Cistanche Herba'nın Cistanosidi, Oksidatif Stresi Bastırarak Hipoksiye Bağlı Erkek Üreme Hasarını İyileştiriyor-Ⅰ

giriiş

Şu anda dünya çapında üreme çağındaki yaklaşık 48,5 milyon (%15) çift kısırlıktan etkilenmektedir; bunların arasında vakaların %40-50'si çevresel ve yaşam tarzı faktörleriyle güçlü bir şekilde ilişkili olan erkek kısırlığına atfedilmektedir. Kanıtlar, memeli testislerinin düşük oksijen basıncına duyarlılığının, bazı erkek kısırlığı türlerinde nedensel bir faktör olduğunu göstermektedir. Önceki çalışmalarda gösterildiği gibi, hipobarik hipoksiye maruz kalındığında spermatogenez bozulur ve azalır.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Altta yatan mekanizmayı araştırmak için yapılan çalışmalar, hipobarik hipoksiye maruz kalmanın reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini arttırdığını göstermiştir. ROS erkek üreme sisteminde önemli bir rol oynar. Düşük düzeylerde sperm kapasitasyonu, akrozom reaksiyonu ve spermatozoa-oosit füzyonu için gereklidirler. Bununla birlikte aşırı ROS, sperm nükleer/mitokondriyal DNA hasarına ve plazma zarı peroksidatif hasarına neden olabilir; bunlar da spermatozoanın başlıca etiyolojik faktörleridir.erkek kısırlığı riskinin artması. Dolayısıyla hipoksinin neden olduğu ROS birikimi, erkek kısırlığının bir nedeni olabilir.

Cistanches HerbaÇok yıllık parazitik bir şifalı bitki olan otu, kurak bölgelerde yaygın olarak yayılış göstermekte ve farmakolojik aktivitelerinden dolayı yaygın olarak kullanılmaktadır. Tüm etkili içeriklerin arasındaCistanches HerbaPhG'ler ana aktif bileşen olarak kabul edilmiştir. Bugüne kadar 34 PhG izole edilmiştir.Cistanches bitkileri. Cistanosid(Cis), izole edilmiş aktif bir PhGCistanches Herba, antioksidan etkileri nedeniyle dikkat çekmiştir.

Cis'in antioksidan etkileri ve hipoksi kaynaklı erkek kısırlığında ROS'un rolü göz önüne alındığında, Cis'in tedavi için potansiyel bir ilaç adayı olduğu düşünülmektedir.hipoksi kaynaklı erkek kısırlığı. Bununla birlikte, Cistanches Herba'dan ekstrakte edilen Cis'in hipoksi kaynaklı erkek kısırlığının tedavisinde veya ilgili sinyal yollarında antioksidan etkilerini ele alan az sayıda rapor bulunmaktadır. Bu çalışmada in vitro ve in vivo hipoksi deneysel modelleri oluşturulmuş ve farklı Cis'lerin etki bileşenleri değerlendirilmiştir.

Malzemeler ve yöntemler

Hücre kültürü ve reaktif

Fare spermatogonia hücre çizgisi GC-1spg (GC-1), American Type Culture Collection'dan (ATCC) satın alındı ​​ve %10 fetal sığır serumu, %1 ile desteklenen DMEM'de (Invitrogen, ABD) kültürlendi. L-glutamin (100 mM), penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 ug/ mL), %5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 derecede. Cis (Cis-A, B, C, H), Chengdu Gelipu Bioteknoloji Co., Ltd.'den (Çin) satın alınmıştır.

CİNSEL FONKSİYONU GELİŞTİREN DOĞAL CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Hücre canlılığı deneyi

Hücre canlılığı, hücre sayma kiti{{0}} tahlili (CCK-8) ile test edildi. Kısaca, GC-1 hücreleri 96-kuyu plakalarına, kuyucuk başına 1,5x103 olacak şekilde ekildi ve 24 saat boyunca 37 derecede kültürlendi. Daha sonra hücrelere farklı konsantrasyonlarda (%20, %15, %10, %5) oksijen veya farklı konsantrasyonlarda (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-) uygulandı. C, Cis-H) gerekli süre boyunca. Daha sonra süpernatan atıldı ve bir CCK-8 kiti (Dojindo Japan) kullanılarak hücre canlılığı tespit edildi. Her kuyucuğun absorbansı, bir mikroplaka okuyucu (BioRad USA) kullanılarak 450 nm'de ölçüldü. Son olarak, hücre canlılıkları aşağıdaki formüle göre hesaplandı: Hücre canlılığı=(ODdeney grubu - ODblank grubu)/ (ODkontrol grubu - ODblank grubu) × %100.

Western blot analizi

Hasat edilen hücreler veya dokular, proteinleri çıkarmak için RIPA tamponunda homojenleştirildi (RIPA Beyotime Çin; Kokteyl Roche İsviçre). Süpernatanlar toplandı ve proteinlerin konsantrasyonu BCA yöntemi (Beyotime) ile test edildi. Her numuneden yaklaşık 40 ug ekstrakte edilen proteinler, SDS-PAGE ile ayrıldı ve bir nitroselüloz (NC) filtre membranına (Beyotime Çin) elektrotransfer edildi. NC filtre membranları 1,5 saat boyunca %5 yağsız süt ile bloke edildi ve spesifik antikorlarla (anti-PARP 1:1000, antiCaspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1) inkübe edildi :1000, anti-GAPDH 1:1000; tüm antikorlar, Cell Signaling Technology, ABD'den gece boyunca 4 derecede satın alınmıştır. Daha sonra, tüm NC membranları, ilgili yaban turpu peroksidaz konjuge ikincil antikorla oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca inkübe edildi ve bir görüntüleme sistemi (Tannon, Çin) ile görüntülendi.

Hücre döngüsü tespiti

Hücre döngüsünü analiz etmek için bir akış sitometri deneyi (FCM) yapıldı. Hücreler 72 saat boyunca farklı koşullar altında muamele edildi ve toplandı. Hücreler daha sonra PBS ile yıkandı, %75 etanol içerisinde sabitlendi ve propidyum iyodür (PI) ile boyandı. Her numune için 1x104 hücre toplandı ve akış sitometrisi (FACS Calibur, BD Biosciences) ile analiz edildi. Daha sonra G1/S/G2 faz hücrelerinin oranı ve proliferasyon indeksi [Faz(S+G2)/Faz(G1+S+G2) x %100] hesaplandı.

Ki-67 boyama

Hücreler aynı odaklı bir tabakta kültürlendi ve 72 saat boyunca hipoksi veya farklı Cis alt tipleri ile tedavi edildi. Tüm hücreleri %4 paraformaldehid ile sabitledikten sonra, bir anti-Ki-67 antikoru (1:200, Hücre Sinyal Teknolojisi) ile inkübe edildiler. Daha sonra tüm hücreler, karşılık gelen bir CY-3-konjuge anti-tavşan IgG antikoru (1:200, Boster, Çin) ve DAPI çözeltisi (1,0 ug/mL, Beyotime) ile inkübe edildi. Floresan bir Fluoview FV1000 konfokal mikroskobu (Olympus, Japonya) ile gözlendi.

TESTOSTERON PHGS'Yİ ARTIRMAK İÇİN ÜST KADEME CISTANCHE TUBULOSA EKSTRESİ %75 ECH %30 ACT %12

ROS'un tespiti

FCM, DCFH-DA kullanılarak hücre içi ROS seviyelerini ölçmek için tanıtıldı. Askıya alınan hücreler 6-kuyucuklu plakalara ekildi ve farklı işlemlere tabi tutuldu. 72 saatlik tedaviden sonra hücreler, 10 μM DCFH-DA (Beyotime) içeren serumsuz DMEM içerisinde süspanse edildi. Daha sonra ROS içerikleri, 488 nm eksitasyon dalga boyu ve 525 nm emisyon dalga boyuna sahip bir Beckman Coulter Akış Sitometri Sistemi üzerinde floresansla aktifleşen hücre sınıflandırması ile belirlendi [18].

Lipid Peroksidasyonunun Tayini (LPO)

LPO'yu tespit etmek için tiyobarbitürik asit reaktif maddeler (TBARS) tahlili yapıldı. Tüm çalıştırma adımları talimatlara (Sigma ABD) göre gerçekleştirildi. Konsantrasyonlar, standart olarak malondialdehit kullanılarak elde edilen 1,56x105/(M·cm) molar yok olma katsayısı kullanılarak hesaplandı. Sonuçlar nmol MDA eşdeğeri/mg protein olarak ifade edilir.

Enzim aktivitelerinin belirlenmesi

Enzim aktiviteleri, glutatyon redüktaz (GR), glutatyon peroksidaz (GPx) ve süperoksit dismutaz (SOD) içeren tahlil kitleri kullanılarak test edildi. Tüm çalıştırma adımları sağlanan talimatlara göre gerçekleştirildi (Nan Jing Jian Cheng Biyomühendislik Enstitüsü Çin).

Hayvanlar ve Deney Protokolü

Olgun erkek Wistar fareleri (180-220 g, 8 yaşında), Çin'in Xi'an kentindeki Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi'nin hayvan merkezinden elde edildi. Hayvanların kullanım izni Üniversite Etik Kurulu'ndan alınmıştır (Referans numarası: 20190506). Hayvan deneyi, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin üniversite yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi.

Deneyin başlamasından önce tüm sıçanların yaklaşık 1 hafta boyunca uyum sağlamasına izin verildi. Alıştırma sonrasında sıçanlar rastgele her grupta 5 hayvan olacak şekilde 6 gruba dağıtıldı. Kontrol grubundaki sıçanlar normal basınç altında (PO2: %20; hava basıncı: 101,3 kPa) büyütülürken, modeldeki ve Cis ile tedavi edilen gruplardaki sıçanlar düşük basınçlı oksijen odasında (iç basınç 61,6 kPa) büyütüldü. yüksek irtifa hipoksik ortamı simüle etmek için deniz seviyesinden 4000 metre yüksekliğe eşdeğer; PO2: %14,55. Tüm sıçanlar, otomatik 12-saat aydınlık/karanlık döngüsüne sahip, 22 ± 2 derece ve nem koşullarındaki plastik kafeslerdeki yiyecek ve suya serbestçe erişebildi. Modeldeki ve Cis ile tedavi edilen gruplardaki sıçanlar hipobarik koşullar altında kaldı ancak her 96 saatte bir normobarik koşullara aktarıldı, bu sırada onlara yiyecek ve su sağlandı ve kafesler temizlendi. Hipobarikten hipobariğe geçiş süresi yaklaşık 2 saatti. Tüm tedavi gruplarına 8 hafta boyunca oral sondayla ilgili Cis (8 mg/kg/gün) uygulandı, kontrol ve model sıçanlara ise eşit hacimde su uygulandı.

8 hafta sonra sıçanlar anestezi altında sakrifiye edildi. Testisler, epididim ve seminal kesecikler ayrıldı ve tartıldı ve organ indeksi aşağıdaki formüle göre hesaplandı: (organ ağırlığı/hayvan ağırlığı) x %100. Daha sonra epididimdeki spermler toplanarak hareketlilikleri ve akrozom enzim aktiviteleri test edildi. Benzer şekilde histopatolojik çalışmalar ve ROS, LPO ve antioksidan enzim aktivitesinin tespiti için testis dokuları toplandı.

CISTANCHE TUBULOSA ÖZÜ CISTANCHE BİTKİ SEKS GÜCÜNÜ ARTIRIR PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Canlı sperm oranının değerlendirilmesi

Epididimis cerrahi makasla kesildi ve normal salin içinde sperm süspansiyonu hazırlandı. Canlı sperm oranını değerlendirmek için 5 μL sperm süspansiyonu eşit hacimde eozin-Y boyası ile dikkatlice karıştırıldı. Daha sonra spermler ışık mikroskobu altında sayıldı. Canlı sperm oranları, hem lekeli (ölü sperm) hem de lekesiz sperm (canlı sperm) hesaplanarak değerlendirildi.

Sperm akrozom enzim aktivitesinin belirlenmesi

Sperm akrozom enzimlerini değerlendirmek için sperm akrozom enzim aktivite analizi kullanıldı [19]. Her gruptaki sonuçlar aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı: Akrozom enzim aktivitesi (μIU)=(ODExperiment grubu - ODBlank grubu)/(247,5×106) × 106.

Sonuçlar

Hipoksinin GC-1 Hücreleri Üzerindeki Etkileri

Hipoksinin germ hücreleri üzerindeki etkilerini belirlemek için öncelikle 1, 3, 5 süreyle farklı oksijen konsantrasyonlarıyla (%20, %15, %10 ve %5) hipoksi tedavisinden sonra hücre canlılığındaki değişiklikleri inceledik. ve sırasıyla 7 gün. CCK-8 tahlili sonuçları, kontrol grubu (%20 oksijen konsantrasyonu) ile karşılaştırıldığında, hipoksiye maruz kalan hücrelerin yaşayabilirliğinde önemli bir azalma sergilediğini gösterdi (P < 0.01; Şekil 1A). Üstelik hayatta kalma oranları oksijen konsantrasyonuyla ters orantılıydı ve indüksiyon süresiyle daha da azaldı. Aşırı sitotoksik etkiyi önlemek için, sonraki in vitro deneyler için hipoksik model kriterleri olarak %10 oksijen konsantrasyonu ve 3-günlük indüksiyon süresi seçildi.

Daha sonra, hipoksi tedavisi altında GC{{0}} hücrelerinin proliferasyon değişimini daha fazla değerlendirmek için FCM ve immünofloresan boyama yapıldı. Sonuçlar, hipoksinin G1 fazında GC-1 hücresinin tutuklanmasına neden olabileceğini, dolayısıyla S fazına hücre girişini azaltabileceğini ve DNA replikasyonunu inhibe edebileceğini gösterdi. Dolayısıyla hipoksi, GC-1 hücrelerinin çoğalma indeksini önemli ölçüde azalttı (P < 0,01; Şekil 1B). Pozitif Ki-67 boyaması, çoğalan hücrelerin bir başka spesifik biyobelirtecidir. Bu nedenle hipoksi tedavisi uygulanan veya uygulanmayan Ki-67-pozitif hücrelerin oranını da inceledik. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında hipoksi tedavisi, Şekil 1C'de gösterildiği gibi Ki-67-pozitif hücreleri önemli ölçüde azalttı.

Daha sonra, hipoksinin neden olduğu GC{{0}} hücre canlılığı inhibisyonunun modunu araştırmayı amaçladık. Literatürde bildirildiği gibi, sıçanlar hipobarik hipoksik ortama maruz kaldıkça ROS seviyesi arttı [8, 20]. Dolayısıyla GC-1 hücrelerindeki endojen ROS seviyeleri FCM tahlili kullanılarak ölçüldü. Sonuçlar, normal oksijen grubuna kıyasla hipoksi altında daha yüksek ROS seviyelerini gösterdi (P <0,01; Şekil 1D). Birikmiş ROS belirgin DNA bozulmasına neden olur, bu da hücre apoptoz yolunun aktivasyonuna neden olur ve erkek kısırlığının artması riskinin ana etiyolojik faktörü olabilir [21, 22]. Daha sonra, TUNEL boyama ile hipoksinin GC-1 hücreleri üzerindeki apoptotik aktivasyon etkisini tespit ettik. Şekil 1E'de gösterildiği gibi, hipoksi ile tedavi, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında TUNEL floresansında bir artışla sonuçlandı; bu, model grubunda apoptozda bir artışa işaret ediyor.

ROS'un neden olduğu hücre hasarına genellikle işletim sistemi neden olduğundan, GC-1 hücrelerinin işletim sistemini daha da test ettik. Şekil 1F'de sunulduğu gibi, model grubundaki GC-1 hücrelerinin LPO seviyeleri, kontrol grubundaki GC-1 hücrelerinin LPO seviyelerine kıyasla belirgin şekilde arttı. Bu bulgular, hipoksinin neden olduğu GC-1 hücre hasarının, ROS birikiminin neden olduğu OS ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.