekleri toplandı ve 1500xg'de 10 dakika santrifüjlendi. Daha sonra serumda ALT ve AST aktivitesi ölçüldü.

Cistanche bağışıklığı artırabilir

biyokimyasal analizler

Diseksiyondan önce tüm konular fosfat tamponlu salin solüsyonu ile yıkandı.cistanche propiadadesKaraciğer dokuları, ölçülecek değişken için uygun olan buz gibi soğuk fosfat tamponlarında (50mM,pH7.4) homojenleştirildi. Doku homojenatları 5000 rpm'de 20 dakika 4 derecede santrifüjlendi ve süpernatanlar MDA, tGSH, TAS, TOS ve protein konsantrasyonunu analiz etmek için özümlendi. Süpernatantın protein konsantrasyonu, Bradford tarafından tarif edilen yöntem kullanılarak ölçüldü. Tüm doku sonuçları, protein gramına bölünerek ifade edildi.18 Tüm spektrofotometrik ölçümler, bir mikroplaka okuyucu (BioTek Powerwave XS"; BioTek⑩, Winooski, ABD) kullanılarak yapıldı.

malondialdehit analizi

Malondialdehit ölçümleri Ohkawa ve diğerleri tarafından kullanılan yönteme dayanmaktadır.cistanche tubulosa faydalarıtiyobarbitürik asit (TBA) ve MDA tarafından oluşturulan pembe renkli kompleksin spektrofotometrik olarak ölçülen absorbansını içerir. Kısaca, 25μL 80 g/L sodyum dodesil sülfat ve 1 mL karışım solüsyonu (20 g/L asetik asit artı 1.06 g 2-tiobarbitürat artı 180 mL damıtılmış su içeren bir solüsyona 25μL sık kullanılan homojenat eklendi. ). Karışım 95 derecede 1 saat inkübe edildi. Soğutulduktan sonra karışım, 4000 rpm'de 10 dakika santrifüjlendi. Süpernatantın absorbansı 532 nm'de ölçülmüştür. Standart eğri 1,1,3,3-tetra metoksi propan kullanılarak elde edildi.19 Toplam glutatyon (GSH) analizi

Toplam homojenattaki GSH miktarı, bazı modifikasyonlarla Sedlak ve ark.20 ve Baker ve ark.21 tarafından kullanılan yöntemle ölçülmüştür. Yöntemin prensibi koyu sarı 5-tio-2-nitrobenzoik asidin(TNB) renk yoğunluğudur. TNB, Ellman reaktifinin (5,5'-ditiobis (2-nitro benzoik asit)-DTNB) serbest tiyol grupları tarafından indirgenmesi yoluyla salınır ve 412 nm dalga boyunda (2 GSH artı DTNB→GSSG artı) ölçülür. 2 TNB, koyu sarı renkli bileşik).

İlk olarak, protein sülfhidril gruplarının Ellman reaktifi ile reaksiyonunu ortadan kaldırmak için tüm homojenat numunelerine deproteinizasyon işlemi uygulandı. Doku homojenatı 200 μL yüzde 25 trikloroasetik asit ile çökeltildi ve çökelti 2500 x g'de 4 derecede 5 dakika santrifüj edildikten sonra çıkarıldı. Elde edilen süpernatant, GSH seviyesini belirlemek için kullanıldı. Toplam 200 μL ölçüm tamponu (pH 8,9）'da 0,2 mmol/L etilendiamintetraasetik asit （EDTA） içeren 200 mmol/L Tris-HCl tamponu, 100μL süpernatant, 5μL DTNB （10 mmol/L metanol）, ve 5 μL glutatyon redüktaz-NADPHmix-3,75 mL 1 mM NADPH ve 80 μL 625 U/L glutatyon redüktaz) plakaya ilave edildi ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. DTNB bir kromojen olarak kullanıldı ve sülfhidril gruplarıyla sarı renkli bir kompleks oluşturdu. Absorbans, yukarıda bahsedilen bir spektrofotometre kullanılarak 412 nm'de ölçülmüştür. Standart eğri, azaltılmış GSH kullanılarak elde edildi. GSH standart eğrisine göre tüm dokuların GSH seviyeleri hesaplanır ve sonuçlar nmol GSH/mg protein olarak ifade edilir. Toplam antioksidan durumu (TAS)

ve toplam oksidatif durum (TOS) analizleri

Doku homojenatlarının TOS ve TAS seviyeleri, her ikisi de Erel tarafından geliştirilen yeni bir otomatik ölçüm yöntemi ve piyasada bulunan kitler (Rel Assay Diagnostics, Gaziantep, Türkiye) kullanılarak belirlendi. ABTS (2,2'-and-bis(3-etilbenzoti-azolin-6-sülfonik asit))radikal katyon antioksidanlarla ve 660 nm'de ölçümler yapılır. Sonuçlar nmol Trolox eşdeğeri/L olarak ifade edilir. TOS yönteminde, numunede bulunan oksidanlar, demir iyon-o-dianisidin kompleksini demir iyonuna oksitledi. Oksidasyon reaksiyonu, reaksiyon ortamında bol miktarda bulunan gliserol molekülleri tarafından geliştirilmiştir. Ferrik iyon, asidik bir ortamda ksilenol portakalı ile renkli bir kompleks üretti. 530 nm'de spektrofotometrik olarak ölçülebilen renk yoğunluğu, numunede bulunan toplam oksidan molekül miktarı ile ilgilidir. Sonuçlar nmolhidrojen peroksit (H2O2) eşdeğeri/L olarak ifade edilir. ALT ve AST analizi Serum ALT ve AST analizi, aynı şirkete ait spektrofotometrik yöntem ve kitler kullanılarak bir Roche Cobas 8000 otoanalizöründe yapıldı (sırasıyla REF:207649557-322,20764949-322; Roche Diagnostics, Basel, İsviçre) ). Her iki ölçümün prensibi, 340nm'de NADH'nin absorbans değişiminin ölçülmesine dayanmaktadır.

istatistiksel analizler

İstatistiksel analizler, IBM SPSSsoft-ware v.21.0(IBM Corp., Armonk, ABD) kullanılarak yapıldı.cistanche tubulosa ÇinceTahmini güç ({{0}}beta) test değeri G-Power Programı ile 0.99 olarak hesaplanmıştır(https://www.psychologie.hhu.de/ar-beitsgruppen/allgemeine-psychologie-und- arbeitspsy-chologie/gpower). Sayısal değişkenler medyan (min-maks) olarak ifade edildi. Sürekli değişkenlerin analizi için Kruskal-Wallis testi yapıldı. 2 arası gruplar için Dunn testi (post hoc karşılaştırma testi) yapıldı. İstatistiksel anlamlılık için minimum kriter p olarak belirlendi<0.05 for="" all="">

Sonuçlar

Tablo 1'de gösterildiği gibi, serum ALT ve AST aktivitesi, HC ve TCG grupları ile karşılaştırıldığında CIS grubunda önemli ölçüde daha yüksekti (p<>

Ortalama MDA seviyeleri karşılaştırıldığında, çalışma grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar bulundu(p<0.05). the="" amount="" of="" mda="" in="" the="" tcggroup="" was="" significantly="" decreased="" compared="" to="" the="" cis="" group=""><0.001), but="" no="" significant="" difference="" was="" found="" compared="" to="" the="" hc="" group="" (p="">0.05). Çalışma gruplarında ortalama TSH düzeyleri karşılaştırıldığında, gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark vardı(p<0.05). in="" the="" tcg="" group,="" the="" levels="" were="" significantly="" higher=""><0.001) compared="" to="" the="" cis="" hc="" groups(table="" 1).="" there="" was="" a="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" groups="" in="" terms="" of="" tos=""><0.05). the="">

Tartışma

Çalışmamızda, sıçanlarda sisplatin kaynaklı oksidatif karaciğer hasarı üzerine taksifolinin etkisi biyokimyasal olarak araştırıldı. Sisplatine bağlı karaciğer hasarını gösteren çok sayıda çalışma bulunmaktadır.7,24Araştırmamızda literatüre paralel olarak yüksek doz sisplatin maruziyeti sonrası serum ALT ve AST düzeyleri yükselmiştir. Bu değerler, taksifolin uygulamasından sonra düşmüştür. Sonuçlarımız, sisplatinin hayvan karaciğer dokusunda MDA ve TOS düzeylerinde artışa ve TAS düzeylerinde azalmaya neden olduğunu gösterdi. Oksidatif doku hasarını25 belirlemek ve ilaçların biyokimyasal toksisitesini değerlendirmek için oksidan-antioksidan parametreler kullanılır.26 CIS grubunda artan MDA üretimi, bu gruptaki karaciğer doku hücrelerinde lipid peroksidasyonunun şiddetlendiğini düşündürür. ROS, hücre zarındaki lipitlerin peroksidasyonuna yol açar ve lipitlerden MDA gibi daha toksik ürünlerin salgılanmasına neden olur.1 Malondialdehit, zarlardaki reseptörleri ve zara bağlı enzimleri inaktive ederek zar proteinlerine zarar verebilir. Membran bileşenlerinin çapraz bağlanması ve polimerizasyonu.27 LPO reaksiyonu, ya antioksidan reaksiyonların temizlenmesiyle sonlandırılır veya oto-katalitik yayılma reaksiyonları ile devam eder.cistanche28 Çalışmalar, sisplatinin hepatotoksik etkisinin patogenezinde ROS'un da rol oynadığını öne sürmüştür.7 Niu ve ark., sisplatin ile ilişkili karaciğer oksidatif hasarında MDA miktarının arttığını bildirmiştir.2 sisplatin uygulaması, sisplatin kaynaklı oksidatif stresi gösterir. MDA düzeyinin yüksek olduğu CIS grubunda TOS düzeyinin arttığı saptandı. TOS, biyolojik sistemlerde çeşitli oksidanların kümülatif oksidatif etkilerini belirlemek için kullanılır.23 Çalışmalar, sisplatinin sadece karaciğer dokusunda değil, böbrek dokusunda da TOS düzeylerini yükselttiğini göstermiştir.30 Bu, MDA ve TOS'un karaciğer dokusundaki seviyeleri arttı.

Yine bu çalışmada cisplatinin karaciğer dokusundaki miktarını TCG ve HC grubuna göre azalttığı gözlendi. ROS'un zararlı etkilerini önlemek için canlı organizmalar hem hücrede hem de hücre zarında çeşitli etkili koruma mekanizmaları geliştirir. Bu mekanizmalar hem radikal üretimini bloke ederek hem de oluşan radikallerin zararlı etkilerini ortadan kaldırarak hareket eder. Glutamat, L-sistein ve glisinden oluşan bir tripeptit olan glutatyon, canlı dokularda en iyi bilinen antioksidanlardan biridir. Glutatyon, aktif bölgesinde enzim içeren selenyum olan glutatyon peroksidaz enzimini katalize ederek, bir antioksidan görevi görerek ve hücrelerden H, O'yu uzaklaştırarak H, O2 ve organik peroksitlerle reaksiyona girer. Glutatyon, hidrojen peroksit veya organik oksitleri kimyasal olarak detoksifiye eder ve hücreleri ROS hasarından korur.31 Çalışmamızda, sisplatinin antioksidan mekanizmalar üzerindeki inhibitör etkisini araştırmak için TAS düzeyi ölçüldü. Test sonuçlarımız azalma intakt ve TAS düzeyi arasında bir korelasyon olduğunu gösterdi. Niu et al.ne kadar cistanche alınırsisplatinin karaciğer dokusunda GSH ve TAS düzeylerini azaltarak oksidatif stres ürettiğini bildirmiştir.29

Sisplatin ile indüklenen oksidatif karaciğer hasarına karşı kullanılan Taxifolin, MDA ve TOS düzeylerindeki artışı önemli ölçüde inhibe ederken, tGSH ve TAS düzeylerini düşürmüştür. Taksifolinin hücre içi serbest radikal düzeylerini azalttığı, MDA'yı inhibe ettiği ve antioksidan tüketimini önlediği daha önceki çalışmalarda belgelenmiştir. 32 Başka bir çalışmada ise taksifolinin GSH'nin etkisini artırdığı bulunmuştur.3

Yukarıda belirtildiği gibi, taksifolin bir flavonoiddir.13Önceki çalışmalar flavonoidlerin lipid peroksidasyonunu ve serbest radikallerin oluşumundan sorumlu enzimatik reaksiyonları inhibe ederek antioksidan aktivite gösterdiğini ifade etmiştir.34 lipid peroksidasyon yolunu inhibe ederek antioksidan aktivite.35 Toplam olarak bakıldığında, gözden geçirilen literatürden elde edilen veriler deneysel sonuçlarımızla uyumludur.

Kısıtlılıklar Çalışmamızda, sisplatin toksisitesinin patogenezinde rol oynadığı bilinen taksifolinin proinflamatuar sitokin düzeyleri üzerine etkisinin araştırılması, sisplatinin neden olduğu hepatotoksisiteye karşı koruyucu etkisinin netleştirilmesi için gerekli olmuştur. Ayrıca histopatolojik bulgular tüm biyokimyasal bulguları desteklemelidir. Gruplardaki hayvan sayısının az olması da bir diğer kısıtlılık olarak değerlendirilebilir.

Sonuçlar

Sonuç olarak, sisplatin hayvanların karaciğer dokusunda oksidatif hasara neden oldu. CIS grubunda oksidanlara karşı oksidan-antioksidan dengesi bozuldu. Taxifolin, sisplatin nedeniyle yaralanan karaciğer dokusunda oksidanların artmasını ve antioksidanların azalmasını engelledi. Taxifolin, oksidan-antioksidan dengesinde oksidanlar lehine değişimi engellemiştir. Bu bulgular, taksifolinin kemoterapi prosedürlerinden kaynaklanan hepatotoksisiteyi tedavi etmek için klinik olarak faydalı bir ajan olabileceğini düşündürmektedir.

Bu makale N. Kurt ve ark. Taksifolinin antioksidan etkisi