Ekinakozit, İnsan Fibroblastik Hücrelerinin MRC'sinin Hücresel Yaşlanmasını Geciktiriyor-5

İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com

Cistanche'nin etken maddesi: Ekinakozit yaşlanmayı nasıl geciktirir?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

Bu çalışmada, geleneksel Çin bitkisel ilacı Cistanches salsa'nın gövdelerinden izole edilen feniletanoidlerden biri olan ekinakozitin insan embriyosu akciğer fibroblastik MRC-5 hücreleri üzerindeki etkileri araştırıldı. Hücre proliferasyonunun aktivitesi Alamar Blue ile değerlendirildi, bu da ekinakozit tedavisinin yaşlanmayı geciktirebileceğini gösterdi. Akış sitometrisi sonuçları, ekinakozidin G1 fazındaki hücreleri S fazına ve G2 fazına girmesini tetikleyebileceğini ve ROS bozulmasını iyileştirebileceğini göstermektedir. Kuyruklu yıldız analizinden elde edilen sonuçlar, ekinakozitin hücreleri DNA hasarından koruyabildiğini ve kısmen etkilerinin mekanizmasını açıkladığını göstermektedir. Yukarıdaki sonuçların tümü, ekinakozidin potansiyel yaşlanma karşıtı aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir.

Cistanche Deserticola'nın birçok etkisi vardır, daha fazlasını öğrenmek için buraya tıklayın

1. Giriş

In vitro kültürlenen normal hücreler, sınırlı sayıda popülasyon iki katına ("Hayflflick limiti") kadar çoğalır ve replikatif yaşlanma aşamasına girer. Yaşlanmış hücreler, G1 fazında hücre büyümesinin durmasına ve hücresel genişleme, artan lizozom biyogenezi ve pH 6'da daha yüksek -galaktosidaz aktivitesinin ifadesi (yaşlanma ile ilişkili -galaktosidaz, SA- - -Gal dahil olmak üzere morfoloji ve metabolizmada bir değişiklik) geçirir. ) (Hayflflick ve Moorhead 1961; Dimri 1995). Yaşlanmış hücrelerin birikimi, yaşla ilgili düşüşün habercisidir.doku/organfonksiyonlar. Yaşlanmayı geciktirmenin veya tersine çevirmenin yoluna erişmek için aktif yaşlanma karşıtı maddeleri keşfetme çabaları hiç durmadı.Ekinakozitköklerinden izole edilen feniletanoidlerden biridir.Cistanches salsa, hem antiserum hem de potansiyel biyolojik aktivitelere sahip bir Çin geleneksel bitkisel ilacıanti-yorgunlukajan (Deng ve diğerleri 2004; Xiong ve diğerleri 1996). Ayrıca in vitro olarak güçlü bir etki olarak davrandığı bildirilmiştir.Bedavaradikalçöpçü(Facino et al. 1995) ve sergilersinir koruyucufaaliyetlerin vitro ve in vivo (Koo ve ark. 2005; Geng ve ark. 2007). Ekinakozit, yaşlanmayı geciktiren bir madde adayı olabilir ve yaşlanmayı önleyici aktivite biyolojik özelliklerinden biri olabilir. Bu nedenle, yaşlanmayı geciktirebileceğini veya tersine çevirebileceğini umarak, yaşlanmış bir insan embriyosu akciğer fibroblastik hücre dizisi MRC-5'yi ekinakozit ile tedavi ettik.

2. Araştırmalar ve sonuçlar

İlk olarak, hücre büyümesi ve hücre döngüleri üzerindeki etkisini kontrol etmek için kültür ortamına ekinakozit ekledik. Ekinakozide 48 saat maruz kalan hücrelerin canlılığının, konsantrasyon arttıkça kontrole göre belirgin şekilde arttığı gözlemlendi (Şekil 1A), bu da ekinakozidin yaşlanan hücrelerin çoğalmasına yardımcı olduğunu gösteriyor. SA-Gal boyamanın sonucu, ekinakozid tedavisinden sonra SA--Gal seviyesinin belirgin bir şekilde azaldığını gösterdi (veriler gösterilmemiştir), bu da yaşlanan hücrelerin bir kısmının yaşlanmadan tersine döndüğünü düşündürür. Yaşlanmış hücrelerin gerçekten ekinakozid tarafından çoğalmaya yönlendirilip yönlendirilmediğini doğrulamak için, ekinakozid ile tedaviden sonra yaşlanmış MRC-5 hücrelerinin hücre döngüsü faz değişimini kontrol etmek için diğer sitometri tanıtıldı. Çalışmamızda Ekinakozid konsantrasyonunun artmasıyla birlikte G1 dönemindeki hücre oranının giderek azaldığını gözlemledik. Aksine, daha fazla hücre S fazına ve G2 fazına girmeye yönlendirildi (Şekil 1B). Senesansla ilişkili heterokromatin odaklarının (SAHF) birikimi, yaşlanan hücrelerin bir başka spesifik biyobelirtecidir (Shay ve Wright 2001). Yaşlanmış hücreler, Hoechst boyaması ile görüntülenen noktalanmış DNA odakları sergiledi (Şekil 1C). Buna karşılık, ekinakozit ile tedavi edilen MRC-5 hücrelerinin daha az SAHF'ye sahip olduğu görüldü.

Hücreler Hayflflick limitine yaklaştıkça reaktif oksijen türlerinin (ROS) seviyesi artar (Hutter ve ark. 2002). Ölümcül olmayan seviyelerde ROS ile hücrelerin sürekli tedavisi, sadece lipofuscin gibi oksidatif hasar ürünlerinin seviyesini arttırmakla kalmaz (Sitte ve diğerleri 2001), aynı zamanda p53-büyüme inhibitörünün aktivasyonu ile birlikte kalıcı büyüme durmasına da neden olur. yolu (Toussaint ve ark. 2000). Bu nedenle, hücresel düzeyde ROS, yaşlanmayı indüklemede önemli bir rol oynar. FL floresan boya DCFH-DA, diğer sitometri ile ROS içeriğini ölçmek için kullanıldı. Kontrol ile karşılaştırıldığında, ekinakozid ile inkübe edilen hücrelerde ROS içeriğinin belirgin şekilde azaldığı gösterilmiştir (Şekil 2A). Bu sonuçlar gösteriyor kiekinakozitROS üretimini azaltan veya ROS giderimini hızlandıran bir antioksidan görevi görebilir.

Biriken reaktif oksijen türleri (ROS), proteinler, DNA ve telomerler dahil olmak üzere hücrelerdeki makromoleküllerin dikkate değer bir şekilde bozulmasına neden olur (Kovtun ve ark. 2007). Oksidatif DNA hasarları, normal insan fibroblastlarında p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen ve ark. 1998) ifadesinin ve hücre yaşlanmasının ardından p53-bağımlı G1 büyüme durmasını tetikler. DNA hasarını ve onarımını ölçmek için bir kuyruklu yıldız tahlili kullandık. DNA parçalarının boyutu ve kırılmaların sayısı, görülen kuyruklu yıldızın göçünü ve modelini belirler. Kuyruk DNA içeriği (kuyruk uzunluğu ve kuyruk DNA içeriğinin ürünü) hasarla birlikte artar. Sonuçlarımız, ekinakozit ile ön tedavinin DNA hasarının onarımını kısmen destekleyebileceğini, en azından hücreleri H2O2'nin neden olduğu DNA lezyonlarından koruyabileceğini göstermektedir (Şekil 2B). Bu gerçeklere dayanarak, ekinakozidin en azından MRC-5 hücrelerinde yaşlanma karşıtı aktiviteye sahip olduğu sonucuna varıyoruz. Çalışmamızın sonuçları, ekinakozidin ROS birikimini azaltabildiğini, hücreleri DNA hasarından koruyabildiğini, MRC-5 hücrelerini G1 fazından S ve G2 fazlarına yükseltebildiğini ve böylece hücrelerin proliferasyonunu iyileştirebildiğini göstermektedir. Genel olarak konuşursak, ekinakozitin MRC-5 hücreleri üzerindeki etkileri iki yöne ayrılabilir: hücre proliferasyonunu teşvik etmek ve ROS birikimini azaltmak. Hücre yaşlanmasının kesin mekanizması hala bilinmese ve hücre döngüsü düzenleme ağı tartışmalı olmaya devam etse de, ekinakozidin hücreleri oksidatif hasardan koruyabildiğini gösterdik. Bu nedenle, spekülasyon yapıyoruzekinakozitKesin altta yatan mekanizma açık bir soru olarak kalsa ve daha ileri çalışmalar devam etse de, yaşlanmayı düzenlemek için iyi bir aday olabilir.

3. Deneysel

3.1. Hücre kültürü ve tedavisi

İnsan embriyosu akciğer fibroblastik hücre dizisi MRC{{0}} (Biyokimya ve Hücre Biyolojisi Enstitüsü, SIBS, CAS), modifiye edilmiş minimum temel ortamda (Gibco/BRL) muhafaza edildi ve yüzde 10 fetal sığır serumu ile desteklendi. MRC-5 hücreleri, metabolizmanın yavaşlaması ve 7 gün içinde bölünmenin durmasıyla değerlendirilen, çoklu hücre geçişlerinden sonra replikatif yaşlanmaya uğrar. Tüm kültürler, aksi belirtilmedikçe 104/cm2'lik bir hücre yoğunluğunda tohumlandı ve 7 gün boyunca bozulmadan çoğalmaya bırakıldı. Aksi belirtilmedikçe, kontrol olarak solvent ile incelemeden 48 saat önce çeşitli ekinakozit konsantrasyonları eklendi. Kültürlerdeki DMSO konsantrasyonu yüzde 0.3'ten (h/h) daha azdı. H2O2 işlemi için hücreler, 12 saat boyunca 250 M H2O2 ile indüklendi.

3.2. Hayatta kalma oranı tahlili

Hücreler kültürlendi ve 96 oyuklu plakalar üzerinde ekinakozit ile işlendi. Tespitten önce, ortama yüzde 10 Alamar BlueTM eklendi ve 4 saat inkübe edildi. Absorbans, bir spektrofotometre ile ölçüldü.

3.3. Akış sitometrisi analizi

Sırasıyla propidium iyodür ve DCFH-DA kullanılarak DNA içeriğini ve hücre içi ROS seviyelerini ölçmek için akış sitometrisi tanıtıldı. Hücreler, 100 mm çaplı tabaklarda 105 hücre/10 ml hücre çözeltisi yoğunluğunda kaplandı ve hücre tohumlandıktan sonra 48 saat boyunca ekinakozit ile desteklendi. 48 saatlik işlemden sonra hücreler toplandı ve santrifüjlemeden sonra PBS içinde yıkandı, ardından yüzde 0.1 RNaz ve 50 g/ml propidyum iyodür veya 10 M DCFH-DA içeren kültür ortamı içeren PBS çözeltisi içinde 30 dakika yeniden süspanse edildi. DNA veya ROS içerikleri daha sonra bir Beckman Coulter Akış Sitometri Sisteminde FL floresanla aktive olan hücre sınıflandırması ile belirlendi. Veriler MultiCycle yazılımı ile analiz edildi.

3.4. Hoechst boyama

Hücreler kültürlendi ve 96 oyuklu bir plaka üzerinde 48 saat ekinakozit ile işlendi. Ortam çıkarıldı, Hücreler PBS ile yıkandı, daha sonra 20 dakika boyunca PBS içinde yüzde 4 formaldehit ile sabitlendi, ardından bir kez PBS ile yıkandı ve 10 dakika boyunca Hoechst boyası ile lekelendi. Resimler çekildi.

3.5. Tek hücreli jel elektroforezi (kuyruklu yıldız tahlili)

Comet tahlili rapor edildiği gibi yapılmıştır (Olive ve Banath 2006). Bireysel kuyruklu yıldız görüntüleri CometScore yazılımı ile analiz edildi. Teşekkür: Bu çalışma, Çin Ulusal Temel Araştırma Programı (973 Projesi) (No. 2007CB507406), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 30572341) ve Tsinghua-Yue-Yuen Tıp Bilimleri Fonu (THYY20070008) tarafından finansal olarak desteklenmiştir. ).