Soyut:Vitis amurensis köklerinin, melanogenez ve tirozinaz inhibitör aktivitelerinin değerlendirilmesi yoluyla cilt beyazlatma potansiyeline sahip olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada, V. amurensis kökleri, tirozinaz inhibitör tahlili ile birleştirilmiş LC-Q-TOF-MS kullanılarak beyazlatıcı bileşenleri hızlı bir şekilde seçmek ve yanıt yüzeyi metodolojisi ile bir cilt beyazlatma fonksiyonel materyali olarak kullanım için ekstraksiyon sürecini optimize etmek için kullanıldı. Sonuçlar, V. amurensis köklerinin, biyoanaliz ile birleştirilmiş LC-Q-TOF-MS tarafından tahmin edildiği gibi, iki stilben oligomeri, ε-vinifera (1) ve B vitamini (2) tarafından tirozinaz önleyici etkiler sergilediğini gösterdi. Cilt beyazlatma bileşenleri için optimum ekstraksiyon koşulları (metanol konsantrasyonu yüzde 66, solvent hacmi 140 mL ve ekstraksiyon süresi 100 dakika), yüzde 6.20'lik verimlerle belirlendi ve tirozinaz inhibe edici aktivite yüzde 87.27 idi. Her faktör ve karşılık gelen yanıtı arasındaki ilişki, Pearson'un korelasyon analizi ile doğrulandı. Çözücü hacmi, verimlerle net bir doğrusal ilişki gösterdi ve metanol konsantrasyonu, bileşikler 1 ve 2'nin yanı sıra bunların kombinasyonları için tirozinaz inhibe edici aktivite ile güçlü bir doğrusal ilişkiye sahipti. Genel olarak, biyotahlil ile birleştirilmiş LC-Q-TOF-MS'nin, bilinen aktif bileşenlerin yanı sıra yeni aktif bileşenleri etkili bir şekilde bulma potansiyeline sahip olduğu kanıtlanmıştır; vitaminler yeni bir doğal potansiyel beyazlatma ajanı olarak önerilebilir.

İlgili araştırmalara göre,cistanche"ömrü uzatan mucize bitki" olarak bilinen yaygın bir bitkidir. Ana bileşenikistanositgibi çeşitli etkilere sahiptir.antioksidan, antienflamatuvar, Vebağışıklık fonksiyonu teşviki. Cistanche ve arasındaki mekanizmacilt beyazlatmakcistanche'nin antioksidan etkisinde yatmaktadır.glikozitler. İnsan derisindeki melanin, tirozinin oksidasyonu ile üretilir.tirozinazve oksidasyon reaksiyonu oksijenin katılımını gerektirir, bu nedenle vücuttaki oksijensiz radikaller melanin üretimini etkileyen önemli bir faktör haline gelir. Cistanche içerirkistanositBir antioksidan olan ve vücuttaki serbest radikallerin oluşumunu azaltabilen, böylece melanin üretimini engelleyen.

Yakınımda Satılan Cistanche'a Tıklayın

Daha fazla bilgi için:

david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501

anahtar kelimeler:Vitis amurensis; LC-Q-TOF-MS, tirosinaz inhibitör testi ile birleştirildi; tepki yüzeyi metodolojisi; Pearson korelasyonu

1. Giriş

Melanin, memeli derisinin ve saçının renginden sorumludur ve cildi ultraviyole ışınlarından korur, ancak aşırı melanin üretimi ve ciltte melanin birikmesi çiller, melazma, yaşlılık lekeleri, efelitler ve senil lentijinler gibi hiperpigmentasyon cilt bozukluklarına neden olur. Bakır içeren bir oksidaz enzimi olarak bilinen tirozinaz, melanin biyosentezinde çok önemli bir role sahiptir. Enzim iki ardışık oksidasyon reaksiyonunu katalize etti: Birinci adım, L-tirozinin 3,4-dihidroksi-L-fenilalanine (L-DOPA) hidroksilasyonu ve ikinci adım, L-DOPA'nın oksidasyonu dopakinon. Dopakinon, melanin oluşturmak için kendiliğinden polimerize olabilen oldukça reaktif bir maddedir [1-3]. Bu nedenle, tirozinaz inhibitörleri, hiperpigmentasyonla ilişkili cilt bozuklukları için tedaviler olarak ve cilt beyazlatıcı maddeler olarak kullanılabilir.

Yabani bir üzüm türü olan Vitis amurensis, esas olarak Asya'da (Kore, Çin ve Japonya) dağıtılmaktadır. Tamamen olgunlaşmış meyveler çiğ tüketilir ve sakaroz, glikoz, protein ve vitaminler gibi bol miktarda besin içerirler, bu nedenle şarap, meyve suyu, jöle ve reçel malzemesi olarak kullanılırlar. Ayrıca yaprakları salatalarda da kullanılmaktadır [4]. Kökleri ve gövdeleri kanser, nevraljik ağrı ve karın ağrısı tedavisinde geleneksel tıp olarak kullanılmıştır [5,6]. Kökleri stilbenler (ana bileşen), prosiyanidinler, flflavonoidler, triterpenoidler ve diğer fenolik bileşiklerden oluşur. Şimdiye kadar, kökün kimyasal bileşimleri yeterince ayrıntılı olarak incelenmiştir. Özellikle resveratrol, amurensin A, vitamin A, (artı)-ε-vinifera, amurensinler C–M, ampelopsin A, D ve ampelopsin E dahil olmak üzere çeşitli stilben oligomerleri rapor edilmiştir [6]. Kökün metanolik özü, B16F10 hücrelerinde ve mantar tirozinazı yoluyla 3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) oksidasyonunda -melanosit uyarıcı hormon kaynaklı melanogeneze karşı bir anti-melanojenik etki gösterir [7]. Ek olarak, V. amurensis özleri ve bunların aktif bileşikleri, antioksidan, antienflamatuar, nöroprotektif ve anti-tümorijenik etkiler sergiler [7-10].

Bir biyotahlil ile birleştirilmiş LC-MS, ekstraksiyon ve izolasyona ihtiyaç duymadan doğal ürünlerdeki bileşenlerin kimyasal profilini ve biyolojik aktivitesini aynı anda doğrulayabilir. Bu nedenle, son zamanlarda doğal ürünlerdeki biyoaktif bileşikleri verimli ve hızlı bir şekilde tanımlamak için kullanılmıştır [11-13].

Optimizasyon, deneysel sistemlerin veya ürünlerin maksimum verimliliğine izin veren bir süreçtir. Tepki yüzey metodolojisi (RSM), çok değişkenli analiz, ampirik modellere dayalı matematiksel ve istatistiksel teknikler kullanılarak deney tasarımı ve deney tasarımı ile sonuçlar arasındaki korelasyonun bir polinom fonksiyonu olarak ifade edilmesi, ideal optimizasyon koşullarını maksimum verimlilikle sağlayan bazı tekniklerdir. RSM, gıda işleme, kimya, biyoloji ve tarım dahil olmak üzere çeşitli alanlarda yaygın olarak kullanılan doğru ve verimli bir optimizasyon yöntemidir [14–16]. Geçtiğimiz yıllarda doğal ürünler içeren ilaçlara, kozmetiklere ve fonksiyonel gıdalara olan ilgi artmış; sonuç olarak, bu tür ürünleri geliştirmeyi amaçlayan hem akademi hem de endüstride devam eden araştırmalar vardır [17,18]. Bu çalışmalarda ilk adım, biyoaktif bileşenin doğal ürünlerden ekstraksiyonunu içerir. Şu anda, ekstraksiyon süresi, sıcaklık, sıvı-katı oranı ve solvent hacmi gibi çok sayıda faktör ekstrakte edilen bileşenleri etkilediğinden, biyoaktif bileşenlerin maksimuma çıkarılması için bir optimizasyon gereklidir.

Bildiğimiz kadarıyla, tirozinaz inhibitör bileşenleri ve V. amurensis köklerinin ekstraktlarının optimizasyonu nadiren rapor edilmiştir [5,19]. Bu nedenle bu çalışma, tirozinaz inhibitör tahlili ile birleştirilmiş LC-Q-TOF-MS kullanarak V. amurensis köklerinden tirozinaz inhibitörünü hızlı bir şekilde elde etmeyi ve cilt beyazlatma maddesi olarak V. amurensis köklerinin kullanımını genişletmek için ekstraksiyon koşullarını optimize etmeyi amaçladı. RSM tarafından.

2. Sonuçlar ve Tartışma

2.1. LC-QTOF MS, V. amurensis'in Kök Ekstresi Kullanılarak Tirozinaz İnhibitör Testiyle Birleştirildi

V. amurensis kökünün yüzde 80 MeOH özü, önemli tirozinaz önleyici aktivite sergiledi (50 µg/mL'de yüzde 80,7 ± 0,8, Tablo S1). İzolasyon olmadan V. amurensis kökündeki tirozinaz inhibe edici bileşikleri belirlemek için, bir tirozinaz inhibe edici tahlil ile birleştirilmiş LC-QTOF-MS gerçekleştirildi. V. amurensis kök ekstraktının kimyasal profili ilk çalışmada elde edildi (Şekil S1) ve biyoaktif bileşikler, ikinci çalıştırmadan her 30 saniyede bir toplanan fraksiyonların bir tirozinaz inhibe edici tahlili kullanılarak tanımlandı (Şekil 1). Kütle kromatogramında 19 ve 22 dakika arasında önemli tirozinaz inhibe edici aktiviteye sahip olduğu tahmin edilen iki tepe noktası vardı ve yapılarının kimyasal profilleme kullanılarak stilben dimer (1) ve stilben tetramer (2) olduğu belirlendi (Tablo 1).

2.2. V. amurensis Kökünün Tirozinaz İnhibitör Bileşenlerinin Belirlenmesi

İlk olarak, tirozinaz inhibe edici aktiviteye sahip olması beklenen iki bileşen, EtOAc fraksiyonundan izole edildi ve bunların biyoaktivitesi değerlendirildi. İzole edilen bileşikler 1 ve 2'nin yapıları, 1H-NMR, 13C-NMR ve ESI-MS (Şekil 2, Şekil S2 ve S3 ve Tablo S2). Tirosinaz inhibe edici tahlilde, bileşikler 1, 2 ve kojik asidin IC50 değerleri sırasıyla 3.51, 10.74 ve 27.09 uM idi. Her iki bileşik de, bilinen cilt beyazlatma bileşeni olan pozitif kontrol kojik asitten daha yüksek tirozinaz inhibe edici etkiler gösterdi (Tablo 1 ve Şekil S4). Daha önceki çalışmalarda, ε-vinifera'nın (1) tirozinaz inhibe edici aktiviteye sahip olduğu bildirilmiştir [23]; ancak B vitamini (2) ilk olarak bizim çalışmamızda tanımlanmıştır.

Genel olarak, bir tirozinaz inhibitör tahlili ve B vitamini (2) ile birleştirilmiş LC-MS'nin tahmin edilen verileriyle ilişkili olan sonuçlar, yeni bir tirozinaz inhibitörü olarak potansiyel göstermektedir. Ayrıca, iki stilben oligomerinin önemli tirozinaz inhibe edici aktivitesinin sonucunu desteklemek için moleküler yerleştirme çalışmaları yapılmıştır. Tablo 1'de gösterildiği gibi, bileşik 1 ve 2, deneysel verilerimizle tutarlı olarak, pozitif kontrol olan kojik asitten daha yüksek bir kenetlenme skoru gösterdi. Bununla birlikte, bileşiklerin kenetlenme sonuçları deneysel sonuçlarımızla çelişiyordu. Bileşik 1 ve 2'nin etkileşim modları Şekil 3'te açıklanmıştır. Bileşik 1, 4 hidrojen bağı, 2 hidrofobik etkileşim ve 1 pi-yalnız çift etkileşimi oluşturmuştur ve bileşik 2, 11 hidrojen bağı, 7 hidrofobik etkileşim, 1 van der Waals etkileşimi oluşturmuştur. ve 3 pi-yalnız çift etkileşimleri. Sonuç olarak, bileşiklerin hedef proteinin aktif bölgesine sokulabileceği ve tirozinaz aktivitesini inhibe edebilen katalitik amino asit kalıntılarına bağlanabileceği doğrulandı. Ek olarak, ε-vinifera'nın (1), L-DOPA'nın tirozinaza bağlandığı aynı bölgeye bağlanan rekabetçi bir inhibitör olduğu rapor edilmiştir [23]. B vitamininin (2) ε-vinifera (1) ile aynı bölgeye bağlandığı gözlendi, bu da B vitamininin (2) yeni bir rekabetçi inhibitör olduğunu doğruladı.

2.3. RSM Kullanarak V. amurensis Kök Ekstraksiyonunun Optimizasyonu

Cilt beyazlatıcı işlevsel bir malzeme olarak V. amurensis köklerini kullanmak için, ekstraksiyon verimini ve tirozinaz inhibe edici aktiviteyi en üst düzeye çıkarmak için en uygun ekstraksiyon koşulları Box-Behnken tasarımı (BBD) ile tasarlanmıştır. Ekstraksiyon verimi, tirozinaz inhibe edici aktivite, bileşik 1 miktarı, bileşik 2 miktarı ve bileşik 1 ve 2'nin toplam miktarı gibi bağımsız tepkilerin üç bağımsız değişken (ekstraksiyon süresi, MeOH/su konsantrasyonu ve çözücü hacmi), ölçüldü (Tablo 2). Değişken aralığı, ekstraksiyon süresi (40, 70 ve 1{25}} dakika), MeOH konsantrasyonu (yüzde 40, 70 ve 100) ve çözücü hacmi ( 35, 87,5 ve 140 mL) bir ön tek faktörlü deneye dayalıdır (veriler gösterilmemiştir). Tasarlanan deneylerden elde edilen değerler, regresyon analizi kullanılarak değişkenler arasındaki korelasyonların polinomları olarak ifade edildi (Tablo S4 – S13 ve Şekil S5). Her reaksiyon için bireysel optimizasyon gerçekleştirmenin bir sonucu olarak (Tablo 3), 100.00 dakika, MeOH yüzde 64.78, 140.{42} ile ekstrakte edildiğinde verimin yüzde 6.21'i temsil etmesi bekleniyordu. } ml. Tirozinaz inhibitör aktivitesi (yüzde), 65.22 dakika, MeOH 100,00 yüzde, 140.00 mL koşulları ile ekstre edildi ve yüzde 90,37'lik bir değer göstereceği tahmin edildi. 65.74 dakikada MeOH 100.00 yüzde 35.00 mL'de bileşik 1 miktarı 37.45 µg/mg olarak tahmin edildi ve 70.00 dakikada MeOH yüzde 70.00 ve 92.24'te bileşik 2 miktarı tahmin edildi mL 86,77 µg/mg olarak tahmin edildi. Ek olarak, bileşik 1 ve 2'nin toplam içeriğinin, 75.20 dakika, MeOH yüzde 100.00 ve 35.00 mL koşullarında ekstrakte edildiğinde maksimum 108.10 ug/mg değeri göstermesi bekleniyordu. Optimize edilmiş koşullara dayalı deneyler yüzde 6,19 ± 0,36, tirozinaz önleyici aktivite yüzde 91,72 ± 3,48, bileşik 1 içeriği 36,54 ± 1,78 µg/mg, bileşik 2 içeriği 85,74 ± 16,57 µg/mg ve bileşik 1 ile {{85} toplamı verdi }.10 ± 19.11 µg/mg elde edildi ve her bir değişken için bireysel yanıtlar, teorik olarak tahmin edilen değerlerden yüzde 5 veya daha az bir fark sergiledi. Ekstraksiyon verimini ve tirozinaz inhibe edici aktiviteyi en üst düzeye çıkarmak için çoklu yanıt optimizasyonu yapıldı (Tablo 3). Optimize edilmiş koşullar aşağıdaki gibidir: ekstraksiyon süresi, 100 dakika; MeOH konsantrasyonu, yüzde 66.38; ve solvent hacmi, 140 mL. Bu koşullar kullanılarak verimin yüzde 5.95 ± 1.13 ve tirozinaz önleyici aktivitenin yüzde 85.93 ± 1.57 olduğu belirlendi; bu değerler sırasıyla yüzde 6,20 ve yüzde 87,25 ile tahmin edilen değerlere benzerdi. Ek olarak, her bir değişken ile karşılık gelen yanıt arasındaki korelasyon, Pearson korelasyonu (Tablo 4) kullanılarak analiz edildi. Ekstraksiyon verimi, ekstraksiyon süresi ile MeOH konsantrasyonu arasında net bir lineer ilişki ve bileşik 1 miktarı ile negatif bir lineer ilişki göstermiştir. Ek olarak, tirozinaz inhibe edici aktivite, bileşik 2 miktarı ile toplam miktarı arasında güçlü bir lineer ilişki göstermiştir. Bileşik 1 ve 2 ve bileşik 1 ile net bir lineer ilişki. Bu nedenle, V. amurensis kökünün tirozinaz inhibe edici aktivitesi, hem bileşik 1 hem de 2 ile orantılıydı, ancak bileşik 2'nin miktarı ile bileşik 1'den daha güçlü bir doğrusal ilişki sergiledi.

3. Malzemeler ve Yöntemler

3.1. Genel Deneysel Prosedürler

Orta basınçlı sıvı kromatografisi (MPLC), bir Biotage Isolera (Biotage AB, Uppsala, İsveç) kullanılarak yapıldı. Sistemlerden biri, yüksek performanslı bir flaş kromatografi (HPFC) pompası, değişken bir çift dalga boyu detektörü ve bir toplayıcı ile donatılmıştır. NMR spektrumları, bir Bruker SPECTROSPIN 300 MHz spektrometre (Bruker Corporation, Billerica, MA, ABD) kullanılarak elde edildi. Bir NMR solventi olan metanol-d4, Cambridge Isotope Laboratories, Inc.'den satın alınmıştır. Kromatografik kalitede asetonitril (ACN), su ve metanol (MeOH) ThermoFisher Scientific Korea Ltd.'den (Seul, Kore Cumhuriyeti) satın alınmıştır. L-tirozin, mantar tirozinazı, kojik asit ve formik asit, Sigma-Aldrich Co'dan (St. Louis, MO, ABD) satın alınmıştır.

3.2. bitki materyali

V. amurensis kökü Gyeongbuk, Kore'den elde edildi ve ayrıca Omniherb'den (Daegu, Kore Cumhuriyeti) satın alındı. Kore Üniversitesi Eczacılık Fakültesi'nden Dr. Prof. Ki Yong Lee tarafından teşhis edildi. Kore Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakognozi Laboratuvarında bir belge örneği (KUP-HD071) saklandı.

3.3. LC-Q-TOF Kütle Spektrometresi

LC, bir ikili pompa, çevrim içi gaz giderici, otomatik örnekleyici, termostatik olarak kontrol edilen kolon bölmesi ve fotodiyot dizi detektörü içeren bir Agilent 1260 serisi (Agilent, Santa Clara, CA, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. Bir Shiseido CapCell PAK C18 kolonu (5 um, 4.6 mm, ID × 150 nm) kullanılarak kromatografik ayırma yapıldı. Mobil faz, her ikisi de yüzde 0,1 formik asit içeren su (çözücü A) ve ACN'den (çözücü B) oluşuyordu. Gradyan koşulları şuydu: 0–5 dakika, yüzde 10 B, 5–30 dakika ve B'yi doğrusal olarak yüzde 10'dan yüzde 90'a çıkarın. Felç oranı 0.6 mL/dk olarak ayarlandı; LC-Q-TOF-MS analizi ve tirozinaz inhibitör tahlili ile birleştirilmiş LC-Q-TOF-MS için sırasıyla 5 uL ve 20 uL numune enjekte edildi. Kütle spektrometrisi, negatif modda bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) arayüzüne sahip bir Agilent 6530 Q-TOF kütle spektrometresi (Agilent, Santa Clara, CA, ABD) kullanılarak yapıldı. m/z 50–1000 arasındaki kütle aralığı verileri merkez modunda toplandı. Kütle parametreleri aşağıdaki gibidir: kapiler voltaj, 4000 V; nebulizer basıncı, 40 psi; parça voltajı, 175 V; skimmer voltajı, 65 V; kurutma gazı sıcaklığı, 325 ◦C; diğer kurutma gazı hızı, 12,0 L/dk; çarpışma enerjisi 10, 20, 30 ve 40 eV. Edinme parametre ayarı ve veri işleme, 6530 serisi Q-TOF (sürüm B.05.00) (MassHunter Workstation yazılımı, Agilent, Santa Clara, CA, ABD) kullanılarak LC-MS/MS Data Acquisition kullanılarak gerçekleştirildi.

3.4. LC-Q-TOF-MS, Tirozinaz İnhibitör Testiyle Birleştirildi

Bir tirozinaz inhibitör testi ile birleştirilmiş LC-Q-TOF-MS, önceki çalışmada oluşturulan yöntem kullanılarak gerçekleştirilmiştir [24]. Kısaca, tahlil iki çalışmada ilerledi. İlk çalıştırmada, numunenin kimyasal profili LC-Q-TOF-MS kullanılarak elde edildi. Bir sonraki çalıştırmada, belirtilen LC-Q-TOF koşulları altında LC sisteminden geçtikten sonra elüat, her 30 saniyede bir 96-kuyu plakalarında toplandı. Toplanan fraksiyonların tirozinaz inhibe edici aktivitesi, bir tirozinaz inhibe edici analiz kullanılarak değerlendirildi.

3.5. Tirosinaz İnhibitör Bileşiklerin V. amurensis Kökünden İzolasyonu

Tirosinaz inhibe edici tahlil ile birleştirilmiş LC-Q-TOF-MS kullanılarak tanımlanan tirozinaz inhibe edici bileşiklerin izolasyonu için, V. amurensis kökü (3.01 kg) yüzde 80 ile üç kez ekstre edildi Ultrasonikasyon kullanılarak oda sıcaklığında 60 dakika MeOH. Ekstrakte edilen solvent süzüldü ve konsantre edilerek ham bir ekstrakt (215.7 g) elde edildi, bu su içinde süspanse edildi ve n-heksan, etil asetat (EtOAc) ve n-BuOH kullanılarak sırayla ayrıldı. EtOAc fraksiyonu (25.85 g), gradyan koşulları altında (20:1 → 0:1) n-heksan:EtOAc kullanılarak silis jel kolon kromatografisine tabi tutularak yedi fraksiyon (E1-E7) elde edildi. E4 fraksiyonu MPLC ve 100 g SNAP KP-Sil, bir silika jel kartuşu ve diklorometan: MeOH kullanılarak gradyan koşulları altında (97:3 → 0:100) ayrıldı ve yedi alt fraksiyon (E4–1 ila E4–7) elde edildi. . Bileşik 2 (417.0 mg), E4-5'ten elde edildi. E4-4 alt fraksiyonu, gradyan koşulları altında (50:4:1 → 15:4:1) yedi fraksiyon ( E4–4–1 ila E4–4–7). Bileşik 1 (396.0 mg), bir ince tabaka kromatografisi (TLC) plakası üzerinde tek bir nokta olarak gözlemlenen E4-4-5'ten elde edildi.

3.6. Tirozinaz İnhibitör Deneyi

Tirosinaz inhibe edici aktivite, hafif modifikasyonla daha önce tarif edilen bir yöntem kullanılarak değerlendirildi [25]. İki mikrolitre numune ve 50 µL 0.1 U/µL mantar tirozinazı, 96-gözlü plakalarda işlendi ve 37°C'de inkübe edildi. 15 dakika sonra 50 uL 1 mM L-tirozin eklendi ve daha sonra 37°C'de 15 dakika reaksiyona sokuldu. Oluşan dopakrom miktarı, bir Spectra Max 19{{20}} mikroplaka okuyucu (Molecular Devices, San Jose, CA, ABD) kullanılarak 495 nm'de ölçülmüştür. Tirozinaz inhibe edici aktivite, aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplandı: tirozinaz inhibisyonu ( yüzde )=[1 - (S - S0)/(C - C0)] × 100, burada S, numunenin, tirozinazın ve L'nin absorbansıdır -tirozin; S0, örneğin ve L-tirozinin absorbansıdır; C, tirozinaz ve L-tirozinin absorbansıdır ve C0, L-tirozinin absorbansıdır. Pozitif kontrol olarak bilinen bir tirozinaz inhibitörü olan kojik asit kullanıldı. IC50 değerleri, GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, ABD) kullanılarak hesaplandı.

3.7. Moleküler Yerleştirme Çalışmaları

Agaricus bisporus'tan (Protein Data Bank (PDB) ID: 2Y9W) bir tirozinaz olan PPO3'ün kristal yapılarıyla SYBYL-X 2.1.1 yazılımı (Tripos Ltd., St. Louis, MO, ABD) kullanılarak moleküler yerleştirme gerçekleştirildi. Hedef proteinin tüm su molekülleri çıkarıldı ve ligand hazırlığı, SYBYL-X 2.1.1'deki "sanitize" hazırlama protokolü ile gerçekleştirildi. Protein-ligand afinitesi, Tripos kuvvet alanı tarafından hesaplandı ve toplam puanlar olarak ifade edildi. Ligandın protein-ligand kompleksinden kenetlenmiş pozu, Discovery Studio 2017 R2 İstemci programında (Biovia Co., San Diego, CA, ABD) görselleştirildi.

3.8. Deney Tasarımı ve İstatistiksel Analiz

V. amurensis kökünden maksimum tirozinaz inhibe edici aktiviteye sahip bileşenlerin çıkarılması için optimize edilmiş bir koşul, üç değişkenli ve üç seviyeli (MINITAB Sürüm 14.12.0 İstatistiksel Yazılım) BBD kullanılarak oluşturulmuştur. Ön tek faktörlü deney sonuçlarına dayanarak, ekstraksiyon süresi (X1), MeOH ve su konsantrasyonu (X2) ve sıvı hacmi (X3) dahil olmak üzere bağımsız değişkenler ve bunların bir dizi değişkeni seçildi (Tablo S3). RSM değişkenleri üç seviye kullanılarak kodlandı, −1, 0 ve 1. Genel olarak, tasarımın merkezinde 3 tekrar içeren 15 deney tasarlandı (Tablo 2). Bağımsız tepkiler olarak verim (yüzde), tirozinaz önleyici aktivite (yüzde), bileşik (1) miktarı (ug/mg) ve bileşik (2) miktarı (ug/mg) ölçüldü. Ekstrenin tirozinaz inhibe edici aktivitesi, 50 ug/mL'lik bir konsantrasyonda değerlendirildi. Her yanıt, aşağıdaki ikinci dereceden polinom denklemi kullanılarak ifade edilir:

burada R yanıtı belirtir; 1, 2 ve 3 doğrusal katsayılardır; 12, 23 ve 13, üç değişken arasındaki etkileşim katsayılarıdır; ve 11, 22 ve 33 ikinci dereceden katsayılardır.
Ayrıca, her bir değişken ile yanıt arasında doğrusal bir ilişkinin varlığını belirlemek için Pearson korelasyon analizi yapılmıştır. Pearson korelasyon katsayısı, {{0}.7 ve 1.0 arasında güçlü bir doğrusal ilişkiye, 0.3 ve 0.7 arasında net bir doğrusal ilişkiye sahiptir, {{10}.1 ile 0.3 arasında zayıf doğrusal bir ilişki ve 0.0 ile 0.1 arasında doğrusal ilişki yok veya önemsiz. Pozitif ve negatif korelasyon, Pearson korelasyon katsayısının pozitif veya negatif olmasına bağlı olarak ifade edilir.

3.9. Tirosinaz İnhibitör Bileşikler 1 ve 2'nin Kantitatif Analizi

Tasarlanan 15 deney koşulu kullanılarak elde edilen ekstraktlardaki her bir bileşik 1 ve 2'nin miktarı, kalibrasyon eğrileri kullanılarak ölçüldü (Tablo 2). Bileşik 1 ve 2 için kalibrasyon eğrileri, UV kromatogram eğrisi altındaki alan (sırasıyla 0,1–1000 µg/mL ve 7,81–1000 µg/mL konsantrasyonlarda elde edilen 33{7}} nm) kullanılarak belirlendi. LC, Materials and Methods, LC-Q-TOF kütle spektrometresi bölümünde ayrıntıları verilen LC sistemiyle aynı koşullarla bir Waters 2695 LC sistemi (Waters, Santa Clara, CA, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi.

4. Sonuçlar

V. amurensis köklerinin ε-Viniferin (1) ve B vitamini (2), bir tirozinaz inhibitör tahlili ile birleştirilmiş LC-Q-TOF-MS kullanılarak cilt beyazlatıcı bileşenler olarak karakterize edildi. Özellikle, B vitamini (2) ilk olarak bu çalışmada bir tirozinaz inhibe edici bileşik olarak tanımlandı ve ε-vinifera (1) ve B vitamini (2), pozitif kontrol olan kojik asitten daha yüksek tirozinaz inhibe edici etkiler gösterdi. Maksimum tirozinaz inhibitör etkisi ve V. amurensis köklerinin verimi ile optimizasyon koşulları, ekstraksiyon süresi (100 dakika), MeOH konsantrasyonu (yüzde 66,38) ve sıvı hacmi (140 mL) kullanılarak belirlendi. Sonuç, deneysel ve tahmin edilen değerler arasında iyi bir uyum sergilemiştir. Sonuç olarak, biyoanaliz ile birleştirilmiş LC-Q-TOF-MS, yeni bir doğal potansiyel beyazlatma ajanı olarak önerilebilecek bilinen aktif bileşenler olan B vitamininin (2) yanı sıra yeni aktif bileşenleri etkili bir şekilde bulma potansiyelini kanıtlamıştır.

Tamamlayıcı Malzemeler: Aşağıdakiler çevrimiçi olarak mevcuttur, Şekil S1: Negatif iyonizasyon modunda (A) MS kromatogramı; V. amurensis köklerinin ekstrelerinin 280 nm'de (B) UV kromatogramı, Şekil S2: bileşik 1'in 1H- ve 13C-NMR spektrumları (300 ve 75 MHz, CD3OD), Şekil S3: bileşiğin 1H- ve 13C-NMR spektrumları 2 (300 ve 75 MHz, CD3OD), Şekil S4: Pozitif kontrolün sigmoidal grafiği ve IC50'si, bileşikler 1 ve 2, Şekil S5: Ekstraksiyon parametrelerinin etkisini gösteren yanıt yüzeyi ve kontur grafikleri (X1: ekstraksiyon süresi, dk; X2: MeOH konsantrasyonu, yüzde X3: solvent hacmi, mL). (Verim; (B) tirozinaz önleyici aktivite; (C) bileşik 1; (D) bileşik 2; (E) 1 ve 2 bileşiklerinin toplamı, Tablo S1. V. amurensis köklerinin ekstrelerinin tirozinaz inhibe edici aktivitesi, Tablo S2: CD3OD'de (ppm cinsinden δ) bileşikler 1 ve 2'nin 1H- ve 13C NMR verileri, Tablo S3: Tepki yüzeyi metodolojisi için bağımsız değişkenler ve seviyeler, Tablo S4: Tahmini regresyon verim katsayısı, Tablo S5: Verim için varyans analizi, Tablo S6: Tirozinaz inhibe edici aktivite için tahmini regresyon katsayısı, Tablo S7: Tirozinaz inhibe edici aktivite için varyans analizi, Tablo S8: Bileşik 1 için tahmini regresyon katsayısı, Tablo S9: bileşik 1 için varyans, Tablo S10: Bileşik 2 için tahmini regresyon katsayısı, Tablo S11. Bileşik 2 için varyans analizi, Tablo S12: Bileşik 1 ve 2'nin toplamı için tahmini regresyon katsayısı, Tablo S13: Bileşik 1 ve 2'nin toplamı için varyans analizi.
Yazar Katkıları: Kavramsallaştırma, KYL; metodoloji, K.-EO, HS ve KYL; yazılım, K.-EO ve HS; doğrulama, HS; biçimsel analiz, K.-EO ve HS; soruşturma, K.-EO, HS, MKL ve KYL; veri iyileştirme, K.-EO, HS, BP ve KYL; yazma— orijinal taslak hazırlama, K.-EO ve HS; yazma—inceleme ve düzenleme, HS, MKL, BP ve KYL; süpervizyon, MKL, BP ve KYL Tüm yazarlar makalenin yayınlanmış sürümünü okumuş ve kabul etmiştir.
Finansman: Bu araştırma, Kore Hükümeti tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı hibesi (NRF-2017R1A2B4003403 ve NRF-2019R1A6A1A03031807) ve Kore Sağlık Sektörü Geliştirme aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi hibesi tarafından desteklenmiştir. Enstitü (KHIDI), Kore Cumhuriyeti Sağlık ve Refah Bakanlığı (HF20C0038) tarafından finanse edilmektedir.
Veri Kullanılabilirliği Bildirimi: Bu çalışmada sunulan veriler ek materyalde mevcuttur.
Çıkar çatışmaları:Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Örnek Durumu: Müsait değil

Referanslar

1. Ranjbar, S.; Şahvaran, PS; Edraki, N.; Khoshneviszadeh, M.; Darroudi, M.; Sarrafifi, Y.; Hamzehloueian, M.; Khoshneviszadeh, M. 1, 2, Yeni tirozinaz inhibitörleri ve serbest radikal temizleyiciler olarak 3-Triazole bağlı 5-benziliden (tio) barbitüratlar. Ark. eczane 2020, 353, 2000058. [CrossRef] [PubMed]

2. Chang, T.-S.; Ding, H.-Y.; Lin, H.-C. Güçlü bir tirozinaz inhibitörü olarak 6, 7, 40 -trihidroksiizoflavonun belirlenmesi. Biyosci. Biyoteknoloji biyokimya 2005, 69, 1999–2001. [CrossRef] [PubMed]

3. Miyazawa, M.; Oşima, T.; Koshio, K.; Itsuzaki, Y.; Anzai, siyah pirinç kepeğinden J. Tirosinaz inhibitörü. J. Agric. Gıda Kimyası 2003, 51, 6953–6956. [ÇaprazRef]

4. Chen, Q.; Diao, L.; Şarkı, H.; Zhu, X. Vitis amurensis Rupr: Kimya ve farmakoloji üzerine bir inceleme. Bitki Tıbbı 2018, 49, 111–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Jin, K.-S.; Ah, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Vitis amurensis kökünden izole edilen Betulinik asit, B16F10 hücrelerinde MEK/ERK ve PI3K/Akt yollarının düzenlenmesi yoluyla 3-izobütil-1- metilksantin kaynaklı melanogenezi inhibe eder. Gıda Kimyası Toksikol. 2014, 68, 38–43. [ÇaprazRef]

6. Kim, H.; Thuong, PT; Ngoc, TM; Lee, I.; Asılı, ND; Bae, K. Vitis amurensis'in yaprağından ve gövdesinden oligostilbenlerin antioksidan ve lipoksijenaz inhibe edici aktivitesi. J. Ethnopharmacol. 2009, 125, 304–309. [ÇaprazRef]

7. Jin, K.-S.; Ah, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Vitis amurensis Ruprecht kökü, B16F10 hücrelerinde -melanosit uyarıcı hormon kaynaklı melanogenezi inhibe etti. Nutr. Res. Pratik 2014, 8, 509–515. [ÇaprazRef]

8. Jang, MH; Piao, XL; Kim, HY; Ço, EJ; Baek, SH; Kwon, SW; Park, Vitis amurensis kaynaklı JH Resveratrol oligomerleri, PC12 hücrelerinde amiloid kaynaklı oksidatif stresi azaltır. Biol. eczane Boğa. 2007, 30, 1130–1134. [ÇaprazRef]

9. Lee, E.-O.; Lee, H.-J.; Hwang, H.-S.; Ahn, K.-S.; Chae, C.; Kang, K.-S.; Lu, J.; Kim, S.-H. Apoptotik ve anti-anjiyojenik aktiviteler yoluyla Vitis amurensis'in köklerinden heksanol A ile Lewis akciğer kanseri büyümesinin güçlü inhibisyonu. Kanserojen 2006, 27, 2059–2069. [ÇaprazRef]

10. Bak, M.-J.; Truong, VL; Kang, H.-S.; Haz, M.; Jeong, W.-S. LPS ile indüklenen RAW 264.7 hücrelerinde yabani üzüm (Vitis amurensis) tohumlarından prosiyanidinlerin anti-enflamatuar etkisi. Oksit. Med. Hücre. Longev. 2013, 2013. [CrossRef]

11. Shin, H.; Chung, H.; Park, B.; Lee, KY DPPH tahlili ile birleştirilmiş LC-MS kullanılarak Polygonum aviculare'den antioksidan bileşenlerin tanımlanması. Nat. Üretim bilim 2016, 22, 64–69. [ÇaprazRef]

12.Park, S.; Shin, H.; Park, Y.; Choi, I.; Park, B.; Lee, KY Catalpa ovata'dan NO üretiminin inhibe edici bileşenlerinin hücre bazlı bir tahlil ile birleştirilmiş LC-MS kullanılarak karakterizasyonu. Biorg. kimya 2018, 80, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

13. Ingkaninan, K.; De Best, C.; Van Der Heijden, R.; Hofte, A.; Karabatak, B.; Irth, H.; Tjaden, U.; Van der Greef, J.; Verpoorte, R. Doğal ürünlerden asetilkolinesteraz inhibitörlerinin tanımlanması için çevrimiçi eşleştirilmiş UV, kütle spektrometrik ve biyokimyasal algılama ile yüksek performanslı sıvı kromatografisi. J. Kromatr. 2000, 872, 61–73. [ÇaprazRef]

14. Bezerra, MA; Santelli, RE; Oliveira, EP; Villar, LS; Escaleira, LA Analitik kimyada optimizasyon için bir araç olarak Tepki yüzey metodolojisi (RSM). Talanta 2008, 76, 965–977. [CrossRef] [PubMed]

15. Witek-Krowiak, A.; Chojnacka, K.; Podstawczyk, D.; Dawiec, A.; Pokomeda, K. Biyosorpsiyon sürecinin modellenmesi ve optimizasyonunda yanıt yüzeyi metodolojisi ve yapay sinir ağı yöntemlerinin uygulanması. biyolojik kaynak. Teknoloji 2014, 160, 150–160. [CrossRef] [PubMed]

16. Araujo, PW; Brereton, RG Deney tasarımı I. Tarama. Trend Analisti. kimya 1996, 15, 26–31. [ÇaprazRef]

17. Wang, Y.; Zhao, L.; Zhang, R.; Yang, X.; Güneş, Y.; Shi, L.; Xue, P. Kırmızı pirinç kepeğinden antosiyaninlerin yanıt yüzeyi metodolojisi, antioksidan kapasitesi ve tirozinaz inhibe edici aktivitesi ile ultrason destekli ekstraksiyonun optimizasyonu. Gıda Bilimi Nutr. 2020, 8, 921–932. [ÇaprazRef]

18. Weremfo, A.; Adulley, F.; Adarkwah-Yiadom, M. Tepki Yüzey Metodolojisi Kullanılarak Avokado (Persea americana Mill.) Tohumlarının Fenolik Bileşiklerin Mikrodalga Yardımlı Ekstraksiyonunun ve Antioksidan Aktivitesinin Eşzamanlı Optimizasyonu. J. Anal. Yöntemler Kimya. 2020, 2020, 7541927. [CrossRef]

19. Ko, J.; Choi, J.; Bae, SK; Kim, J; Yoon, KD Arkadaş oranlı gradyanlı yüksek performanslı karşı akım kromatografisi ile V itis amurensis'ten beş oligostilbenin ayrılması. J. Sep. Sci. 2013, 36, 3860–3865. [ÇaprazRef]

20. Wang, K.-T.; Chen, L.-G.; Tseng, S.-H.; Huang, J.-S.; Hsieh, M.-S.; Wang, C.-C. Resveratrol ve oligostilbenlerin Vitis thunbergii var. taiwaniana lipopolisakarit kaynaklı artrite karşı. J. Agric. Gıda Kimyası 2011, 59, 3649–3656. [ÇaprazRef]

21. Hu, J.; Lin, T.; Xu, J.; Ding, R.; Wang, G.; Şen, R.; Zhang, Y.-W.; Chen, H. Vitis thunbergii var. Tayvan, APP ile ilgili yolu düzenler. Biorg. Med. kimya Letonya 2016, 26, 505–511. [CrossRef] [PubMed]

22. Oşima, Y.; Kamijou, A.; Ohizumi, Y.; Niva, M.; Ito, J.; Hisamichi, K.; Takeshita, M. Vitis coignetiae'den yeni oligostilbenler. Tetrahedron 1995, 51, 11979–11986. [ÇaprazRef]

23. Anna Malinowska, M.; Kütük, K.; Drouet, S.; Münsch, T.; Ünlübayır, M.; Tungmunnithum, D.; Giglioli-Guivarc'h, N.; Hano, C.; Lanoue, A. Çok Fonksiyonlu Gençleştirici Kozmetik İçerik Olarak Üzüm Kamışı Özleri: Sirtuin Aktivitesinin, Tirosinaz İnhibisyonunun ve Biyoyararlanım Potansiyelinin Değerlendirilmesi. Moleküller 2020, 25, 2203. [CrossRef] [PubMed]

24. Yang, HH; Ah, K.-E.; Jo, YH; Ahn, JH; Liu, S.; Türk, A.; Jang, JY; Hwang, TARAFINDAN; Lee, KY; Lee, MK Humulus japonicus'un toprak üstü kısımlarından tirozinaz inhibe edici bileşenlerin LC-MS/MS eşleştirilmiş çevrimiçi deney kullanılarak karakterizasyonu. Biorg. Med. kimya 2018, 26, 509–515. [CrossRef] [PubMed]

25. Liu, Q.; Kim, C; Jo, YH; Kim, SB; Hwang, TARAFINDAN; Lee, MK Melanojenez inhibitörleri olarak resveratrol türevlerinin sentezi ve biyolojik değerlendirmesi. Moleküller 2015, 20, 16933–16945. [CrossRef] [PubMed]

Daha fazla bilgi için: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501