Üzüm ve Şarap Oksidasyonunun Potansiyel Belirteçleri Olarak (artı)-Catechin—Lakkaz Dimerik Reaksiyon Ürünlerinin Belirsiz NMR Yapısal Belirlenmesi

Daha fazla ayrıntı için iletişim:tina.xiang@wecistanche.com

Soyut:( artı )-Catechin—lakkazoksidasyondimerik standartlar Trametes Versicolor'dan elde edilen lakkaz kullanılarak hemi-sentezlendi, pH 3.6'da bir su-etanol çözeltisidir. Sekiz potansiyel oksidasyon dimerik ürüne karşılık gelen sekiz fraksiyon tespit edildi. Fraksiyon profilleri, diğer iki oksidoredüktaz ile elde edilen profillerle karşılaştırıldı:polifenol oksidazBotrytis cinerea'dan üzüm ve lakkazdan ekstrakte edilmiştir. Profiller çok benzerdi, ancak bazı küçük farklılıklar bu enzimlerin reaktivitesinde olası farklılıklar olduğunu gösterdi. Beş fraksiyon daha sonra izole edildi ve 1D ve 2D NMR spektroskopisi ile analiz edildi. Asetonda çözündürülen numunelere eser miktarda kadmiyum nitrat eklenmesi fenolik protonların tamamen çözülmüş NMR sinyallerine yol açarak, iki enantiyomer içeren fraksiyonlardan biri olan altı reaksiyon ürününün kesin yapısal belirlenmesine izin verdi. Bu ürünler ayrıca şarap yapımı ve şarap yıllandırması sırasında şaraptaki varlıklarını ve evrimini araştırmak için oksidasyon belirteçleri olarak kullanılabilir.

anahtar kelimeler: oksidasyon belirteci;( artı )-kateşin; fenolik NMR sinyalleri; lakkaz; kadmiyum nitrat; polifenol oksidaz

Daha fazla bilgi almak için tıklayın

1. Giriş

polifenollerdoğada yaygın olarak bulunan bir kimyasal bileşikler ailesidir. Çay [1], kakao [2,3], yaban mersini [4], üzüm [5l ve şarap [6] gibi fermente ürünlerde önemli miktarlarda bulunurlar. Birincil oksidasyon hedefleri olan J7,8], polifenollerin kimyasal yapıları sürekli olarak gelişir. Bu değişiklikler birçok gıda türünün organoleptik özelliklerini etkiler; yiyeceklerin kararması [9] ve şarabın duyusal özelliklerindeki değişiklikler [10,11] gibi olaylardan sorumludurlar. Enolojide bu oksidasyon olayı üzümlerde veya şaraplarda gerçekleşir. Enzimatik oksidasyon ile ilgili olarak, esmerleşmeden sorumlu ana enzimler, daha doğrusu, oksidoredüktazlardır.polifenol oksidazBotrytis cinerea tarafından üretilen üzüm ve lakkazda bulunur [12].

enzimatikoksidasyonesas olarak üzüm şırasında meydana gelir, ancak şarapta daha fazla esmerleşme, kimyasal oksidasyon reaksiyonlarından |7,13] veya şarap yıllandırması sırasında çok stabil olabilen Botrytis cinerea lakkazından dolayı olabilir14. Fenolik substratlar üzerinde iki oksidasyon enzimatik aktivite meydana gelebilir: mevcut bir hidroksil grubunun bitişik pozisyonun hidroksilasyonu ile karakterize edilen monofenol oksidaz aktivitesi ve orto-dihidroksibenzenlerin orto-benzokinonlara oksidasyonuna karşılık gelen difenol oksidaz aktivitesi.

Uluslararası Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Birliği'nin (NC-IUBMB) Adlandırma Komitesi'ne göre, bu enzimatik aktiviteler oksidoredüktazlara karşılık gelen EC1-sınıfı enzimler tarafından katalize edilir. Bunlar arasında, polifenol oksidasyonunu katalize eden üç ana oksidoredüktaz sınıfı, EC1.14.18.1 (monofenol monooksijenaz), EC1.11.1 (peroksidaz/POD) ve EC1.10.3'tür (difenoller üzerinde etkili olan oksidoredüktazlar).

Bu son sınıf farklı alt sınıflara bölünmüştür ve bunlardan ikisi bu çalışma için özellikle ilgi çekici görünmektedir: EC1.10.3.1(polifenol oksidaz/PPO) ve EC1.10.3.2 (lakkaz)(Bkz. Ek Malzemeler Şekil S1).

PPO, lakkaz ve peroksidaz, üzüm işleme sırasında esmerleşmeden esas olarak sorumlu olan oksidoredüktazlardır [13]. POD'un neden olduğu esmerleşme meyvelerde önemsizdir ancak PPO ile birleştirildiğinde fenollerin bozulmasını artırabilir[15]. PPO, üzümlerde doğal olarak bulunur ve monofenollerin katekollere ve katekollerin kahverengi pigmentlere oksidasyonunu katalize edebilir [8,13,16]. Botrytis ile enfekte olmuş üzümlerde meydana gelen lakkazlar, birçok farklı substratın oksidasyonunu katalize edebildikleri için|17| daha geniş bir etki spektrumuna sahiptir. Ana lakkazların oksidasyon hedefleri 1-2 ve 1-4 dihidroksibenzen olarak kalır.

Şarapta oksidasyonla (PPO veya lakkazlar) üretilen benzokinon, redoks özelliklerine ve elektronik afinitelerine bağlı olarak kolaylıkla başka reaksiyonlara girebilir [15]. Elektrofiller olarak hareket edebilirler ve amino türevleri ile reaksiyona girebilirler [18] veya oksitleyiciler olarak hareket edebilirler ve diğerlerinin yanı sıra fenolik substratlarla reaksiyona girebilirler. Kimyasal yapılarına (kinon veya yarı kinon) bağlı olarak, benzokinon farklı oksidasyon reaksiyon ürünlerine yol açabilir. Nötr bir pH'ta, (artı )-kateşin, A halkası konumu C5 veya C7'de kinon'a oksitlenecek ve B halkası konumu C2', C5' veya Üst kateşin ünitesinin C6' ve alt ünitenin A-halka konumu C6 veya C8 [19,20]. Dehidrodikateşin, bu eşleşmenin iyi bilinen bir ürünüdür [21]. Yapıların etiketleme pozisyonları Şekil 1'de gösterilmektedir. Asidik koşullar altında, B-halkasında (OH3' veya OH4' pozisyonu) yarı-kinon formları da bulunabilir ve dört olası dimerik izomere [20,22] yol açar. üst kateşin ünitesi ve alt ünitenin A halkası (konum C6 veya C8). Kateşin enzimatik oksidasyonu önceki çalışmalarda [22,23] araştırıldı ve ilişkili oksidasyon ürünleri HPLC [24] ile karakterize edildi, ancak daha nadiren izole edildi ve hiçbir zaman NMR ile tam olarak karakterize edilmedi.

Bu çalışmanın amacı ilk olarak UHPLC-MS ile üç oksidoredüktaz ekstraktı, yani üzümlerden ekstrakte edilen PPO, botrytize tatlı şaraplarda bulunan Botrytis cinerea mantarından lakkaz varlığında dimerik(artı)-kateşin oksidasyon ürünleri profillerini karşılaştırmaktı. [14] ve Trametes Versicolor'dan lakkaz.

İkinci amaç, Trametes Versicolor'dan lakkaz ile elde edilen NMR spektroskopisi ile bazı dimerik oksidasyon ürünlerinin yapılarını hemisentize etmek ve karakterize etmektir.

2. Sonuçlar ve Tartışma

2.1. Dimerik Reaksiyon Ürünleri Profillerinin Üç Farklı Oksidoredüktaz ve( artı )-Kateşin ile Karşılaştırılması

(artı )-Catechin ilk olarak model şarap solüsyonunda Trametes Versicolor'dan lakkaz varlığında pH 3.6'da oksitlendi. Dimerik fraksiyonun kalıntı(artı)-kateşin ve diğer polimerik fraksiyonlardan ayrılmasından sonra, sekiz ana fraksiyon toplandı ve UHPLC-UV-MS ile analiz edildi, N1'den N8'e artan alıkonma süresi sırasında not edildi (Tablo 1). Pozitif moddaki elektrosprey kütle spektrumu, varsayımsal olarak iki kateşin birimi arasında tek bir bağ tarafından oluşturulan bir dimere karşılık gelen ve m/z 579'da m/z 579'da iyon tepelerini [M artı H] artı gösterdi ve [M artı H] artı N7 ve N8 için m/577, varsayımsal olarak ek bir bağlantının oluşumunu önerir.

Bu sekizoksidasyonfraksiyonlar, önceki çalışmalarda [25,26] bir tanen fraksiyonunun kimyasal depolimerizasyonundan sonra potansiyel olarak gözlendi ve muhtemelen Guyot ve diğerleri tarafından halihazırda tarif edilenlerle aynı olabilir. [20], deneysel koşullar biraz farklı olsa bile. Aslında, bu önceki çalışmada, sekiz fraksiyon elde etmek için pH3 ve 6'da ham bir PPO özütü kullanıldı. Bu çalışmada, model şarap çözeltisinde pH 3.6'da üç farklı enzim karşılaştırıldı. Üç farklı enzimle (Trametes Versicolor'dan lakkaz, Botrytis cinerea'dan lak-kase ve üzümlerden ekstrakte edilen polifenol oksidaz) elde edilen ana oksidasyon fraksiyonlarının LC-MS karşılaştırmalı analizi Tablo 2'de sunulmuştur. Sekiz fraksiyonun her biri için, alıkonma süreleri, farklı enzimlerle hemen hemen aynıydı ve benzer m/z, MS analizi ile belirlendi. Bu sonuçlar, Guyot ve ark. [20]. Lopez-Serrano ve Ros Barcel6 [27] ayrıca (artı )-kateşin oksidasyon ürünlerinin iki farklı enzimle karşılaştırmalı bir çalışmasını gerçekleştirdi: peroksidaz ve polifenol oksidaz, her ikisi de çileklerden ekstrakte edildi. İki enzimle elde edilen ürünlerin niteliksel olarak aynı olduğu sonucuna varmışlardır. Botrytis cinerea'dan lakkaz ve ekstrakte edilmiş PPO ile yapılan deneylerde m/z=578 Th ve Rt=15.66 dk ile N4' adlı ek bir bileşik gözlemlendi, ancak Trametes Versicolor'dan lakkaz ile değil, bu da olası farklılıkları ortaya koyuyor. Bu enzimler için reaktivitede.

2.2. 1H-NMR Fenolik ve Alifatik OH Sinyallerinde Fizikokimyasal Parametrelerin Çalışması ve Optimizasyonu

Prosiyanidin dimerlerinin yapısal karakterizasyonu NMR analizi ile elde edilebilir. Özellikle, birimler arasındaki kesin bağlantı konumu, HMBC ve/veya ROESY korelasyon spektrumları [28,29] (Şekil S2 ve S3) kullanılarak belirlenebilir. Bir eter tipi (COC) bağ durumunda, hidroksil sinyal protonlarının atfedilmesi gereklidir. Bazı alifatik veya aromatik protonların üst üste gelmesi veya bazı anahtar korelasyonların eksik olması, CC bağlantılarında da çok önemli olabilir. Bununla birlikte, bir aprotik çözücüde bile, polifenollerin hidroksil protonları, çoğu zaman, hiçbir yapısal bilgi elde edilemeyen geniş sinyaller olarak görünür [30]. Bu sorun, izlerin eklenmesiyle geçici olarak ele alındı.

Örnek çözeltilerde Cd(NO3)2. Aslında, OH gruplarının H geniş sinyalleri, bu OH protonları ile çözücü veya çözünen içindeki diğer protonlar arasındaki moleküller arası değişimden kaynaklanmaktadır. Moleküller arası bağları azaltarak, numunelerde kadmiyum nitratın varlığı bu değişimleri azaltabilir, böylece OH proton sinyallerinin keskinliğini iyileştirebilir.

2.2.1.Kadmiyum İlavesinin Etkisi

Dondurarak kurutmadan sonra, beş fraksiyon N2, N3, N4, N6 ve N8 aseton-dg içinde çözündürüldü. Daha sonra, 1D proton NMR spektrumları, 25 derecede önce (Şekil 2A) ve az miktarda kadmiyum ilavesinden sonra (Şekil 2B) elde edildi. Saf aseton-d'de, tüm fraksiyonların fenolik OH protonları geniş tepeler olarak göründü. Kadmiyum ilavesinden sonra, bu protonlar N6 ve N8 fraksiyonları durumunda yüksek oranda çözülmüş sinyaller gösterirken, N2, N3 ve N4 fraksiyonları için sinyaller sadece biraz daha keskindi. Ayrıca, örneklere art arda küçük miktarlarda Cd eklendiğinde tepe çizgisi genişliğinin keskinliği veya genişliği gözlenmediğinden, Cd içeriğinin arttırılmasının OH sinyal çözünürlüğü üzerinde hiçbir etkisi olmadığı belirtilmelidir (veriler gösterilmemiştir).

N2, N3 ve N4 ürünlerinden yüksek oranda çözülmüş fenolik OH sinyalleri, ilave kurutma ve yeniden çözündürme sayesinde elde edildi (Şekil 2C,D).

Fraksiyonlar arasında Cd ilavesi üzerine davranış farkı, moleküler etkileşimlerin gücü ile açıklanabilir: N2, N3 ve N4 durumunda N6 ve N8'e kıyasla daha güçlü, bu bağları kırmak için bir başka adım gereklidir.

Bu ek adım, numunelerin kökeni, sentez reaksiyonu veya doğal polifenolik ürünler ne olursa olsun, herhangi bir durumda yüksek oranda çözülmüş fenolik OH sinyalleri elde etmek için Cd kullanıldığında anahtar adım olabilir.

Belirgin yapısal karakterizasyonu ile ilgilenen önceki bir çalışmapolifenolkadmiyum nitrat ilavesi sayesinde yüksek oranda çözülmüş OH fenolik NMR sinyalleri kullanan dimerler 1996'da yayınlandı[30]. Bildiğimiz kadarıyla, o zamandan beri bu metodolojiyi kullanan başka bir araştırma makalesi yayınlanmadı. Daha sonra, bu amaca ulaşmak için, ya pikrik asit dozlu eklemeler [31] ya da düşük bir alım sıcaklığı [32] kullanılarak başka araştırmalar yapılmıştır. Bu, yukarıda açıklandığı gibi Cd ilavesiyle OH tepe keskinliği üzerinde belirleyici bir etki elde etmek için gerekli olan diğer adımla açıklanabilir. Bununla birlikte, kadmiyum çok değerli görünmektedir, çünkü düşük sıcaklıklarda pikrik asit veya NMR spektrumlarının elde edilmesinin aksine, kesin miktarlar eklemeye gerek kalmadan yüksek oranda çözülmüş sinyaller elde edilebilmektedir.

2.2.2. Sıcaklığın Etkisi

Sıcaklığın 25 derece C'den 15 dereceye düşmesinin fenolik OH veya alifatik OH sinyallerinin keskinliği üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır. Bununla birlikte, değişebilir proton tepe noktalarının aşağı alan kaymaları, örtüşen bazı fenolik ve alifatik OH sinyallerini ayırmamıza izin vererek, tanımlamalarını daha açık hale getirdi (Şekil 3). Sıcaklık düşürülerek proton değişim oranı düşürüldü ve daha keskin alifatik OH tepe noktaları beklenebilir [31]. 15 derecelik sıcaklık açıkça iyi çözülmüş alifatik OH sinyalleri elde etmek için yeterince düşük değildir. Bununla birlikte, N3 ve N6 numunelerinde iki alifatik OH protonunun ve N8 numunesinde bir tane alifatik OH protonunun rezonansını açıkça belirlememize izin verdi. N2 numunesinin spektrumu ayrıca, 25 derece C'de 15 dereceden daha ayırt edilebilir olan iki OH alifatik proton sinyali sergiledi (Şekil 2E). N4 numunesi durumunda, alifatik OH'den kaynaklanan sinyaller yalnızca kısmen görülebilirdi. sürekli örtüşme nedeniyle sıcaklığın 25 derece veya 15 derece C'ye ayarlanıp ayarlanmadığını spektrumları (Şekil 2E).

2.3.Dimerik Standartların Yapısal Karakterizasyonu—NMR Spektrum Analizi

N2, N3, N4, N6 ve N8 fraksiyonlarının NMR spektrumları, oksidasyon ürünlerinin yüksek saflıkta olduğunu gösterdi, çünkü tespit edilen diğer bileşiklerin sinyal yoğunlukları, bu ürünlerinkiyle karşılaştırıldığında yüzde 10'dan daha azdı.

Tüm spektrumlarda, kateşin birimlerine özgü dört lH kimyasal kayma bölgesi ayırt edilebilir (Şekil 2C): piran halkalarının (C halkaları) alifatik protonlarının sinyalleri 2.3 ila 5.0 ppm arasındaki bölgede bulunur, ve resorsinol halkalarının (A halkaları) ve katekol halkalarının (Brings) aromatik sinyal protonları sırasıyla 5.5 ila 6.3 ppm ve 6.3 ila 7.1 ppm arasındadır. Hem A hem de B halkalarının OH fenol sinyalleri 7.1 ila 10 ppm arasında göründü. Her iki fraksiyonun NMR spektrumu, sabit bir yoğunluk oranında kateşin birimlerinin farklı sinyal setlerinin varlığını gösterdi: dimerlerin varlığına uygun olarak N2, N3, N6 ve N8 fraksiyonlarının spektrumlarında iki sinyal seti gözlemlendi ve N4 spektrumunda bir tetramere, iki dimere veya farklı oligomerlerin bir karışımına, yani bir trimer artı bir monomere karşılık gelebilen dört set. N4 fraksiyonunda bulunan ürünlerin oligomerizasyon derecesini belirlemek için, hem N4 hem de N2 fraksiyonlarının alikotlarını içeren bir karışım kullanılarak bir 'H DOSY deneyi yapıldı. Tüm sinyallerin difüzyon katsayıları, N4 fraksiyonunda iki kateşin dimerinin varlığını gösteren benzer değerler gösterdi (Şekil 4).

Güvenilir kantitatif sonuçlar sağlayan tamamen çözülmüş OH fenol sinyalleri sayesinde, kateşin birimleri arasındaki bağlantı türü, doğrudan tepe yüzey alanı entegrasyonundan çıkarılabilir. Bu nedenle, her iki fraksiyon, N3 ve N6 için, bir OHfenolün olmaması (resorsinole veya katekol halkasına aittir) ve bir resorsinol aromatik proton eksikliği, A'da bir Muhalefet anlamına gelen eter tipi bir interflavanik bağlantıyı (IFL) gösterdi. veya B halkası ve bir A halkasında bir C6 veya C8 konumu. N2 numunesi durumunda, biri B halkasından diğeri A halkasından olmak üzere iki aromatik proton eksikti, bu da bir CA-CB IFL'yi gösterir. N4 fraksiyonunun 1D'H spektrumu, B halkasının iki protonunun yanı sıra A halkasının iki protonunun eksik olduğunu gösterdi. N4 fraksiyonunun dimer birimleri arasındaki bağlar bu nedenle her ikisi de CC tipidir. N8 fraksiyonunun spektrumları diğer dördünden oldukça farklıydı. Bazı sinyaller, üç OH fenol, bir aromatik A halkası ve bir B halkası protonunun yanı sıra bir alifatik OH'nin eksik olduğu kateşin birimleri için tipikti. Öte yandan, bazı diğer NMR sinyalleri, bir kateşin biriminin atipik: kör 13C kimyasal kaymaları (~40 ppm) ve bir keton grubu (~192 ppm) ile metilen.

C, A ve B halkalarının proton spin sistemleri, hem 'H 1D hem de 1H 2D TOCSY spektrumları (gösterilmemiştir) kullanılarak belirlendi. N2, N3, N6 ve N8 fraksiyonlarının spektrumlarında iki ABMX C-ring spin sistemi (tipik kateşin) ve fraksiyon N4 için dördü gözlendi. N2, N3, N6 ve N8 fraksiyonlarının spektrumlarında, bağlı olmayan kateşin biriminin A halka protonlarına sırasıyla iki meta-bağlı ikili (J~2Hz) ve aromatik A halka bölgesinde bir tek atanmıştır. ve C6-veya C8-bağlı kateşin biriminin A halkası artık protonuna. N4 spektrumunda, iki dimerin mevcudiyeti nedeniyle, dört meta-bağlantılı ikili ve iki tekli saptandı ve yukarıda açıklandığı gibi atandı. B halkası proton sistemleri de bu spektrumlardan kolayca belirlendi ve N3 ve N6 fraksiyonlarının dimerleri için iki ABM proton spin sistemi tanımlamamıza izin verirken, dimer N2 için bir ABM ve bir AB proton spin sistemi ve bir ABM ve bir ABM ve bir AB proton spin sistemi tespit edildi. dimer N4 için bir AM proton döndürme sistemi. Dimer N8, bir kateşin monomerine özgü yalnızca bir ABM B halkası döndürme sistemi sergiledi.

2.3.1.N2, N3, N4 ve N6 Kesirlerinin Dimerlerinin IFL'sinin A Halka Konumunun Belirlenmesi

Dimerlerin A halkası üzerinde bulunan köprünün kurulması (yani, C6A-veya C8A-pozisyonu), CA-bağlı kateşin biriminin kalıntı HA protonunun atfedilmesini gerektirir. Yüksek düzeyde çözülmüş fenolik OH sinyalleri sayesinde, A halkasına bağlı birimlerin iki OHfenol protonunun, yani A halkasının tanımlanması kolay bir başlangıç ​​noktasıydı.

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>Sırasıyla kolayca C7A ve C8A'ya atfedilen 125 ppm）. C6A ve C8A atandığında, artık HA protonu doğrudan HSQC spektrumlarına atfedilebilir. Böylece bu kalıntı HA protonunun tüm N2, N3, N4, N6 fraksiyonları için H6A olduğu bulundu. Bu nedenle, kateşin birimleri arasındaki IFL, tüm dimerler için bir C8A konumu anlamına geliyordu.

2.3.2. IFL'nin B Halka Pozisyonunun Belirlenmesi

N2 ve N4 kesirlerinin dimerleri. N2 fraksiyonunun spektrumu, iki farklı tipte B halkası proton spin sistemi gösterdi: bağlantılı olmayan birimin B halkasına karşılık gelen bir AMX ve H6'B ve H5' karakteristiği olan yaklaşık 8 Hz'lik bir bağlantı sabitine sahip bir AM C2'B bağlantılı birimin B'si. N2 dimerinin birimleri arasındaki bağlantı bu nedenle C2'B-C8A'dır. N4 fraksiyonunun NMR spektrumları ayrıca farklı B spin sistemleri gösterdi: bağlantılı olmayan B halkasına karşılık gelen iki AMX ve her ikisi de H2'B ve H6'nın karakteristiği olan yaklaşık 2 Hz'lik bağlantı sabitlerini gösteren iki AXspin sistemi C5'B bağlantılı birimlerin B protonları. İki dimerin HMBC spektrumlarında gözlenen H6'Band C8A arasındaki uzun menzilli'H/13C korelasyonlarının varlığı, bir C5/'B-C8A bağlantısına uygundur (Şekil 5).

N3 ve N6 kesirlerinin dimerleri. N3 ve N6 fraksiyonlarının spektrumları, iki AMX B halkası proton sisteminin varlığını ve bir OH fenol sinyalinin olmadığını gösterdi. Dimer birimlerinin tüm OHA fenolik protonları tanımlandığından (yukarıda açıklandığı gibi), eksik OH fenolik sinyali ya OH3'B'ninki ya da OH4'B'ninki olabilir.

OH konumu (3'B veya 4'B), sırasıyla H2'Bor H5'B ile ROE korelasyonları yoluyla veya Şekil 5'te gösterildiği gibi uzun menzilli HMBC korelasyonları kullanılarak kolayca belirlenebilir.

B halkalarının kalıntı OH'sinin atfedilmesi, Şekil 5'te gösterildiği gibi, uzun menzilli HMBC veya ROESY korelasyonları kullanılarak kolaylıkla gerçekleştirilmiştir. Dimer N3 durumunda, H5'B ve kalıntı OH arasında bir ROE korelasyonu gözlemlenmiştir. B halkası aracılığıyla bağlı kateşin biriminin 'B'si. Bu OH, böylece OH4'B olarak tanımlandı. N6 fraksiyonu durumunda, bu OH ve H2'B arasında bir ROE korelasyonu gözlendiğinden, artık OH'B, OH3'B'ye atandı. Uzun menzilli HMBC korelasyonları bu niteliklere uygundur. Bu iki dimerin bağlantı pozisyonları daha sonra şu şekilde belirlendi: N3 ve N6 için CO3'B-C8A ve CO4'B-C8A. sırasıyla.

Dimer N8'in fraksiyon N8. Spektrum analizi, bu dimerin bir biriminin, biri A halkası, biri C8A'da ve diğeri C-O7A konumunda iki bağlantı pozisyonuna sahip kateşin olduğunu gösterdi, çünkü H8A ve OH7A protonları eksik. Bu dimerin diğer birimi, B halkası aromatikliğinin kaybını ve hem B hem de C halkaları üzerinde birkaç bağlantı pozisyonunun varlığını gösteren tekil spektral özellikler sergiledi.

B halkasından kaynaklanan 'H NMR sinyalleri, bir metilen grubuna özgü -15 Hz (12.03 ppm) bir geminal eşleşme ve bir etilenik protondan kaynaklanan 6.38 ppm'de bir tekli sergileyen 2.49 ve 2.71 ppm'de iki ikili idi. Bu metilen ve etilen protonları bağlanmadığından, 2'B ve 5'B konumlarında olmaları muhtemeldir. HIMBC spektrumu, Şekil 5'te gösterildiği gibi, bu B halkası karbonlarının doğru atıflarına izin vererek tüm korelasyonları gösterdi. Bu birimin H2C'si, B halkası karbonlarıyla üç korelasyon verdi: biri ~45 ppm'deki metilen karbonudur, bu nedenle C1'B ve C6'B.H5'B'ye atanabilen ~90 ppm ve ~162 ppm'de rezonans eden karbonlarla C2'B ve geri kalan ikisi, bu B halkasının iki kuaterner karbonuyla yalnızca güçlü 3J korelasyonları verdi. : biri daha önce C3'B'ye (~95 ppm) atanan karbondur ve diğeri ~90 ppm'de rezonansa giren diğeri bu nedenle C1'B'ye atfedilebilir. -162 ppm'deki karbon daha sonra C6'B olarak çıkarılmıştır.

C3'B konumunda (~95 ppm) bir alifatik OH'nin (~5.8 ppm) varlığı, her iki H2'B protonu ile ROE korelasyonu yoluyla belirlendi. Ayrıca, OH3/B, C4'B konumundaki bir keton grubunun özelliği olan ~192.5 ppm'de bir kuaterner karbon ile HMBC korelasyonu verdi.

Bu C1'B'nin yaklaşık 40 ppm'lik koruması, B halkası aromatikliğinin kaybına göredir. Ayrıca, diğer ünitenin C7A pozisyonundaki OH eksikliği, bir eter bağlantısı C1'BO-C7A ile uyumludur.

NMR verileri, bu birimin C halkasının herhangi bir OH3C'ye sahip olmadığını gösterdi. Bir C3C-O-C3'B bağlantısının mevcudiyeti, C3C'nin yaklaşık 1.5 ppm korumasının yanı sıra, hemiketal karbon için tipik olan (95 ppm) C3'B'nin kimyasal kaymasına uygundur.

Toplamda, NMR spektral verileri, bu dimerin daha önce Winges ve diğerleri tarafından tarif edilen dehidrokateşin A'ya karşılık geldiği sonucuna varmamızı sağlar.[33] ve ardından Guyot ve diğerleri[20].

Bu NMR analizleri ile belirlenen altı dimerik bileşiğin yapıları Şekil 6'da gösterilmektedir, N2, N3, N6 ve N8 saf ürünlerdir ve N4 iki izomerin bir karışımıdır.

3. Malzemeler ve Yöntemler

3.1.Kimyasallar

(artı)-Kateşin hidrat Yüzde 98'e eşit veya daha büyük; Trametes Versicolor'dan lakkaz(0.94 U·mg-1); sodyum fosfat dibazik dihidrat Yüzde 98'e eşit veya daha büyük; sitrik asit (ACS reaktifi, kadmiyum nitrat tetrahidrat yüzde 99.997; formik asit ve Amberlite XAD7HP, Sigma-Aldrich'ten elde edildi) (Saint-Louis, MO, ABD). Aseton-dg, Euriso-top'tan (Saarbrüicken, Almanya) satın alındı ​​ve trifloroasetik asit (TFA) Roth Labo'dan (Karlsruhe, Almanya). Su LC-MS, asetonitril LC-MS(ACN) ve metanol LC-MS (MeOH) VWR'den (Radnor, PA, ABD) alındı.

3.2. Model Şarap Solüsyonunun Hazırlanması

Model şarap çözeltisi, NaOH 1 M [34] ile pH 3.6'ya ayarlanmış 0.033 M tartarik asitli bir etanol/su çözeltisi (12/88;o/o) idi.

3.3. Ham Üzüm PPO Özleri

PPO özütü, daha önce Singleton ve ark.[35] tarafından tarif edildiği gibi hazırlandı. Dondurulmuş üzümler önce bir asetat tamponu (1.5 M, pH5;10 gL-I askorbik asit) içinde karıştırılmıştır. Karışım daha sonra süzüldü ve santrifüjlendi (3000 g; 10 dakika). Tortu son olarak asetonla (yüzde 80) yıkandı ve havada kurutuldu.

3.4.Botrytis Cinerea kaynaklı lakkaz

Botrytis cinerea'dan elde edilen lakkaz, Quijada-Morin ve ark.[36] tarafından tarif edildiği gibi elde edildi. VA612 türünden üretilmiştir (2005'te Hautvillers, Champagne, Fransa'daki bir bağda Pinot Noir çeşidinden toplanmıştır). Kısaca katı malt maya ortamı üzerindeki kültürler mavi ışık altında 24 derecede bir hafta bekletilmiştir. Sporlar daha sonra kazınmış ve 125 mL kültür ortamı (4{{30}}) gL-1glukoz, 7 içeren 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine aşılanmıştır. gL{{10}}gliserol, 0,5 g·L-1L-histidin,0,1 g:L-1 CuSO,1,8gL-1 NaNO3,0.5g:L -1 KCl,0.5gL-1 CaCl2·H2O,0.05g:L-1 FeSO4.7H2O,1.0g L-1KH2PO4 ve 0.7 gL-1 MgSO 4-7H2O). 3 günlük inkübasyondan ve önceki aynı ortamda 2 günlük büyümeden sonra, ön kültürlere gallik asit (2 gL-1) ilave edildi. 5 gün sonra, sıvı ortam süzüldü ve süpernatan, zardan kesilen 30 kDa moleküler ağırlıkla donatılmış bir Quixstand süzme sisteminde (GE Healthcare UK, Little Chalfont, İngiltere) teğetsel süzmeye tabi tutuldu. Konsantre son olarak damıtılmış suya karşı bir diyafiltrasyona tabi tutuldu ve sadece ABTS'ye karşı oksidan aktivite sergileyen fraksiyonlar tutuldu (-80 derece).

3.5.Oksidasyon Prosedürü

Fosfat-sitrat tamponu içinde bir lakkaz solüsyonu (1 gL-1) önceden hazırlanmış ve bir 6g.L-1( artı )-kateşin solüsyonuna (model şarap) ilave edilerek nihai { lakkaz konsantrasyonu elde edilmiştir. {6}}.3 gL-1. Elde edilen solüsyon daha sonra oda sıcaklığında 2 saat boyunca yavaşça karıştırıldı (180 rpm). Konsantrasyonlar önceden optimize edildi ve deney üç kopya halinde yapıldı.

3.6. Reçine Amberlite XAD7HP'de Reaksiyonun Durması

Bir amber lite kolonu, etanol (mutlak) ile şartlandırılmış ve iki kolon hacminde mili-O su ile durulanmıştır. Önceki lakkaz/( artı )-kateşin reaksiyon ortamı kolona damlatıldı ve önce iki kolon hacminde milli-Qwater [37] ile ayrıştırıldı. Kolon daha sonra toplanan fraksiyon renksizleşene kadar etanol ile yıkandı. Sadece etanol fraksiyonları tutuldu, buharlaştırıldı ve liyofilize edildi. Toz, kullanılana kadar -80 derecede saklandı.

3.7.Flaş Kromatografi Kullanarak Dimerik Fraksiyonun Saflaştırma Prosedürü

Liyofilize toz ilk olarak 280 nm'ye ayarlanmış bir UV detektörü ve bir Puriflash diol 50 um f0025 kolonu ile donatılmış bir flaş kromatografi sistemi puriflash430 kullanılarak saflaştırıldı. İkili hareketli faz, her ikisi de yüzde 0.1 TFA ile asitleştirilmiş asetonitril (çözücü A) ve metanolden (çözücü B) oluşuyordu. Aşağıdaki gradyan kullanılarak 20 mL.dakika-1 sabit akış hızında bir dizi enjeksiyon yapıldı: 4.4 dakika boyunca yüzde 100 A; 0-10 10 dakikada yüzde B;5 dakika için yüzde 10 B; 10-90 yüzde B 5 dakikada; yüzde 90 B 3 dakika;90-10 yüzde B 2 dakikada; %10 B 10 dakika. Enjeksiyon hacmi 1 mL idi (1 mL solvent A içinde çözülmüş 300 mg liyofilize toz). Her seferinde üç farklı fraksiyon toplandı. İlki artık (artı)-kateşine karşılık geldi ve üçüncüsü yüksek moleküler ağırlıklı polifenollerin bir karışımıydı. Dimerik oksidasyon ürünlerinin bir karışımını içeren ikinci ayrıştırılmış fraksiyon buharlaştırıldı ve ikinci saflaştırma adımından önce liyofilize edildi.

3.8. Bir Yarı-Hazırlık Kromatografik Sistem Kullanılarak Dimerik Fraksiyondan Oksidasyon Ürünlerinin Saflaştırılması Prosedürü

Dimerik oksidasyon ürünlerini içeren fraksiyon, ters fazlı bir Varian Dynamax C18 Microsorb kolonu (250 x 21.2 mm; 3 um) ile donatılmış bir yarı-preparatif Bio-Rad NGC 10 orta basınçlı kromatografi sistemi kullanılarak saflaştırıldı. İkili hareketli faz, her ikisi de yüzde 0,05 TFA ile asitleştirilmiş milli-O su (çözücü A) ve yüzde 80 asetonitril, yüzde 20 Milli-Q su "çözücü B"'den oluşuyordu. Aşağıdaki elüsyon koşulları altında liyofilize tozun (200 uL solvent A ve 100 uL ACN içinde çözülmüş 20 mg) (300 uL) bir dizi enjeksiyonu yapıldı: 4 dakika boyunca yüzde 100 A; 0-35 yüzde B 46 dakikada;35-100 yüzde B 2 dakikada;5 dakika için yüzde 100 B. Her seferinde 280 nm'de saf UPLC sinyallerine karşılık gelen sekiz farklı fraksiyon toplandı. Her fraksiyon buharlaştırıldı ve NMR analizinden önce liyofilize edildi.

3.9.NMR Analizi için Numune Hazırlama

Eppendorf tüplerinde tartılan her bir liyofilize tozdan yaklaşık 1 mg, 500 uL aseton-dg içinde çözüldü. Daha sonra, aseton-d içinde ~10 uL konsantre kadmiyum nitrat çözeltisi numunelere ilave edildi ve elde edilen çözeltiler, NMR analizi için 5 mm NMR tüplerine aktarıldı. Bazı numuneler için ek bir adım gerçekleştirildi: liyofilize tozların eser miktarda kadmiyum varlığında aseton-dg içinde çözündürülmesinden sonra, numuneler kuruyana kadar buharlaştırıldı ve daha sonra başka Cd ilavesi olmadan aseton-d içinde yeniden çözündürüldü.

3.10.Alet Özellikleri

UPLC-MS analizi. Reaksiyonlar, iki UPLC-MS sistemi kullanılarak izlendi. Birincisi, uzun bir gradyan yöntemi kullanılarak ürünlerin alıkonma sürelerini tam olarak belirlemek için kullanıldı. yani, Kütle Spektrometrisine (UHPLC-MS) bağlı Waters ters fazlı Ultra Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi. Sıvı kromatografi sistemi, bir fotodiyot dizi detektörü ile donatılmış bir Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, ABD) idi. Bir Acquity UPLC HSS T3 sütunu (1.8 um,2.1 ×150 mm) kullandık. Kolon sıcaklığı 25 derece idi. İkili hareketli faz, su (çözücü A) ve asetonitril (çözücü B) içinde yüzde 0.1 formik asitten oluşuyordu. Ayırma, aşağıdaki gradyan kullanılarak 0.25mL·dak-1 sabit akış hızında gerçekleştirildi: 8-11 2 dakikada yüzde B; 8 dakika boyunca yüzde 11 B; 15 dakikada 11-25 yüzde B;25-55 Yüzde 5 dk;55-99 Yüzde Bin 1 dk;4 dk için yüzde 99 B;99-8 Yüzde Bin1 dk;yüzde 8 B 4 dk. Enjeksiyon hacmi 5 μL idi. Kütle spektrometresi, bir Waters Acquity QDa elektrosprey iyonizasyon (ESI) basit dört kutuplu (Waters, Milford, MA, ABD) idi. Kılcal voltaj 0,8 kV olarak ayarlandı. Kütle spektrumları, 200-900'lik bir kütle aralığında elde edildi. Pozitif iyon modunu inceltin.

Saflaştırma adımları sırasında hızlı doğrulama için kullanılan ikinci UHPLC-MS sistemi, bir Acquity UHPLC HSS T3 sütunu （1,8 μm, 2,1×100 mm） ısıtılmış olarak daha önce tarif edilenle aynıydı. 38 derecede. Ayırma, aşağıdaki hızlı gradyan kullanılarak 0,55 mL.dk-1 sabit akış hızında gerçekleştirildi: 5 dakikada 0.1-40 yüzde B; 40-99 yüzde B 2 dakikada; 1 dakika için yüzde 99 B; 99-0.1 dakikada yüzde B. Enjeksiyon hacmi 2 μL idi. Kütle spektrometresi bir Bruker Amazon X elektrosprey iyonizasyon (ESI) iyon tuzağıydı (Bruker Daltonics, Bremen, Almanya). Kılcal voltaj -5.5 kV'a ayarlandı. Kütle spektrumları, 50-2000'lik bir kütle aralığında elde edildi. Pozitif iyon modunu inceltin.

Tüm UPLC-MS analizleri üç kopya halinde gerçekleştirilmiştir.

NMR Enstrümantasyon. Tüm NMR spektrumları, proton ve karbon çekirdekleri için 500.05 ve 125.74 MHz'de çalışan bir Agilent DD{{0} MHz spektrometresinde (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABD) kaydedildi, sırasıyla, bir gradyan bobini ile donatılmış 5 mm'lik bir dolaylı algılama probu kullanılarak.1D'H ve 13C,2Dhomonuclear1H TOCSY ve ROESY ve heteronükleer lH/13C HSQC ve HMBCdeneyleri klasik darbe dizileri kullanılarak yapıldı ve hem VNMRJ4.2 hem de MestReNova 14.2 kullanılarak analiz edildi. .1 (Mestrelab Research, İspanya) yazılımı. DOSY ölçümleri, daha önce tarif edildiği gibi elde edildi ve işlendi 38]. DgcsteSL darbe dizisinin edinme parametreleri aşağıdaki gibidir: difüzyon gecikme süresi ve gradyan darbe genişliği sırasıyla 50 ms ve 2 ms'ye ayarlandı, gradyan kuvveti(g), 0,3'ten eşit g2 aralığı ile 16 adımda artırıldı. 32G·cm-I. Faz düzeltmesinden sonra, VNMRJ4.2 yazılımı kullanılarak tepe yükseklik ölçümünden 2D DOSY spektrumları oluşturulmuştur.

Tüm spektrumlar, solvent aseton-dg sinyallerine (2.05 ppm'de 'H kalıntı sinyali ve 29.92 ppm'de 13C sinyali) atıfta bulunulmuştur.

4. Sonuçlar

Üç farklı oksidoredüktazın (üzümlerden ekstrakte edilen polifenol oksidaz, Botrytis cinerea'dan lakkaz ve Trametes Versicolor'dan lakkaz) (artı )-kateşin üzerindeki etkisi araştırıldı ve LC-UV-MS sonuç profilleri, bazı küçük farklılıklar olmasına rağmen çok benzerdi. bu enzimlerin reaktivitesinde olası farklılıklar önerdi.

Altı kateşin-lakkaz oksidasyon ürününün yapıları (Trametes Versicolor'dan lakkaz kullanılarak) belirli NMR imzaları (dört saf ürün, yani N2, N3, N6 ve N8 ve N4, bir karışıma karşılık gelen) temelinde elde edildi. iki izomer). Fenolik OH sinyallerinin tam olarak ilişkilendirilmesi, bazı ilgili bileşikler için kateşin birimleri arasındaki bağlantıların açık bir şekilde ilişkilendirilmesine izin veren bir numune hazırlama prosedürü ile kadmiyum nitratın eklenmesi sayesinde mümkün olmuştur. Bu prosedür, doğal ürünlerden sentezlenen veya ekstrakte edilen polifenol karışımlarının NMR analizini büyük ölçüde basitleştirecektir.

Bu çalışmada elde edilen standartlar gelecekte üzüm olgunlaşması ve şarap yaşlanması sırasında mevcudiyetlerini ve evrimlerini araştırmak için oksidasyon belirteçleri olarak kullanılabilir. Kateşinin yanı sıra, flavonoidler ve flavonoid olmayanlar dahil olmak üzere diğer polifenol bileşikleri de ek yeni standartlar elde etmek için lakkaz substratları olarak kullanılabilir.

Kısaltmalar

NMR: nükleer manyetik rezonans,

Cd: kadmiyum,

TOCSY: toplam korelasyon spektroskopisi,

ROESY: Döner çerçeveli nükleer Overhauser etkisi spektroskopisi,

HSQC:heteronükleer tek kuantum korelasyon deneyi,

HMBC:heteronükleer çok bantlı bağlantı,

DOSY: difüzyon sıralı spektroskopi.

Referanslar

1. Han, N.; Muhtar, Sağlığın Teşviki İçin H. Çay Polifenolleri. Hayat Bilimi. 2007, 81, 519-533. [Çapraz Referans]

2. Fayeulle, N.; Vallverdu-Queralt, A.; Meudec, E.; Hue, C.; Boulanger, R.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Fermente Kakao Çekirdeklerinde Yeni Flavan-3-Eski Türevlerinin Karakterizasyonu. Gıda Kimyası 2018, 259, 207–212. [CrossRef] [PubMed]

3. Rimbach, G.; Melçin, M.; Moehring, J.; Wagner, Kakao ve Damar Sağlığından AE Polifenolleri—Eleştirel Bir İnceleme. Int. J. Mol. bilim 2009, 10, 4290-4309. [Çapraz Referans]

4. Avram, AM; Morin, P.; Brownmiller, C.; Howard, AS; Sengupta, A.; Wickramasinghe, Nanofiltrasyon Kullanarak Yabanmersini Posasından Elde Edilen Polifenollerin SR Konsantrasyonları. Gıda Bioprod. İşlem. 2017, 106, 91–101. [Çapraz Referans]

5. Antoniolli, A.; Fontana, AR; Piccoli, P.; Bottini, R. Cv. Üzüm Posasında Polifenollerin Karakterizasyonu ve Antioksidan Kapasitesinin Değerlendirilmesi. Malbec. Gıda Kimyası 2015, 178, 172–178. [Çapraz Referans]

6. Saucier, C. Şarap Polifenolleri, Şarap Yaşlandırma Sırasında Nasıl Evrimleşir? Cerevisia 2010, 35, 11–15. [Çapraz Referans]

7. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, Şaraplarda Oluşan AMS Oksidasyon Mekanizmaları. Gıda Araş. Int. 2011, 44, 1115-1126. [Çapraz Referans]

8. Singleton, Fenollü VL Oksijen ve Musts, Şarap ve Model Sistemlerinde İlgili Reaksiyonlar: Gözlemler ve Pratik Uygulamalar. Ben. J. Enol. Vitik. 1987, 38, 69-77.

9. Mathew, AG; Parpia, Bir Polifenol Reaksiyonu Olarak HAB Gıda Esmerleşmesi. Gıda Araştırmalarındaki Gelişmelerde; Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, Eds.; Akademik Basın: Cambridge, MA, ABD, 1971; Cilt 19, s. 75–145. [Çapraz Referans]

10. Gambuti, A.; Rinaldi, A.; Ugliano, M.; Moio, L. Kırmızı Şarabın Yaşlanması Sırasında Fenolik Bileşiklerin ve Büzücülüğün Evrimi: Şişelemeden Önce ve Sonra Oksijene Maruz Kalmanın Etkisi. J. Agric. Gıda Kimyası 2013, 61, 1618-1627. [CrossRef] [PubMed]