Metformin, AMPK/ BDNF/PI3K Yolunun Aktivasyonu Yoluyla Yaşlanmada Nörobilişsel Bozukluğu Hafifletiyor BÖLÜM 2

Cistanche glikozidi ayrıca kalp ve karaciğer dokularında SOD aktivitesini artırabilir ve her dokudaki lipofuscin ve MDA içeriğini önemli ölçüde azaltabilir, çeşitli reaktif oksijen radikallerini (OH-, H₂O₂, vb.) etkili bir şekilde temizleyerek ve neden olduğu DNA hasarına karşı koruma sağlayabilir. OH radikalleri tarafından. Cistanche feniletanoid glikozitler, serbest radikalleri güçlü bir şekilde süpürme yeteneğine, C vitamininden daha yüksek bir indirgeme kabiliyetine sahiptir, sperm süspansiyonunda SOD aktivitesini geliştirir, MDA içeriğini azaltır ve sperm zarı işlevi üzerinde belirli bir koruyucu etkiye sahiptir. Cistanche polisakkaritleri, D-galaktozun neden olduğu deneysel olarak yaşlanmış farelerin eritrositlerinde ve akciğer dokularında SOD ve GSH-Px aktivitesini artırabilir, ayrıca akciğer ve plazmadaki MDA ve kollajen içeriğini azaltabilir ve elastin içeriğini artırabilir. DPPH üzerinde iyi bir temizleme etkisi, yaşlanmış farelerde hipoksi süresini uzatır, serumdaki SOD aktivitesini geliştirir ve deneysel olarak yaşlanmış farelerde akciğerin fizyolojik dejenerasyonunu geciktirir. Hücresel morfolojik dejenerasyonla, deneyler Cistanche'nin iyi antioksidan yeteneğe sahip olduğunu göstermiştir ve cilt yaşlanması hastalıklarını önleyen ve tedavi eden bir ilaç olma potansiyeline sahiptir. Aynı zamanda, Cistanche'deki ekinacoside, DPPH serbest radikallerini temizleme konusunda önemli bir yeteneğe sahiptir ve reaktif oksijen türlerini temizleyebilir, serbest radikal kaynaklı kollajen bozulmasını önleyebilir ve ayrıca timin serbest radikal anyon hasarı üzerinde iyi bir onarım etkisine sahiptir.

Yaşlanma Karşıtı Cistanche Root Supplement'e tıklayın

【Daha fazla bilgi için: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ayrıca, AMPK sinyalinin aktivasyonu, SIRT129'u aktive ederek, FOXO proteinlerini35 uyararak ve ER stresini inhibe ederek ve oksidatif stresi azaltarak inflamatuar reaksiyonları baskılar. Tüm bu mekanizmalar daha sonra yaşlanmayla ilişkili NF-κB sinyalini ve nöroinflamasyonu baskılayacaktır36. AMPK, anti-enflamatuar etkilerine ek olarak, anjiyogenez, otofaji geliştirme ve mitokondriyal protein indüksiyonu16 dahil olmak üzere çeşitli aktivitelerde yer alır.

Farklı bağlamlarda AMPK'ye bağlı koruyucu roller bildirilmiş olsa da, metforminin AMPK'dan bağımsız davranışları daha az çalışılmıştır. Bu çalışma, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında D-gal grubunda PI3K geninin önemli ölçüde aşağı regülasyonunun olduğunu, metformin birlikte uygulanmasının ise D-gal grubuyla karşılaştırıldığında seviyesinin yukarı regülasyonuna yol açtığını ortaya koydu. PI3K/Akt, hücre apoptozunun önlenmesinde önemli sinyal yollarından biridir. PI3K aktivasyonunu Akt1 fosforilasyonu takip edebilir. Akt1, c-Jun'un aktivasyonunu destekleyen JNK3'ün fosforilasyonunu inhibe edebilir. C-Jun, apoptotik proteinlerin ifadesini indükleyebilen bir proteindir37. Tus, Akt1 aktivasyonu, JNK3 ve c-Jun'un inaktivasyonuyla sonuçlanacak ve ardından hücre hayatta kalma oranı iyileşecektir. Bu nedenle, apoptotik belirteçler kaspaz-3 ve Bcl-2'nin immünohistokimyasal reaksiyonunu inceleyerek metforminin hücresel apoptoz üzerindeki etkilerini araştırdık. Bu çalışma, kontrol ile karşılaştırıldığında D-gal grubunun hipokampüsünde apoptotik belirteç kaspaz-3 ifadesinde bir artışı ve anti-apoptotik işaretleyici Bcl-2 ifadesinde bir azalmayı ortaya çıkardı grup. Sonuçlarımızı destekleyen önceki çalışmalar, mitokondriyal ROS'un çok sayıda mitokondriyal apoptotik proteinin aktivasyonunu indükleyerek hücresel apoptoz ve organ hasarına yol açtığını doğruladı38. Birçok apoptotik protein, D-gal39 enjeksiyonu ile indüklenen yaşlanmada anti-apoptotik proteinlerle yakından ilişkilidir. Kaspaz-3'ın memelilerde apoptozun temel bir faktörü olduğu bilinmektedir40. Te Bcl-2 proteini, apoptozun engellenmesinde önemli bir oyuncudur. Hücre yaşlanmasında bilinen bir faktördür ve aşırı ekspresyonu, serbest radikallerin neden olduğu apoptozu etkili bir şekilde önleyebilir41. Genellikle Bcl-2'nin kaspaz-3 aktivasyonunun aşağısında hareket ettiğine ve dolayısıyla apoptozun inhibe edildiğine inanılır42. Sonuçlarımızda gösterildiği gibi, metformin uygulaması Kaspaz-3/Bcl-2 oranını önemli ölçüde azaltır. Bu sonuçlar, AMPK'nin metformin tarafından aktivasyonunun Bcl-2 protein ekspresyonunu yukarı regüle ettiğini, böylece D-gal tarafından indüklenen apoptotik hücre ölümüne karşı koruduğunu ve nöronal canlılığı arttırdığını öne süren diğer araştırmalardan alınmıştır43.

BDNF, yaşlanmayla ilişkili moleküler ve biyokimyasal değişiklikler ile hafıza kusurları arasında bir bağlantı kurmaya yardımcı olabilecek ilginç bir moleküler adaydır. Optimal bilişsel işlev, verimli nöronal plastisite ile bağlantılıdır. Yaşlanma ile ilişkili hafıza kusurları, önemli bir nörotrofik faktör olan BDNF gibi plastisite ile ilgili proteinlerin ekspresyonundaki ve düzenlenmesindeki değişikliklerle birleştirilebilir. BDNF azalmasının nöronal atrofiye ve ölüme yol açtığı gösterilmiştir44.

Bu çalışma, D-gal grubundaki BDNF düzeyinin kontrol grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı derecede düşük olduğunu ortaya koydu. Önceki çalışmalarda45 yaşlanan hayvanlarda BDNF ve/veya reseptörlerinde bir azalma belirgindi. Mizisin ve ark. aldoz redüktaz tarafından galaktoz metabolizmasının, sinir ve kas BDNF46 üretimini değiştirerek aksonal işlevi ve yapıyı etkilediğini öne sürdü. Tersine, metformin ile tedavi, D-gal grubuyla karşılaştırıldığında BDNF'de anlamlı bir artışla ilişkilendirildi. Sonuçlarımız, metforminin AMPK aktivasyonu47 yoluyla BDNF'yi yukarı regüle ettiğini gösteren daha önce yayınlanmış raporlarla uyumluydu.

LTP'deki kritik rolü nedeniyle BDNF'nin, sinaptik konsolidasyonu teşvik ederek hafıza oluşumunu ve bakımını destekleyen hücresel mekanizmanın önemli bir parçası olduğu varsayılmıştır. BDNF, LTP'nin stabilizasyonuna yol açan omurga morfolojisindeki değişiklikleri destekleyerek bellek depolamasını artırır. BDNF ayrıca dendritik dikenlerin sayısını, boyutunu ve karmaşıklığını artırabilir. Ayrıca BDNF, hücre proliferasyonundaki değişiklikler yoluyla nörogenezi artırır10. BDNF'nin TrkB reseptörlerine bağlanması, apoptozu inhibe eden ve hücre sağkalımını destekleyen PI3K aktivitesini indükler22.

Birlikte ele alındığında, çalışmamız, metforminin nörobilişsel bozukluğu iyileştirmedeki yaşlanma karşıtı etkilerinin, en azından kısmen, AMPK/BDNF/PI3K yolunun aktivasyonuna bağlı olabileceğini düşündürmektedir.

Hipokampus, öğrenme ve hafızanın sağlamlaştırılmasında olduğu kadar davranışlarda ve ruh hali düzenlemesinde ve hem işlevsel hem de yapısal esnekliğin yetişkinliğe kadar iyi bir şekilde ortaya çıktığı yerde önemli bir rol oynar. Önceki çalışmalar, hipokampüsün yaşlanmayla birlikte hem genel olarak hem de hücresel düzeyde çeşitli yapısal değişikliklere uğradığını bildirmiştir48. D-gal grubundaki hipokampusun H&E çalışması, çoklu apoptotik cisimler ve glioz ile ciddi nöronal dejenerasyon gösterdi. Bu sonuç, d-galaktozun oksidatif stres, inflamasyon ve apoptoz indüksiyonundaki zararlı etkileri ile açıklanabilir. Ek olarak, hipokampusta bir sinaptik işaretleyici proteinin (sinaptofizin) ekspresyon seviyelerini değerlendirdik. Sinaptofizin, sinaptik plastisitenin bir belirtecidir. Presinaptik terminal için spesifik bir belirteç olarak kullanılır ve seviyesi sinaptik yoğunluk ile ilişkilidir. Sonuçlarımız, sinaptofizin ekspresyonunun D-gal grubunda kontrol grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı derecede düşük olduğunu gösterdi. Bu sonuçlar, hipokampusta D-gal kaynaklı sinaptogenez bozukluğunu gösteren daha önce bildirilen çalışmalarla uyumluydu3. Bununla birlikte, D-gal ile birlikte metformin tedavisi, sinaptofizin ekspresyonunu ve hipokampal doku yapısını ilgili kontrol seviyelerine yakın seviyelere geri getirdi. Kanıtlar, metforminin kemirgen ve insan nörogenezini desteklediğini ve uzamsal bellek oluşumunu geliştirdiğini göstermiştir24,41. Hipokampusta sinaptik yoğunluk ve nörogenezdeki artış, bu gruptaki nörodavranışsal testlerin sonuçlarındaki iyileşme ile el ele gider. Bu, metforminin AMPK/BDNF/PI3K sinyal yolunun aktivasyonunun aracılık ettiği antioksidan, antienflamatuar ve antiapoptotik etkileri ile açıklanabilir.

Sonuçlar

Bulgularımız, yaşlanma ile ilgili çalışmaları yürütmek için sıçan modelinde D-gal kullanımını desteklemektedir. Metforminin yaşlanmanın neden olduğu hafıza bozukluğunu ve bilişsel eksiklikleri azaltabileceği sonucuna vardık. Muhtemel ilgili mekanizmalar, nöro-enflamasyonun iyileştirilmesi, oksidatif stresin azaltılması, anti-apoptotik protein Bcl-2 ekspresyonunun arttırılması ve ayrıca nörojenez ve sinaptik plastisitenin teşvik edilmesidir. Bu mekanizmaların, AMPK/BDNF/PI3K yolunun aktivasyonu yoluyla aracılık edebileceğine inandık. Bildiğimiz kadarıyla bu, metforminin yaşlı farelerde bu yolun aktivasyonu yoluyla kognitif bozukluğu iyileştirme etkisini gösteren ilk çalışmadır. Bu nedenle, bulgularımız metforminin yararlı bir yaşlanma karşıtı ajan olduğunu düşündürmektedir.

Veri kullanılabilirliği

Çevrimiçi yayın tarihi: 12 Ekim 2022

Referanslar

1. Cheng, S.-M. et al. Diosgenin'in d-galaktoz kaynaklı yaşlanan beyindeki anti-apoptotik etkileri. Am. J. Chin. Med. 48(02), 391–406 (2020).

2. Feng, Q., Chen, B., Wang, C., Nie, C. & Li, T. Yaşlanma Karşıtı İlaçlar Olarak Metformin ve Rapamisin Altındaki Mekanizmalar. Authorea Ön Baskıları (2020).

3. Nam, SM ve ark. Askorbik asit, hipokampal nörojenezi artırarak ve hafıza işlevini iyileştirerek d-galaktoz kaynaklı beyin yaşlanmasını hafifletir. Besinler 11(1), 176 (2019).

4. Hou, Y. ve ark. Nörodejeneratif hastalık için bir risk faktörü olarak yaşlanma. Nat. Rahip Neurol. 15(10), 565–581 (2019).

5. Tsai, S.-J. & Yin, M.-C. Protokatekuik asidin d-galaktoz ile tedavi edilen farelerin beynindeki anti-glikatif ve anti-enflamatuar etkileri. Gıda Kimyası Toksikol. 50, 3198–3205 (2012).

6. Zhang, Q., Li, X. & Cui, X. yetişkin farelerin hipokampüsünde d-Galaktoz yaralı nörojenez. Nörol. Res. 27, 552–556 (2005).

7. Fatemi, I. et al. Metforminin farelerde d-galaktoz kaynaklı yaşlanma modeli üzerindeki koruyucu etkisi. İran J. Temel Med. bilim 21(1), 19–25 (2018).

8. Budni, J. et al. D-galaktozun oral uygulaması, sıçanlarda bilişsel bozukluklara ve oksidatif hasara neden olur. Davranış Beyin Res. 302, 35–43 (2015).

9. Rea, IM ve ark. Yaşa ve yaşa bağlı hastalıklar: Enflamasyon tetikleyicilerinin ve sitokinlerin rolü. Ön. immünol. 9, 586–586 (2018).

10. Miranda, M., Morici, JF, Zanoni, MB & Bekinschtein, P. Beyin kaynaklı nörotrofik faktör: Sağlıklı ve patolojik beyinde hafıza için anahtar bir molekül. Ön. Hücre. Nörobilim. 13, 363–363 (2019).

11. Jinpiao, Z. ve ark. Metformin, yaşlı farelerde AMPK-ULK1-bağımlı otofaji yoluyla sevofluran kaynaklı nörobilişsel bozukluğu hafifletir. Beyin Res. Boğa. 157, 18–25 (2020).

12. Martin-Montalvo, A. et al. Metformin, farelerde sağlık süresini ve ömrünü uzatır. Nat. komün. 4, 2192–2192 (2013).

13. Zhang, Q.-Q. et al. Tip 2 diyabetli hastalarda metformin tedavisi ve bilişsel işlev bozukluğu: Bir meta-analiz ve sistematik derleme. Tıp 99(10), e19378 (2020).

14. Zhao, M. ve ark. Metformin uygulaması, sıçanlarda hipobarik hipoksinin neden olduğu hafıza bozulmasını önler. Davranış Beyin Res. 363, 30–37 (2019).

15. Li, J., Deng, J., Sheng, W. & Zuo, Z. Metformin, obez, leptine dirençli farelerde Alzheimer hastalığı benzeri nöropatolojiyi hafifletir. Eczane. biyokimya Davranış 101(4), 564–574 (2012).

16. Ge, XH ve ark. Metformin, sıçanlarda PI3K/Akt1/JNK3 sinyal yolları yoluyla beyni iskemi/reperfüzyon hasarına karşı korur. Fizyol. Davranış 170, 115–123 (2017).

17. Krzysztoforska, K. ve ark. Protokatekuik asit uygulaması, hafızayı etkiler ve oral d-galaktoz kaynaklı hafıza bozukluğu olan bir sıçan modelinde hipokampal ve kortikal serotonin dönüşümünü geri yükler. Davranış Beyin Res. 368, 111896 (2019).

18. Zou, W. ve ark. Hidrojen sülfit, streptozotosin kaynaklı diyabetik sıçanlarda bilişsel işlev bozukluğunu iyileştirir: Hipokampal endoplazmik retikulum stresinde baskılamayı içerir. Oncotarget 8(38), 64203–64216 (2017).

19. Xuan, AG ve ark. Valproik asit, Alzheimer hastalığının transgenik bir fare modelinde hafıza kusurlarını hafifletir ve amiloid birikimini azaltır. Mol. Nörobiyol. 51(1), 300–312 (2015).

20. Walf, AA & Frye, CA Kemirgenlerde kaygıyla ilişkili davranışın bir tahlili olarak yükseltilmiş artı labirentin kullanımı. Nat. protokol 2(2), 322–328.

21. Dhingra, D. & Kumar, V. Yükseltilmiş artı labirent ve Morris su labirenti kullanan farelerde palmatinin hafıza artırıcı aktivitesi. Av. Eczane. bilim

22. Li, F., Gong, Q.-H., Wu, Q., Lu, Y.-F. & Shi, J.-S. Epimedium brevicornum Maxim'den izole edilen icariin, sıçanlarda d-galaktozun neden olduğu öğrenme ve hafıza eksikliklerini azaltır. Eczane. biyokimya Davranış 96(3), 301–305 (2010).

23. Pourmemar, E. et al. İntranazal serebrolizin, farelerde D-galaktoz kaynaklı yaşlanmada öğrenme ve hafıza bozukluklarını azaltır. Tecrübe. Gerontol. 87(Bölüm A), 16–22 (2017).

24. Oliveira, WH ve ark. Metforminin streptozotosin ile indüklenen diyabetik farelerde iltihaplanma ve kısa süreli hafıza üzerindeki etkileri. Beyin Res. 1644, 149–160 (2016).

25. Meyza, KZ, Boguszewski, PM, Nikolaev, E. & Zagrodzka, J. Yaş, Lewis farelerinde korku/kaygı devresinin kaygısını ve tepkiselliğini artırıyor. Davranış Beyin Res. 225(1), 192–200 (2011).

26. Kennedy, BK & Pennypacker, JK Yaşlanmayı modüle eden ilaçlar: Gelecek vaat eden ama zorlu yol. çeviri Res. 163(5), 456–465 (2014).

27. Chogtu, B. ve ark. Wistar sıçanlarında D-galaktozun hafıza ve öğrenme üzerindeki akut ve kronik etkilerinin değerlendirilmesi. klinik Psychopharma‑ macon. Nörobilim. 16(2), 153–160 (2018).

28. El-Mir, MY ve ark. Antidiyabetik ilaç metforminin primer kortikal nöronlarda apoptotik hücre ölümüne karşı nöroprotektif rolü. J. Mol. Nörobilim. 34(1), 77–87 (2008).

29. Ou, Z. ve ark. Metformin tedavisi, APP/PS1 farelerinde amiloid plak birikimini ve hafıza bozukluğunu önler. Beyin Davranışı. Bağışıklık. 69, 351–363 (2018).

30. Tao, L. ve ark. Metforminin NF-κB ve MAPK sinyal yolu ile ilişkili sıçanlarda travmatik beyin hasarı üzerindeki nöroprotektif etkileri. Beyin Res. Boğa. 140, 154–161 (2018).

31. Antero, S. & Kai, K. AMP ile aktive olan protein kinaz (AMPK), entegre bir sinyalleşme ağı yoluyla yaşlanma sürecini kontrol eder. Yaşlanma Arş. Rev. 11(2), 230–241 (2012).

32. Meng, S. ve ark. Metformin, heterotrimerik kompleksin oluşumunu teşvik ederek AMP ile aktive olan protein kinazı aktive eder. J. Biol. kimya 290(6), 3793–3802 (2015).

33. Ghadernezhad, N., Khalaj, L., Pazoki-Toroudi, H., Mirmasoumi, M. & Ashabi, G. Serebral ön beyin iskemisinde metformin ön tedavisi gelişmiş öğrenme ve hafıza: AMPK/BDNF/P70SK sinyal yolunun rolü . eczane Biol. 54(10), 2211–2219 (2016).

34. Potter, WB ve ark. Enerji sensörü AMPK tarafından nöronal plastisitenin metabolik regülasyonu. PLoS BİR 5(2), e8996 (2010).

35. Kauppinen, A., Suuronen, T., Ojala, J., Kaarniranta, K. & Salminen, A. Enflamasyon ve metabolik bozuklukların düzenlenmesinde NF-κB ve SIRT1 arasındaki antagonistik karışma. Hücre Sinyali 25(10), 1939–1948 (2013).

36. Salvado, L. et al. Oleat, AMPK'ye bağlı bir mekanizma yoluyla iskelet kası hücrelerinde doymuş yağ asidi kaynaklı ER stresini, iltihabı ve insülin direncini önler. Diabetologia 56(6), 1372–1382 (2013).

37. Qi, D. et al. Isı şoku proteini 72, serebral iskemi sırasında Akt1 yoluyla c-Jun N-terminal kinaz 3 sinyal yolunu inhibe eder. J. Neurol. bilim 317(1–2), 123–129 (2012).

38. Chen, P., Chen, F. & Zhou, B. D-galaktoz ile tedavi edilen sıçanların karaciğerinde ve beyninde ellagik asidin antioksidan, antienflamatuar ve antiapoptotik etkileri. bilim 8(1), 1465 (2018).

39. D'Amelio, M., Cavallucci, V. & Cecconi, F. Nöronal kaspaz-3 sinyali: Sadece hücre ölümü değil. Hücre Ölüm Farkı. 17(7), 1104–1114.

40. Feng, Y. ve ark. Farelerde klorojenik asit p anti-oksidasyon ve anti-inflamasyon etkileri. eczane Biol. 54(6), 1027–1034 (2016).

41. Shaikh, NH, Deshmukh, VM & Walvekar, MV Yaşlanma sırasında glikovitanolid tedavisine bağlı olarak testiküler morfoloji ve sperm sayısında değişiklik. Asya J. Ecz. klinik Res. 8(3), 72–77 (2015).

42. Grippa, A. et al. Seipin kompleksi Fld1/Ldb16, ER-lipid damlacık temas bölgelerini stabilize eder. J. Hücre Biol. 211(4), 829–844 (2015).

43. Liu, C., Liang, B., Wang, Q., Wu, J. & Zou, M.-H. AMP ile aktive olan protein kinaz alfa1'in aktivasyonu, anti-apoptotik proteinler Bcl-2 ve survivin'in ekspresyonunu artırarak endotelyal hücre apoptozunu hafifletir. J. Biol. kimya 285(20), 15346–15355 (2010).

44. Takeda, M., Takahashi, M. & Matsumoto, S. Enflamasyon, trigeminal çekirdeğe çıkıntı yapan küçük çaplı trigeminal ganglion nöronlarında voltaj kapılı potasyum akımlarının beyin kaynaklı nörotrofik faktör kaynaklı baskılanması interpolatlar / kaudalis geçiş bölgesi . Nörobilim 261, 223–231 (2014).

45. Joseph, J., Cole, G., Head, E. & Ingram, D. Beslenme, beyin yaşlanması ve nörodejenerasyon. J. Neurosci. 29(41), 12795–12801 (2009).

46. ​​Mizisin, AP ve ark. BDNF, galaktozla beslenen sıçanların sinirlerindeki fonksiyonel ve yapısal bozuklukları hafifletir. J. Nöropatol. Tecrübe. Nörol. 56(12), 1290–1301 (1997).

47. Chen, Q. et al. Anti-diyabetik ajanların, nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozukluklarda bilişsel bozukluğu hafifletmek için yeni bir fırsat olarak yeniden kullanılması. Ön. Eczane. 12, 667874 (2021).

48. Bettio, LEB, Rajendran, L. & Gil-Mohapel, J. Hipokampusta yaşlanmanın etkileri ve bilişsel gerileme. Nörobilim. Biobehav 79, 66–86 (2017).

teşekkürler

Yazarlar, gerekli tesislerin çoğunu sağladığı için Menoufa Üniversitesi Tıp Fakültesine teşekkür eder.

Yazar Katkıları

OA çalışmayı tasarladı ve laboratuvar çalışmasını koordine etti, hayvan çalışmalarını gerçekleştirdi, moleküler biyoloji deneylerini yürüttü, verileri analiz etti ve taslağı hazırladı. RMS, histopatoloji ve immünohistokimya çalışmalarını yürüttü ve verileri analiz etti. RAAAE çalışma tasarımına katıldı, hayvan çalışmalarını gerçekleştirdi, biyokimyasal analize katıldı ve el yazmasının hazırlanmasına yardımcı oldu. Tüm yazarlar makalenin son halini onayladı. Yazarlar, tüm verilerin kurum içinde üretildiğini ve kağıt fabrikası kullanılmadığını beyan eder.

Finansman

Açık erişim finansmanı, Te Mısır Bilgi Bankası (EKB) ile işbirliği içinde Te Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) tarafından sağlanmaktadır.

Rekabet eden çıkarlar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Ek Bilgiler

Yazışmalar ve malzeme talepleri OA'ya yöneltilmelidir.

【Daha fazla bilgi için: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】