Uyku Yoksunluğu Modeli Sıçanlarda Cistanche Glyeosides'in Biliş Öğrenme ve Sinaptik Plastisite Üzerindeki Etkileri

SOYUT

Amaç:''olup olmadığını araştırmak.''cistanche glikozitlerigeliştirebilirUyku yoksunluğunun öğrenme ve bilişsel işlevimodel farelersinaptik plastisitenin düzenlenmesi. Yöntemler: Elli adet erkek Wistar sıçanı rastgele olarak boş kontrol grubu (Kontrol), platform kontrol grubu (PC), model grubu (Model),cistanche grubunun glikozitleri( GC'ler) ve estazolam grubu ( Est). Sıçanların uyku yoksunluğu modeli, modifiye edilmiş çok platformlu su ortamı yöntemiyle hazırlandı. Farelerin tespitinde Morris su labirenti ve açık alan testi kullanıldı.uzaysal bilişsel işlev ave duygusal değişiklikler. değişiklikleri gözlemlemek için Nissl boyama kullanıldı.Sinir hücrelerinin morfolojisi ve miktarısıçanların hipokampal CAl bölgesinde. Sinaptofizin (SYN), postsinaptik membran yoğun madde 95 (PSD - 95) ve beyinden türetilen nörotrofik faktörün (BDNF) ekspresyon seviyelerini tespit etmek için Western blot ve R'T - PCl kullanıldı. Bulgular: Morris su labirenti sonuçları, Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında,öğrenme ve bilişsel yetenekModel grubundaki sıçanların sayısı önemli ölçüde azaldı ( P<0. 05 ), and thesıçanların öğrenme ve hafıza fonksiyonuGC tedavisinde iyileşme sağlandı ( P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).

Çözüm: Cistanche glikozitleriSinaptik ile ilişkili belirteçlerin ekspresyonunu düzenleyerek sinaptik plastisiteyi etkileyebilir, böylece uyku yoksunluğu modeli sıçanların öğrenme ve bilişsel işlevini geliştirebilir.

ANAHTAR KELİMELERCistanche'nin glikozitleri; Hipokampus; Uyku yoksunluğu; Öğrenme ve hafıza; Endişe; Sinaptik esneklik

SATILIK CISTANCHE'IN YÜKSEK DÜZEY GLİKOZİTLERİ

Uyku bozukluğu (SD)birUykunun fonksiyonel bozukluğuUykusuzluk, sık görülen rüyalar ve kolay uyanma gibi bir dizi karmaşık faktörden kaynaklanır. Son yıllarda SD görülme sıklığı giderek artmaktadır. İlgili çalışmalar SD'nin neden olabileceğini bildirmiştir.kardiyovasküler hastalıklar, metabolik fonksiyon bozukluğu, bağışıklık hastalıklarıve Alzheimer hastalığı gibi merkezi sinir sistemi dejeneratif hastalıkları [1]. SD, hipokampal nöronlarda oksidatif hasara neden olabilir, bilişsel işlev bozukluğuna neden olabilir ve anksiyete ve depresyon gibi duygudurum değişikliklerine neden olabilir. Cistanche Deserticola, ilaç ve gıda olarak kullanılabilecek değerli bir Çin tıbbi malzemesidir. Böbreği tonlama ve qi'yi yenileme, bağırsakları nemlendirme, bağırsak hareketlerini teşvik etme ve yang'ı güçlendirme etkileri vardır. Cistanche Deserticola'nın ana ekstraktı olan cistanche glikozitleri (GC'ler), antioksidan, anti-apoptotik, karaciğer koruyucu ve nöroprotektif etkilere sahiptir [3]. Önceki araştırmamız, GC'lerin, antioksidan ve anti-apoptotik bir rol oynayarak SAMP8 farelerinin öğrenme ve bilişsel işlevlerini iyileştirebileceğini buldu [4]. İlgili çalışmalar SD'nin neden olduğu bilişsel işlev bozukluğunun sinaptik plastisite ile yakından ilişkili olduğunu göstermiştir [5]. Bununla birlikte, GC'lerin sinaptik plastisiteyi düzenlediği ve farelerde uyku yoksunluğunun neden olduğu öğrenme ve hafıza bozukluklarını ve bilişsel gerilemeyi iyileştirdiği mekanizma hakkında çok az rapor vardır. Bu nedenle, bu çalışma, sinaptik ile ilgili belirteçlerin ekspresyonunu düzenleyerek GC'lerin sinaptik plastisiteyi etkileyip etkilemediğini araştırmayı, böylece uyku yoksunluğu modelinde sıçanların öğrenme ve bilişsel işlevlerini iyileştirmeyi ve öğrenme ve öğrenme bozukluklarının tedavisi için yeni tedavi fikirleri ve planları sağlamayı amaçlamaktadır. GC'li uyku bozukluklarının neden olduğu bilişsel bozulma.

1 Malzemeler ve Yöntemler

1. 1 Deney hayvanları

6 ila 8 haftalık, 280 ila 300 g ağırlığındaki erkek Wistar sıçanları, hayvan üretim lisansı [SCXK (Beijing) 2019-0010] ile Pekin Sibeifu'dan satın alındı. Tüm hayvanlar, Baotou Tıp Fakültesi Hayvan Deney Merkezi'nde şu koşullar altında tutuldu: sıcaklık (24 ± 1) derece, %50 ila %55 nem, 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık ve yiyecek ve su kısıtlaması yok. Bu deney okul etik kurulu tarafından onaylandı [Baoyi Lunshen 2022 No. (63)].

1. 2 Ana reaktifler ve cihazlar

Cistanche Deserticola'nın toplam glikozitleri Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd.'den satın alınmıştır (parti numarası: KSM20220609011); Estazolam tabletleri CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical'dan (parti numarası: 044220343) satın alınmıştır; protein yükleme tamponu (P1015), RIPA lizis tamponu (R0010), kemilüminesans solüsyon (PE0010), vb. hepsi Beijing Solebao'dan satın alınmıştır; postsinaptik yoğunluk maddesi 95 (PSD-95) antikoru (AB192757), sinaptofizin (SYN) antikoru (ab32127), Abcam, ABD'den satın alınmıştır; beyinden türetilen nörotrofik faktör (BDNF) (48503-2), -aktin (52901), SAB, ABD'den satın alınmıştır; keçi anti-tavşan IgG ikincil antikoru (SA00001-20), Proteintech, ABD'den satın alınmıştır; sıçan melatonini (MT), ELISA kiti (MM-0657R1), Jiangsu Enzyme Immunity Industry Co., Ltd.'den satın alınmıştır. Parafin dilimleyici (Leica, Almanya); optik mikroskop (Leica, Almanya); Morris su labirenti, açık alan test kutusu (Şangay Xinruan); dikey elektroforez aleti

(Pekin Liuyi Şirketi); renk giderici çalkalayıcı (Beijing Liuyi Company); protein görüntüleme analiz sistemi (Şanghay Tanon Teknolojisi); floresan kantitatif PCR cihazı (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Deneysel yöntemler

1. 3. 1 Hayvan gruplaması ve ilaç uygulaması

50 erkek Wistar sıçanı rastgele olarak boş kontrol grubu (Kontrol grubu), platform kontrol grubu (Platform kontrol, PC grubu), model grubu (Model grubu), Cistanche Deserticola grubunun toplam glikozitleri (GC grubu) olarak ayrıldı. , 50 mg/kg) ve estazola grubu (Est grubu, 0,54 mg/kg), her grupta 10 sıçan bulunmaktadır. Kontrol grubuna ve PC grubuna sondayla %0,9 salin verildi. Modelleme başladıktan sonra tüm gruplara her gün sabah saat 7'de sondayla besleme uygulandı ve sondayla besleme 21 gün sürdü.

1. 3. 2. Uyku yoksunluğu hayvan modelinin hazırlanması

Uyku yoksunluğu modeli, değiştirilmiş çok platformlu su ortamı yöntemi kullanılarak oluşturulmuştur [6]. Deney ekipmanı 130 cm x 50 cm x 45 cm boyutlarında dikdörtgen polietilen reçineli su tankıydı. Su tankının içerisine 5 cm çapında ve 20 cm yüksekliğinde küçük bir platform yerleştirildi. PC grubunun platformu 10 cm çapında ve 20 cm yüksekliğindeydi. Su deposu yaklaşık 18 cm derinliğe kadar suyla dolduruldu ve su sıcaklığı (20±1) derecede tutuldu. Deneyin başlamasından bir hafta önce, sıçanlar çevreye alışmaları için her gün 60 dakika boyunca uyku yoksunluğu kutusuna yerleştirildi. Model oluşturulduktan sonra, Kontrol grubu dışındaki her gruptaki sıçanlar, birbirini izleyen 21 gün boyunca her gün sabah 8'den akşam 8'e kadar uyku yoksunluğu için küçük platforma zamanında yerleştirildi. Tüm sıçanların platform üzerinde her gün 12 saat aydınlık-karanlık değişimiyle serbestçe yeme, içme ve serbestçe hareket etmelerine izin verildi.

1.3.3 Morris su labirenti deneyi

Morris su labirenti 4 alana bölünerek içi suyla dolduruldu ve platform 4. çeyreğe yerleştirildi. Su yüzeyi platformun yaklaşık 2 cm üzerindeydi. Suya gıdada kullanılabilir yenilebilir melanin eklendi ve su sıcaklığı (25±1) derecede tutuldu. (1) Konumlandırma navigasyon deneyi: Her alanın merkezi seçildi ve fareler yavaşça suya yerleştirildi. Özgürce keşfetmelerine izin verildi. Sıçanların 60 saniye içinde hedef platformu bulmaları için geçen süre kaydedildi. Platformu bulamayan fareler platforma yönlendirilerek 20 saniye orada kaldı. Eğitim 5 gün boyunca devam etti. (2) Uzaysal keşif testi: 6. günde platform kaldırılarak sıçanlar 2. çeyreğin ortasından duvara dayalı olarak suya yerleştirildi. Ratların 120 saniye içerisinde platformu geçme sayıları ve 4. kadranda kaldıkları süreler kaydedildi.

1.3. 4 Açık alan deneyi

100 cm x 100 cm x 50 cm ölçülerinde deney kutusu kullanılmış olup, kutunun alt kısmı 9 kareye bölünmüştür. Her bir grup sıçan, iç ortama uyum sağlamaları için 60 dakika süreyle önceden açık alan deney odasına yerleştirildi. Deneyin başında test sıçanları açık alan deney kutusunun sabit köşelerine sırasıyla yerleştirildi ve davranış analiz yazılımı kullanılarak sıçanların 5 dakika içindeki ayakta durma süreleri, hareket mesafeleri ve statik süreleri kaydedildi. . Deney sırasında ortamın sessiz olması gerekiyordu ve önceki sıçanın kokusunun bir sonraki sıçanın davranış kararını etkilemesini önlemek için deney cihazı iki deney arasında sırasıyla temiz su ve alkolle silindi.

1. 3. 5 Enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA)

Sıçanlarda serum MT düzeylerinin tespiti Sıçanlara intraperitoneal enjeksiyonla anestezi uygulandı ve abdominal aorttan 5 mL kan toplandı. Oda sıcaklığında 30 dakika bekletildikten sonra kan santrifüj edilerek serum elde edildi. Her kuyucuğa 40 μL örnek seyreltici eklendi ve ardından test edilecek örnekten 10 μL eklendi. Sızdırmazlık filmi ile kapatıldıktan sonra 30 dakika boyunca 37 derecede inkübe edin. 5 kez yıkayın, 50 μL enzim etiketleme çözeltisi ekleyin ve sızdırmazlık filmiyle kapatıldıktan sonra 37 derecede 30 dakika inkübe edin. 5 kez yıkayın, ardından sırasıyla renk geliştirici solüsyonu ve reaksiyon durdurma solüsyonunu ekleyin. Her bir kuyucuğun OD değeri, 450 nm dalga boyunda enzim etiketleme cihazı ile ölçüldü.

１. ３. ６ Nissl boyama

Her gruptan üçer sıçan alınarak beyin dokusu dekapitasyon yoluyla çıkarıldı. Beyin dokusu %4'lük polimetil metakrilat solüsyonu ile sabitlendi ve doku dehidre edilerek mum solüsyonuna daldırılarak gömüldü ve doku geleneksel yöntemlerle dilimlendi. Dilimler 5 μm kalınlığında tutuldu, PBS ile durulandı, 0 ile boyandı. 0 için %1 toluidin mavisi. 5 saat, %95 alkol ile ayrıştırılır, %100 alkol ile dehidre edilir, ksilen ile şeffaflaştırılır ve nötr sakız ile kapatılır. Sıçan hipokampusunun CA1 bölgesindeki nöronların morfolojisi ve sayısındaki değişiklikler mikroskop altında gözlemlendi ve görüntüler toplandı.

１. ３. 7 Western leke deneyi

Her gruptan dört sıçan seçildi ve hipokampus, başları kesilerek izole edildi. Hipokampus dokusu, bir buz banyosu ortamında RIP A lizis tamponu ile karıştırıldı ve süpernatantı elde etmek için santrifüjlendi. Protein konsantrasyonu BCA yöntemiyle tespit edildi. Elektroforez için protein yükleme tamponu ile birlikte 20 ug protein ilave edildi. Protein elektroforezi tamamlandıktan sonra membran 300 mA sabit akışta aktarıldı, %5 yağsız süt tozu ile bloklandı, primer antikor 4 derecede gece boyunca inkübe edildi ve sekonder antikor oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi. Renk geliştirme solüsyonu kullanıldıktan sonra protein bantlarının istatistiksel analizi için kemilüminesans görüntüleme analiz sistemi kullanıldı.

1. 3. 8 RT-PCR deneyi

Hipokampus dokusu homojenatını hazırlamak için her gruptan üç sıçan seçildi. Doku sıvısındaki toplam RNA, Trizol yöntemiyle ekstre edildi ve konsantrasyon ölçüldü. Ters transkripsiyon için bir açlık cDNA sentez kiti kullanıldı ve bir floresan kantitatif kit kullanılarak sinaptikle ilişkili protein mRNA'nın göreceli ekspresyon seviyesini tespit etmek için bir floresan kantitatif amplifikasyon reaksiyonu kullanıldı. Sonuçlar 2-ΔΔCt kullanılarak analiz edildi ve primer dizileri Tablo 1'de gösterildi.

1.4 İstatistiksel yöntemler

Normal dağılıma uyan veri sonuçları ortalama ± standart sapma (x ± s) olarak ifade edildi ve istatistiksel analiz GraphPad Prism 9.5 yazılımı kullanılarak yapıldı. Birden fazla örnek arasındaki karşılaştırma için tek faktörlü varyans analizi kullanıldı ve P < 0.05, farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğunu gösterdi.