Bölüm 2:Acteoside, C-Fos İndüksiyonunu ve NF-KB Yolunu Engelleyerek ve ROS Üretimini Azaltarak RANKL Aracılı Osteoklastogenezi Bastırır
Mar 05, 2022
İletişim: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-posta:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
Lütfen buraya tıklayın Bölüm 1'e geri dönün
ActeosideMakrofajlar Tarafından Kemik Rezorpsiyonunu Önler Acteoside ayrıca bir in vitro model sistem tarafından ölçüldüğü üzere doza bağlı bir şekilde RANKL aracılı kemik rezorpsiyonunu da önledi (Şekil 3A). BMM'ler 1 mM asteozid ile inkübe edildiğinde kemik emilmesi önemli ölçüde inhibe edildi (Şekil 3B). 10 mM'lik bir asteozit tedavisi, BMM'ler tarafından RANKL ile indüklenen çukur oluşumunu neredeyse tamamen zayıflattı. Benzer şekilde, asteosid, RANKL ile uyarılan RAW264.7 hücrelerinde kemik emilimini azalttı (Şekil S2A ve B). Acteoside'ın kemik rezorpsiyonunu inhibe etme yeteneği, RANKL stimülasyonuna göre tedavinin zamanlamasına bağlıydı. RANKL stimülasyonundan 4 gün sonra eklenen Acteoside (10 mM), BMM'lerde çukur oluşumunu azaltmazken, oluşan osteoklast sayısını baskıladı (Şekil 3C). Bu farklı sonuç, kısmen, 4 günlük RANKL stimülasyon oluşumundan sonra oluşmuş olan çukur alanından kaynaklanmaktadır (Şekil 3D).
ActeosideErken RANKL Sinyal Yollarını Aşağı-Düzenler
RANKL, osteoklast öncülerinde iyi bilinen 3 MAPK ve NF-kB'nin aktivasyonunu indükler ve bu aktivasyon erken osteoklast farklılaşması için gereklidir. olası mekanizmaları anlamak içinasteositosteoklastogenezi inhibe ettiği için etkisini araştırdık.asteositmakrofajlarda MAPK'ler ve NF-kB aktivasyonu üzerine. BMM'ler ve RAW264.7 hücreleri, 2 saat boyunca 10 mM asteozid ile ön işleme tabi tutuldu ve ardından 30 dakika boyunca 100 ng/ml RANKL ile uyarıldı. MAPK fosforilasyonu, Western blotlama ve immünometrik analiz ile incelendi. RANKL, BMM'lerde (Şekil 4A) ve RAW264.7 hücrelerinde (Şekil 4B) p38, ERK ve JNK'nin fosforilasyonunu indükledi. Acteoside, p-p38, p-ERK ve p-JNK'de RANKL ile indüklenen bu artışları önledi. Bu sonuç, 10 mM asteozid ile ön işlemin bu makrofajlarda fosforile MAPK seviyelerini önemli ölçüde inhibe ettiği immünometrik analiz ile desteklenmiştir (Şekil 4C). RANKL tedavisi, NF-kB'nin DNA bağlanmasını arttırırken, asteozid, NF-kB-DNA bağlanmasının RANKL ile indüklenen aktivasyonunu inhibe etti (Şekil 5A). Bu inhibisyon, BMM'lerde RAW264.7 hücrelerinden daha belirgindi. Acteoside ayrıca BMM'lerde ve RAW264.7 hücrelerinde RANKL ile uyarılan p65 ve IkBa fosforilasyonunu da azalttı (Şekil 5B ve C). 10 mM acteoside eklenmesi, BMM'lerde IkBa'nın hem bozulmasını hem de aktivasyonunu neredeyse tamamen engelledi (Şekil 5B). NF-kB aktivasyonunun ateozid eyleminde rol oynadığını daha da doğrulamak için, kB promotör-lusiferaz yapıları, RAW264.7 hücrelerine geçici olarak transfekte edildi. 100 ng/ml RANKL ile inkübe edilen hücreler, 3-kat daha yüksek kB promotör aktivitesine sahipti ve bu, 10 mM asteosit ile önemli ölçüde azaltıldı (Şekil 5D).
ActeosideRANKL ile Uyarılmış Makrofajlarda İnflamatuar Sitokinlerin Üretimini ve TNF-a, c-Fos ve NFATc1 İfadesini Bastırır TNF-a, IL-1b ve IL-6 osteoklast oluşumunda önemlidir ve RANKL ile uyarılan makrofajlarda NF-kB sinyalinin aracılık ettiği fonksiyon. RANKL, bu sitokinlerin üretimini uyardı ve bu üretim, BMM'lerde 10 mM asteozid ön işlemi ile belirgin şekilde azaldı (Şekil 6A). Benzer şekilde, asteozid, RAW264.7 makrofajlarında IL-6 hariç, RANKL ile indüklenen sitokin üretimini zayıflattı (Şekil S3). Osteoklastogenezde ateosit etkisinin moleküler mekanizmalarını anlamak için, ateozidin TNF-a, c-Fos ve NFATc1 ekspresyonu üzerindeki etkisini daha da inceledik. RANKL, BMM'lerde ve RAW264.7 hücrelerinde bu faktörlerin mRNA ekspresyonunu yukarı regüle etti (Şekil 6B ve C). 10 mM asteozid ile ön-muamele, her ikisinde de bu faktörlerin RANKL ile indüklenen ekspresyonunu önemli ölçüde inhibe etti.
BMM'ler ve RAW264.7 hücreleri. Acteoside ön muamelesi ayrıca RANKL ile uyarılan BMM'lerde c-Fos ve NFATc1'in protein seviyelerini de güçlü bir şekilde azalttı (Şekil 6D). Bu sonuçlar, akteositin, gen ve protein seviyelerinde osteoklast oluşumunun aracılarını indükleyen RANKL'ı aşağı regüle ettiğini göstermektedir.
CISTANCHE ÖZÜ: ACTEOSİT
Acteoside, BMM'lerde Doza Bağlı Bir Şekilde Hücre İçi ROS Üretimini Azaltır
Hücre içi ROS üretiminin RANKL ile uyarılan osteoklastogenez ile korele olduğu bilindiğinden, hücre geçirgen, oksidasyona duyarlı bir boya olan DCFH-DA kullanarak akteozidin RANKL aracılı osteoklast farklılaşması sırasında ROS üretimini inhibe edip etmediğini araştırdık. Akış sitometrisi analizi, BMM'lerde DCF'ye özgü ortalama floresan sinyalinin, tedavi edilmemiş kontrol hücreleriyle karşılaştırıldığında, RANKL ile stimülasyondan sonra görünüşte sağa kaydırıldığını gösterdi (Şekil 7A). Bu kayma, RANKL stimülasyonundan sonra RAW264.7 makrofajlarının gözlemlenmesi durumuna benzerdi (veriler gösterilmemiştir). BMM'lerin asteozit ile tedavi edilmesi, DCF'nin sinyal yoğunluğunu doza bağlı bir şekilde azalttı. 10 mM asteozid ile ön-muamele, osteoklast farklılaşması sırasında üretilen hücre içi ROS seviyelerini, muamele edilmemiş kontrol seviyelerine neredeyse tamamen azaltmıştır (Şekil 7B).
Oral Acteoside Uygulaması Ovariektomili Farelerde Osteoporotik Biyokimyasal Belirteçlerin Değişimini ve Kemik Kaybını Engeller
Akteositin kemik kaybı üzerindeki etkisini araştırmak için ovariektomi ile osteoporotik bir hayvan modeli hazırladık. Deney periyodu sırasında OVX ve Sham fareleri arasında vücut ağırlığında önemli bir fark yoktu (veriler gösterilmemiştir). OVX grubu, Sham grubuna göre önemli ölçüde daha yüksek serum IL-1b ve IL-6 seviyelerine sahipti (Şekil 8). Bu inflamatuar sitokinlerde ovariektomi ile indüklenen artışlar, oral akteozid uygulamasıyla (AC grubu) hafifletildi. ALP, kalsiyum, TRAP5b ve OC gibi kemik döngüsü belirteçlerinin serum seviyeleri OVX grubunda anlamlı olarak arttı. Bu osteoporotik belirteçlerden, OVX farelerinde artan kalsiyum, TRAP5b ve OC seviyeleri, asteozid tedavisi ile görünüşte inhibe edildi, oysa ALP'nin serum seviyesi tedavi tarafından değişmedi. Sağ femur şaftının ortasına ortalama maksimum kırık yükü, OVX grubunda Sham grubuna göre önemli ölçüde daha düşüktü (Şekil 9A). Acteoside tedavisi maksimum kırığı Sham grubununkine yükseltti. Femurun kortikal kemiği kesilip optik mikroskopla gözlemlendiğinde, OVX grubunda gösterilen osteoporotik özellikler AC farelerde neredeyse tamamen ortadan kalkmıştı (Şekil 9B). Acteosidin OVX ile indüklenen osteoporoz modeli üzerindeki etkisini doğrulamak için hafif proksimal femurun trabeküler bölgesindeki BMD ve kemik morfolojik parametreleri mikro-CT ile analiz edildi. Şekil 9C'de gösterildiği gibi, OVX farelerinde femoral trabeküler yapıda bir değişiklik bulundu, oysa bu değişiklik ateozid ile tedavi ile azaldı. Mikro-CT analizinden elde edilen sonuçlar, kemik gücünün bir ölçüsü olan BMD'nin OVX farelerinde önemli ölçüde azaldığını ortaya çıkardı (Şekil 9D). Sham grubuyla karşılaştırıldığında, OVX fareleri ayrıca BV/TV, Tb'de önemli değişiklikler gösterdi. Sp ve Tb. N, ancak Tb.Th'de değil. OVX farelerinin oral ateozid tedavisi, BMD'nin yanı sıra BV/TV ve Tb.N'deki değişikliği önemli ölçüde önledi.
Acteoside Kemik İliği Hücrelerinde Osteoblastogenezi Etkilemez
Akteositin osteoblastik farklılaşma üzerindeki rolü, kemik iliği hücreleri kullanılarak daha da araştırıldı. Şekil 10A'da gösterildiği gibi, DAG tedavisi alizarin kırmızı lekeli hücrelerin sayısını arttırdı ve bu, 10 mM asteozit ön tedavisi ile değiştirilmedi. Mevcut boya miktarı, kombine ateozit veDAG tedavisi mineralizasyonu değiştirmedi (Şekil 10B). Benzer şekilde, Runx2, osterix, BSP ve OC gibi kemiğe özgü belirteçlerin hücre içi kalsiyum içeriğinde (Şekil 10C) ve mRNA seviyelerinde (Şekil 10D) DAG ile indüklenen artışlar, ateosit ile ön tedaviden etkilenmedi.
cistanche acteoside etkisi
Tartışma
Kemik yeniden şekillenmesi, osteoblastlar tarafından kemik oluşumu ve osteoklastlar tarafından kemik emilmesi arasındaki denge tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Uzun süreli ve aşırı kemik rezorpsiyonu, iskelet döngüsünde dengesizliğe neden olarak kemik rezorbsiyonlu hastalıklara neden olur. Acteosidin osteoklastogenez üzerindeki etkilerini araştırmak için iki makrofaj, birincil kültürlenmiş BMM'ler ve RAW264.7 hücreleri kullandık.
Bu hücreler, asteozid varlığında ve yokluğunda osteoklastlara farklılaşmak için RANKL ile uyarıldı. Acteoside'ın osteoklast farklılaşmasını ve oluşumunu engellediğini ilk kez gösterdik. İncelenen konsantrasyonlarda Acteoside'ın kendisi, hem büyüme hem de farklılaşma koşullarında birincil kültürlenmiş makrofajların yaşayabilirliğinde bir azalmaya neden olmadı.
Acteoside tedavisi ayrıca olgun osteoklastların rezorpsiyon aktivitesini de azalttı. Bu sonuçlar, ateozidin makrofajlardan osteoklastik oluşumu ve osteoklast rezorpsiyon aktivitesini baskıladığını göstermektedir. Osteoblastları veya stromal hücreleri içermeyen kültür sistemimizden elde edilen sonuçlar, ayrıca, asteositin osteoklast öncülleri üzerinde doğrudan etki ederek osteoklast oluşumunu önlediğini de göstermektedir.
RANKL, p38, ERK ve JNK dahil olmak üzere MAPK'ları etkinleştirir. Bu üç kinaz erken osteoklastik farklılaşmada rol oynar ve bu nedenle farmakolojik olarak veya baskın-negatif JNK transfeksiyonu ile inhibisyonu, RANKL ile indüklenen osteoklastogenezi baskılar [29]. Sonuçlarımız, ateozid ön işleminin tüm bu kinazları inhibe ettiğini ve MAPK'lerin spesifik olmayan bir aşağı regülasyonunu gösterdiğini ortaya koydu. Bu sonuç, yeşil tee'deki başlıca anti-inflamatuar bileşik olan EGCG'nin, RANKL ile uyarılan BMM'lerde ERK veya p38 aktivasyonunu etkilemeden spesifik olarak JNK aktivasyonunu azalttığına dair önceki rapordan kısmen farklıydı [7]. Bir Çin bitkisinden elde edilen bir anti-inflamatuar bileşik olan Paeonol'ün de RANKL ile uyarılan RAW264.7 hücrelerinde ERK ve p38'i inhibe ettiği, ancak JNK fosforilasyonunu inhibe etmediği bildirilmiştir [30]. Buna karşılık, kemikte yeni bir inhibitör olan silibinin, p38, ERK ve JNK'nin RANKL ile indüklenen aktivasyonunu zayıflattı [31]. Bu bulgular, anti-emici bileşiklerin, RANKL tarafından MAPK aktivasyonu üzerindeki etkilerinin bileşiğe bağlı olduğunu, ancak her üç MAPK'nın da erken osteoklastogenezde yer aldığını göstermektedir.
Acteoside'ın p-JNK'yi zayıflattığı gözlemi göz önüne alındığında
RANKL ile uyarılan BMM'lerdeki seviyeleri, 1 mM'de bile, p38 MAPK veya ERK'den ziyade JNK'nin blokajı, hücrelerde asteosit aracılı anti-osteoklastojenezde daha spesifik bir olay gibi göründü. Aynı konsantrasyondaki asteozid, BMM'lerde osteoklast sayısını azaltmamasına rağmen, akteozit tedavisi ile çukur oluşumunda önemli bir azalma oldu. Ayrıca, JNK'ye özgü bir farmakolojik inhibitör olan SP600125 ile ön tedavinin osteoklastların oluşumunu önemli ölçüde önlediğini bulduk (veriler gösterilmemiştir). Toplu olarak, bu bulgular, JNK aracılı sinyallemenin, RANKL tarafından uyarılan osteoklastogenezin asteozid aracılı baskılanması ile yakından ilişkili olduğunu göstermektedir.
NF-kB sinyali, apoptoz, hücre döngüsü ilerlemesi, hücre yapışması, sitokin üretimi ve makrofajlarda hayatta kalma gibi hücresel olayları düzenler [32]. NF-kB-nakavt farelerde osteopetrozun ortaya çıkmasıyla gösterilen osteoklast gelişimi için NF-kB sinyali de gereklidir [33,34]. Bu nedenle, NF-kB'nin inhibe edilmesinin, anti-emici ajanların osteoklast aktivitesini aşağı regüle etmesi ve osteoporozu tedavi etmesi için etkili bir hedef olduğu öne sürülmektedir. NF-kB alt ailesi proteinlerinin translasyon sonrası modifikasyonu, NF-kB aktivitesini modüle etmede çok önemlidir. Özellikle p65 alt biriminin ve IkB kinazın fosforilasyonu, NF-kB'nin osteoklastogenezi indüklemesi için kritik öneme sahiptir [7]. Mevcut bulgularımız, RANKL stimülasyonunun hem BMM'lerde hem de RAW264.7 hücrelerinde NF-kB'nin DNA bağlama aktivitesini ve p65 alt birimi ile IkBa'nın fosforilasyonunu arttırdığını gösterdi. Acteoside ile ön işlem, RANKL ile indüklenen bu artışları inhibe ederek, aşağı regüle edilmiş NF-kB aktivitesine neden oldu. Sonuç olarak, bu sonuçlar, MAPK'lere ek olarak, NF-kB sinyalinin, osteoklast farklılaşmasını ve RANKL ile uyarılan makrofajlardan oluşumunu inhibe etmede asteositin ana hedefi olduğunu göstermektedir.
NF-kB sinyallemesine ek olarak, c-Fos/c-Jun/NFATc1 yolu osteoklast gelişiminde kilit rol oynar, bu nedenle bu proteinlerden herhangi birinin eksikliği osteoklastogenezi durdurabilir [35,36]. Bu çalışmada, acteoside'ın mRNA ve protein seviyelerinde RANKL ile indüklenen c-Fos ve NFATc1 ekspresyonunu önlediğini bulduk. JNK, RANKL'a yanıt olarak NFATc1 ekspresyonu ve osteoklastogenez için gerekli olan c-Jun'un yukarı akış kinazıdır [29].
JNK/c-Jun yolunun bir önemsiz inhibitör ile bloke edilmesi, RANKL ile indüklenen osteoklast oluşumunu ve c-Fos ve NFATc1 ekspresyonunu azaltmıştır [7]. Sonuçlarımız ve önceki bulgularımız, JNK aracılı sinyallemenin acteoside tarafından inhibe edilmesinin, RANKL aracılı c-Fos ve NFATc1'in önlenmesi ile yakından ilişkili olduğunu göstermektedir.makrofajlarda osteoklast farklılaşmasını baskılayan ekspresyon. Acteoside'ın BMM'ler ve RAW264.7 hücreleri üzerindeki etkilerindeki farklılıklar, en azından kısmen JNK inhibisyonuna duyarlılıktaki farklılıklardan kaynaklanmaktadır.
TNF-a, RANKL-RANK sinyalleşmesinden bağımsız olarak osteoklastogenezi indükleyebilir [37]. IL-1, östrojen eksikliği veya inflamasyonun neden olduğu patolojik kemik yıkımının güçlü bir aracısıdır [7]. Tip I IL-1 reseptörünü veya IL-1 sinyalini bozmak, ovariektomi [38] veya romatoid artritin [39] neden olduğu kemik kaybını tersine çevirebilir. Bu çalışma, ateozidin makrofajlarda TNF-a, IL- 1b ve IL-6 gibi inflamatuar sitokinlerin üretimini azaltma yeteneğini göstermiştir. Acteoside'ın, p38 kinaz ve ERK sinyalini baskılayarak inflamatuar sitokin üretimini inhibe ettiği düşünülmektedir, çünkü makrofajlarda bu sitokinlerin lipopolisakarit ile indüklenen üretimi için ERK1/2, p38 MAPK veya her ikisinin aktivasyonu gereklidir [40,41]. İnflamatuar bir bileşik olan luteolin'in ayrıca p38 MAPK aktivasyonunu inhibe ederek inflamatuar mediatörlerin üretimini baskıladığı rapor edilmiştir [42]. Bu çalışmada ayrıca, sağ femurun orta şaftında restore edilmiş maksimum kırılma kuvveti ve osteoporotik kortikal kemiğin kaybolmasıyla kanıtlandığı gibi, yumurtalıkları alınmış farelerde ateozidin kemik kaybını azalttığını bulduk. Oral asteozit uygulaması, serum IL-1b ve IL-6 seviyelerinde yumurtalıkları alınmış kaynaklı artışları aşağı regüle etti, ancak ALP'yi değil. OVX'de artan serum kalsiyum, TRAP ve OC seviyeleri, ayrıca, asteozid ile oral tedavi ile de inhibe edildi; bu, akteozidin, kemik oluşumu ve ayrıca emilim için spesifik biyobelirteçlerin değişimini azalttığını düşündürdü. Osteoporoz, azaltılmış bir kütle yoğunluğu ve bozulan trabeküler kemik mikromimarisi ile karakterize edildiğinden, OVX ile indüklenen trabeküler kemik kaybı ve morfometrik parametre değişikliği, oral asteosit uygulaması ile önemli ölçüde inhibe edildi. Bu bulgular, asteozidin dengesiz osteoklast aktivasyonunu tersine çevirerek osteoporozu tedavi etmek için bir anti-emici ajan olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, osteoblastlar, yeni kemik oluşumundan sorumlu birincil faktördür. Bu nedenle, kemik oluşumunu arttırmak için osteoblast proliferasyonunu veya farklılaşmasını arttırabilen bir ajana ihtiyaç vardır [30]. Buna karşılık, DAG ile tedavi edilen kemik iliği hücrelerinde akteositin osteoblast farklılaşmasını veya mineralleşmesini etkilemediğini bulduk. Birlikte ele alındığında, sonuçlarımız, ateositin bir anti-rezorpsiyon etkisine sahip olduğunu ancak kemik oluşumunu doğrudan etkilemediğini göstermektedir. Acteoside'ın osteoblastogenezden fayda sağlayıp sağlamadığını netleştirmek için kemiğe özgü parametreleri in vivo ve in vitro analiz eden daha ayrıntılı deneylere ihtiyaç vardır.
Bu çalışma, MAPK'leri ve NF-kB, c-Fos ve NFATc1 gibi çeşitli transkripsiyonel faktörleri baskılayarak, asteositin osteoklast farklılaşması ve kemik emilimi üzerindeki inhibitör etkisini vurgulamaktadır. Veriler, acteosidin bu faydalara sahip olduğu iki olası mekanizmayı önermektedir.
CISTANCHE EKINAKOZİT VE ACTEOSİT Osteoporozu Tedavi Edebilir
Referanslar
1. RhoJ, Takami M, Choi Y (2004) Osteoimmünoloji: bağışıklık ve iskelet sistemlerinin etkileşimleri. Moleküller ve Hücreler 17: 1–9.
2. Del Fattore A, Capannolo M, Rucci N (2010) Kemik ve kemik iliği: aynı organ. Biyokimya Biyofizik Arşivleri 503: 28–34.
3. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC (2011) Osteoporoz: şimdi ve gelecek. Lancet 377: 1276–1287.
4. Sturge J, Caley MP, Waxman J (2011) Prostat kanserinde kemik metastazı: ortaya çıkan terapötik stratejiler. Doğa İncelemeleri Klinik Onkoloji 8: 357–368.
5. Goltzman D (2002) Keşifler, ilaçlar ve iskelet bozuklukları. Doğa İncelemeleri İlaç Keşfi 1: 784-796.
6. Rodan GA, Martin TJ (2002) Kemik hastalıklarına terapötik yaklaşımlar. Bilim 289: 1508–1514.
7. Lee JH, Jin H, Shim HE, Kim HN, Ha H, et al. (2010) Epigallocatechin-3- gallat, c-Fos ekspresyonunu aşağı regüle ederek ve nükleer faktör-kappaB sinyalini baskılayarak osteoklastogenezi inhibe eder. Moleküler Farmakoloji 77: 17– 25.
8. Kim HN, Lee JH, Jin WJ, Ko S, Jung K, et al. (2012) Bir benzamid histon deasetilaz inhibitörü olan MS-275, c-Fos ekspresyonunu aşağı regüle ederek osteoklastogenezi önler ve farelerde kemik kaybını baskılar. Avrupa Farmakoloji Dergisi 691: 69-76.
9. Kim T, Ha H, Shim KS, Cho WK, MaJY (2013) Osteoklast farklılaşmasının inhibisyonunun aracılık ettiği yumurtalıkları alınmış bir sıçan modelinde Yijung-tang'ın anti-osteoporotik etkisi. Etnofarmakoloji Dergisi 146: 83-89.
10. Nakanishi A, Litsuka N, Tsukamoto J (2013) Balık yağı, yumurtalıkları alınmış sıçanlarda M-CSF, PU.1, MITF ve RANK ekspresyonunun azalması yoluyla osteoklastogenezi inhibe ederek kemik emilimini baskılar. Moleküler Tıp Raporları 7: 1896–1903.
11. Bar-Shavit Z (2007) Osteoklast: çok çekirdekli, hematopoietik kökenli, kemik emen bir osteoimmün hücre. Hücresel Biyokimya Dergisi 102: 1130-1139.
12. Takahashi N, Maeda K, Ishihara A, Uehara S, Kobayashi Y (2011) RANKL ve Wnt sinyalleriyle osteoklastogenezin düzenleyici mekanizması. Biyobilimde Sınırlar 16: 21–30.
