Beden Eğitimi Alzheimer Hastalığında Fibrozis Oluşumunu Engeller Böbrek TGFB Sinyal Yollarını Etkiler

edmund.chen@wecistanche.com

GİRİİŞ 

Alzheimer hastalığı (AH), demansın en yaygın şeklidir, ancak sistemik görünümü ancak son yıllarda tartışılmaya başlanmıştır. İlaçlar ve hastalığı modifiye edici tedaviler geliştirmek için büyük çabalar sarf edilmesine rağmen, bugüne kadar küratif prosedürler mevcut değildir [1-3]. Amiloid plakların oluşumu ve amiloid-protein öncüllerinin (APP) anormal işlevi, sadece merkezi sinir sisteminde (MSS) değil, aynı zamanda periferde de hastalığın ilk belirtileri olarak kabul edilir [4]. Amiloid-B'nin (AB) AD'nin patogenezindeki temel rolünü desteklemektedir [5], AB'nin azalmış klirensinin patomekanizmadaki anahtar süreçlerden biri olduğuna işaret etmektedir. AD'de testis [5], pankreas [6] veböbrek[7], çoklu hedefleri olan karmaşık bir sistemik hastalığın gelişimini vurgulamaktadır [8]. Kanıtlanmıştır ki,böbrekAB klirensinde yer alır [9]. Ayrıca, AB'nin serum konsantrasyonu kronik hastalarda önemli ölçüde yükselir.böbrek hastalığı (KBH) hastaları [10, 11]. AB birikimi de gösterilmiştirböbrek[12], bir filtrasyon bozukluğuna yol açar. Uygun filtrasyon, kısmen, patojenezinde ana sitokin olan büyüme faktörü B'nin (TGFB) dönüştürülmesiyle düzenlenir.böbrekinflamasyon ve fibrozis [13] ve AD patogenezinde önemli bir faktör olarak da bilinir [14]. AD'de, TGFB sinyali mikroglial aktivasyonda ve astrosit aracılı nöroproteksiyonda rol oynar [15]. Ek olarak, değişen TGFB ekspresyonu, CNS ve periferik dokulardaki inflamasyonu da etkiler [13, 16].

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK HASTALIĞINI İYİLEŞTİRECEK

TGFB'nin üç izoformu vardır: TGFB1, TGFB2 ve TGFB3 [17]. TGFB1, fetal gelişim, hücre büyümesi ve farklılaşmasının kontrolü, fibrozis ve skar dokusu oluşumu, tümör büyümesi ve immün yanıt gibi çeşitli süreçlerde yer alır [18]. Karaciğer ve karaciğer gibi çeşitli organlarda fibrozis oluşumunda önemli bir sitokindir.böbrek[19]. TGFB1, önce TGFB tip II reseptörüne (TGFRII) bağlanan, daha sonra TGFB reseptör tip I (TGFRI) Ser/Thr kinazı aktive eden dimerler oluşturur ve Smad transkripsiyon faktörlerinin hücre içi sinyalleşme kompleksi oluşumunu başlatır. Kanonik TGFB sinyal yolunda, Smad2/3 transkripsiyon faktörleri fosforile edilir ve Smad4 ile kompleks oluşumundan sonra çekirdeğe yer değiştirir [20]. Farklı kollajenlerin ekspresyonunu indüklediği, hücre proliferasyonunu kontrol ettiği, apoptozu etkilediği [20] ve matriks metalloproteinaz (MMP) ekspresyonunu düzenlediği [21] için TGFB1 aktivasyonundan birkaç gen etkilenebilir. Kanonik olmayan TGFB sinyal yolu, MAPKe'lerin aktivasyonunu fosforilasyon ile başlatır ve bu da daha fazla TGFB ekspresyonunu indükleyebilir [22]. TGFB hedefleri olarak JNK ve p38 kinazlar,böbrekfibrozis ve apoptozu düzenler [23].

Fiziksel aktivitenin insan hastalarda faydalı etkiler gösterdiği gösterilmiştir. Egzersiz, AD'nin tezahürünü düzenleyebilir ve erteleyebilir [24, 25] ve plazmada tau ve AB gibi AD biyobelirteçlerinin azalması da bildirilmiştir [25]. Fiziksel aktivitenin AD insidansını, AD ile ilişkili nöropatolojik yükü ve bilişsel gerilemeyi azalttığı bulunmuştur [26]. Fiziksel aktivitenin AD oluşumu üzerindeki faydaları hakkında çok sayıda çalışma yayınlanmış olmasına rağmen [27], bu olumlu etkilerde yer alan hücre içi mekanizmalar ayrıntılı olarak tartışılmamıştır. Fiziksel egzersiz sırasında tau ve AB aşırı ekspresyonuna sahip genetiği değiştirilmiş farelerin test edildiği birkaç hayvan modeli vardır. Bu modellerde, yüksek fiziksel aktivitenin AD tezahürünü erteleyebildiği kanıtlanmıştır [28, 29]. Ayrıca, bu farelerin uzun süreli eğitiminin AD'deki periferik organ işlev bozuklukları üzerinde olumlu etkileri olduğu gösterilmiştir. Fiziksel aktivite, AD'deki PACAP-BMP karışmasını değiştirdiböbreklerkollajen tip IV ve A birikiminin ekspresyonunu normalleştirerek [30]. Ayrıca, AD testiste Sox9 ekspresyonu eğitiminin koruyucu işlevinin ayrıntılı bir analizi yayınlanmıştır [31]. Aktif eğitim, baskıladığı için TGFB sinyalini de etkiler.böbrekinflamasyon ve ardından fibrozis [32]. Ek olarak, TGFB ve sinyalizasyonu, erişkin kemik remodelinginde bozulan yetişkin kemik remodelingi için önemlidir.böbrekfibrozis [33]. Daha sonra, ana hipotezimiz, uzun süreli fiziksel antrenmanın, TGFB sinyalleme üzerinde sistemik bir etkiye sahip olduğuydu.böbrekAD'de matris üretimi. Bu sinyal yollarındaki değişiklikler azalmaya neden olabilir. böbrekfibrozis ve AD klirensini normalleştirir. Bu nedenle amacımız, TGFB sinyalizasyonu ile beden eğitiminin beden eğitimi üzerindeki yararlı etkileri arasındaki ilişkiyi aydınlatmaktı.böbrekAD'de fifibroz. Deneylerimizde, uzun süreli eğitimin TGFB sinyalizasyonu üzerinde doğrudan etkileri olduğuna dair kanıtlar sunuyoruz.böbreklerAD fareleri. Ayrıca, artan fiziksel egzersizin azaldığını gösteriyoruz.böbrekkanonik ve kanonik olmayan TGFB sinyalizasyonunu normalleştirerek fibroz.

Anahtar Kelimeler:Alzheimer hastalığı, fibrozis, fiziksel aktivite, Smad, böbrek hastalığı; böbrek

CISTANCHE BÖBREK/BÖBREK DİYALİZİNİ İYİLEŞTİRECEK

ARAÇ VE YÖNTEMLER

HayvanAD'nin etkisini izlemek için erkek Alzheimer-transgenik (n=5) (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/J) fareleri kullanıldı. Üç aylık vahşi tip (WT) (transgenik modülasyon ve eğitim yok) (n=5), Alzheimer'ın transgenik fareleri (AD) (n=5) ve eğitimli AD (TAD) (n=5) fareler, ad libitum yiyecek ve su ile 12/12 saatlik aydınlık/karanlık döngüleri altında tutuldu. Egzersiz ve kombine grup için aralıklı koşu bandı koşusu uygulandı. Daha önce egzersiz yapan tüm hayvanlar 2 hafta boyunca motorlu koşu bandına (Columbus Inst., Columbus Ohio, ABD) ve koşu hızına alıştırıldı. Antrenman haftada 4 kez 60 dakika olarak uygulandı. Her antrenman seansı 10 döngü sürdü, her döngü 4 dakika yüksek yoğunluklu ve 2 dakika düşük yoğunluklu koşudan oluşuyordu. Düşük yoğunluklu koşu hızı, deney sırasında 10 m/dk'lık bir hız anlamına gelen kalıcıydı. Yüksek yoğunluklu koşu hızı 16 m/dk ile başlarken, her üç haftada bir 1 m/dk ile 20 m/dk'ya ulaşılana kadar yükseltildi. Kontrol ve Beslenme grubu da koşu bandına alıştı ve ayakta koşu bandında günde 5 dakika orada kaldı [28]. 3-aylık hayvanlarla deneylere başlandı ve 10 aylıkken sonlandırıldı. Çalışma etik yönergelere uygun olarak yürütülmüştür (bu çalışma için etik izin numarası: PEI/001/2105-6/2014, Semmelweis Üniversitesi, Macaristan). Hayvanların (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, ABD) genotiplenmesi için üretici firmanın talimatlarına göre Phire Animal Tissue Direct PCR Kit kullanıldı.

Işık mikroskobik morfolojisiTüm bilişsel testler tamamlandıktan sonra, {{0}} aylık farelere intraperitoneal ketamin enjeksiyonu (Richter, konsantrasyon: 100 mg/ml)/ksilazin (Produlab Pharma, konsantrasyon: 20 mg/ml) ile anestezi uygulandı. ml) 0.1 ml/10 g vücut ağırlığı dozunda kokteyl ve heparinize buz gibi soğuk salin ile transkardiyal perfüze [28] veböbreklerkaldırıldı. Doku örnekleri üç kez PBS içinde yıkandı ve 4:1 mutlak etanol ve yüzde 40 formaldehit karışımı içinde sabitlendi, ardından parafine gömüldü. Masson'un trikrom boyaması için (Sigma-Aldrich, MO, USA) seri kesitler alınarak fibrotik doku görüntülendi. Boyama protokolü, üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirildi. Fotomikrografları çekmek için Olympus Bx53 mikroskobu (Olympus Corporation, Tokyo, Japonya) üzerinde DP74 kamera (Olympus Corporation, Tokyo, Japonya) kullanıldı.

immünohistokimyaüzerinde yapıldıböbrekSmad2, PCNA (çoğalan hücre nükleer antijeni) ve kolajen tip I (Kol. I) [30]'un lokalizasyonunu görselleştirmek için WT, AD fareleri ve TAD farelerinden doku örnekleri.böbrekler4:1 mutlak etanol ve yüzde 40 formaldehit karışımı içinde sabitlendi ve yüzde 70 etanol içinde yıkandı. Gömme seri kesitleri yapıldıktan sonra, deparafinizasyonun ardından PBS (pH 7.4) içinde durulandı. Spesifik olmayan bağlanma bölgeleri, PBS (Amresco LLC, Solon, OH, ABD) içinde çözülmüş yüzde 1 bovin serum albümini ile bloke edildi. Kesitler poliklonal Smad2 (Sigma-Aldrich, MO, ABD) ile 1:500 seyreltmede, PCNA (Cell Signaling, Danvers, MA, ABD) ile 1:800 seyreltmede veya Col. I (Sigma-Aldrich, MO, ABD) gece boyunca 4◦C'de 1:500 seyreltmede antikor. Birincil antikorlar, anti-tavşan Alexa Fluor 555 ikincil antikorunun (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, ABD) eklenmesiyle görselleştirildi, 1:1000'lik bir seyreltmede kullanıldı. Numuneler, nükleer DNA boyaması için DAPI (4,6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür) içeren Vectashield montaj ortamına (Vector Laboratories, Peterborough, İngiltere) yerleştirildi. Anti-tavşan Alexa Fluor 555, negatif kontrol için birincil antikorlar olmadan kullanıldı. Fotomikrograflar, Col. I'in görselleştirilmesi için Olympus Bx53 mikroskobu (Olympus Corporation, Tokyo, Japonya) üzerinde DP74 kamera (Olympus Corporation, Tokyo, Japonya) kullanılarak alındı. Görüntüler cellSense Entry 1.5 yazılımı (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japonya) kullanılarak elde edildi. ) FL floresan sinyal yoğunluklarının karşılaştırılmasına izin vermek için sabit kamera ayarlarıyla. Smad2 ve PCNA tespiti için, 60x yağ daldırma hedefi (NA: 1.42) uygulanarak bir Olympus FV3000 konfokal mikroskobu (Olympus Co. Tokyo, Japonya) kullanıldı. Uyarım için 543 nm lazer çizgileri kullanıldı. Ortalama piksel süresi 4Bs idi. Sıralı tarama modunda 1m optik kalınlıktaki Z görüntü serisi kaydedildi. Alexa555 ve DAPI görüntüleri, Adobe Photoshop sürüm 10.0 yazılımı kullanılarak kaplanmıştır. Sabit ayarlar değiştirilmeden görüntülerin kontrastı eşit olarak artırıldı.

RT-PCR analiziböbreklerWT (n=5), AD (n=5) ve TAD (n=5) mekanik olarak öğütülmüş ve Tri zol (Applied Biosystems, Foster City, CA, ABD) içinde çözülmüştür. ), 4◦C'de 30 dakikalık inkübasyondan sonra toplam RNA izole edildi [30]. RNA, RNaz içermeyen suda toplandı ve –70◦C'de saklandı. Ters transkripsiyon için Yüksek Kapasiteli RT kiti kullanıldı (Applied Biosystems, Foster City, CA, ABD). Uygulanan primer çiftlerinin dizileri ve polimeraz zincir reaksiyonlarının detayları için Tablo 1'e bakınız. Amplifikasyonlar bir termal döngüleyicide (Labnet MultiGene™ 96-kuyu Gradient Termal Döngüleyici; Labnet International, Edison, NJ, ABD) şu şekilde gerçekleştirilmiştir. aşağıdaki: 95◦C, 2 dk, ardından 35 döngü (denatürasyon, 94◦C, 30 s, Tablo 1'de verilen optimize edilmiş sıcaklıklarda 45 s tavlama; uzatma, 72◦C, 90 s) ve ardından 72◦C ,

7 dk. Aktin iç kontrol olarak kullanıldı. PCR ürünleri, etidyum bromür içeren yüzde 1.2'lik bir agaroz jeli kullanılarak analiz edildi ve FluorchemE geldokümetary sistemi (ProteinSimple, CA, ABD) ile belgelendi. PCR ürün sinyallerinin optik yoğunlukları ImageJ 1.40 g ücretsiz yazılımı kullanılarak belirlendi. Optik yoğunluk ölçümlerinden önce her fotomikrografta ayrı kalibrasyonlar yaptık. Daha sonra fotoğrafların büyütülmesini tek tek piksel boyutuna ulaşmak için artırdık ve serbest yöntemle şeritler hassas bir şekilde daire içine alındı ​​ve alanın entegre yoğunluğunu ölçtük. Pikseller, 3 bağımsız operatör tarafından 5 bağımsız deneyde ölçülmüştür. AD ve TAD farelerinde ekspresyon farklılıklarının daha iyi karşılaştırılması için sinyaller ilk olarak WT aktin ile karşılaştırıldı. Şeritlerin altındaki sayılar, her ayrı deneyin (en az 5) kendi aktin sinyali için normalleştirildiği ve ardından istatistiksel farklılıkların hesaplandığı deneylerin istatistiksel analizini gösterir.

Western blot analizi

böbreklerWT (n {{0}}), AD (n=5) ve TAD fareleri (n=5) fizyolojik tuzlu su N içinde yıkandı ve –7{{1'de saklandı. 0}}◦C. Örnekler sıvı nitrojen içinde mekanik olarak öğütülmüş ve proteaz inhibitörleri (Aprotinin) içeren 100 mL homojenizasyon RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay)-tampon (150 mM sodyum klorür; yüzde 1.0 NP40, yüzde 0.5 sodyum deoksikolat; 50 mMTris, pH 8.0) içinde toplanmıştır. 10 g/mL), 5 mM Benzamidin, Leupeptin(10ug/mL), Tripsin inhibitörü (10 g/mL), 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 8 mM NaFlorür, 1 mM Na-ortovanadat). Peletler, 40 A'da (ColeParmer, IL, ABD) 30 saniye boyunca darbeli patlama ile sonike edildi. Westernblot analizleri için toplam hücre lizatları hazırlandı [30]. TGF-1, TGF R1, TGF-R2, Smad2, Smad3, ERK1/2, P-ERK1/2, p38, P-p38,

JNK, PP2A, PP2B, p21, PCNA, Bölünmüş kaspaz3, MMP9, kolajen tip I (Sütun I) ve aktin. Ser/Thr amino asit yan zincirlerinin fosforilasyon seviyesini saptamak için PhosphoSer/Thr saptama kiti (Millipore, Billerica, MA, ABD) kullanıldı. Proteinler nitroselüloz membranlara blot edildi ve Tablo 2'de verilen seyreltme içinde gece boyunca 4◦C'de birincil antikorlara maruz bırakıldı. İnkübasyonun ardından 30 dakika PBST yıkaması yapıldı ve ardından membranlar, peroksidaz konjuge sekonder antikor antitavşan IgG ile kaplandı. :1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, ABD) veya 1:1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, ABD) dilüsyonunda anti-mouse IgG. Tespit için gelişmiş kemilüminesans (Advansta Inc., Menlo Park, CA, ABD) üreticinin talimatlarına göre kullanıldı. Aktin iç kontrol olarak kullanıldı. Sinyaller, bir jel belgesel sisteminde (Fluorchem E, ProteinSimple, CA, ABD) soğutulmuş bir kamera ile yakalandı. Sinyallerin optik yoğunlukları, ImageJ 1.40g ücretsiz yazılımı kullanılarak ölçüldü. Optik yoğunluk ölçümlerinden önce her fotomikrografta ayrı kalibrasyonlar yaptık. Daha sonra fotoğrafların büyütülmesini tek tek piksel boyutuna ulaşmak için artırdık ve serbest yöntemle şeritler hassas bir şekilde daire içine alındı ​​ve alanın entegre yoğunluğunu ölçtük. Pikseller, 3 bağımsız operatör tarafından 5 bağımsız deneyde ölçülmüştür. AD ve TAD'deki ekspresyon farklılıklarının daha iyi karşılaştırılması için sinyaller ilk olarak WT aktin ile karşılaştırıldı. Şeritlerin altındaki sayılar, her ayrı deneyin (en az 5) kendi aktin sinyaline normalleştirildiği ve ardından istatistiksel farklılıkların hesaplandığı deneylerin istatistiksel analizini gösterir.

istatistiksel analizTüm veriler en az beş bağımsız deneyi temsil etmektedir. Tüm şekiller için, aynı WT, AD ve TAD hayvanlarının örnekleri, daha iyi karşılaştırma için iç kontrolleriyle birlikte seçildi. Her figürde aynı hayvan grubuna ait sadece bir adet tanıtıcı fotoğraf kullanılmıştır. İstatistiksel analiz, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'nin HSD post-hoc testi ile yapıldı. Kontrol örnekleriyle karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı farklar için eşik ∗p < 0.05="" ve="" ad="" örnekleri="" #p="">< 0.05="" olarak="" ayarlandı.="" ∗,="" ad="" ve="" tad="" ile="" karşılaştırıldığında="" wt="" farklılıklarını="" gösterir,="" #,="" ad="" ile="" tad="" ile="" karşılaştırıldığında="" farklılıkları="">

SONUÇLAR

Fiziksel aktivite, AD farelerinin böbreklerinde kanonik TGF sinyal yolunu normalleştirdiKanonik TGFB sinyal yolunun elemanlarının ifadesi detaylı olarak incelenmiştir. TGFB1'in protein ve mRNA ifadesi, aşağıdaki durumlarda önemli bir fark göstermedi.böbreklerWT ve AD fareleri karşılaştırıldı, ancak TAD örneklerinde artan ekspresyon bulundu (Şekil 1A, B). TGFRI ekspresyonu AD'de azaldı, ancak fiziksel aktivite bunu normalleştirdi (Şekil 1A, B), TGFBRII ekspresyonu ise AD'de yükseldi.böbreklerAD farelerinin oranı ancak fiziksel aktiviteden sonra azaldı (Şekil 1A, B). Bu gözlemler doğrultusunda AD örneklerinde Smad2 ekspresyonu artmış ve fiziksel olarak sonrasında normalize edilmiştir.aktivite (Şekil 1A, B). Aksine, Smad3'ün ifadesi orta derecede bir düşüş gösterdi.böbreklerTAD numunelerinde telafi edilen AD fareleri (Şekil 1A, B). Smad2 pozitif sinyallerinin yükselmesi korteksin tübüler sisteminde görüldü, ancak kortekste görülmedi.böbrekAD farelerinde cisimcikler. Bu yükselme, TAD hayvanlarının tübüllerinde azaldı (Şekil 1C).

Fiziksel aktiviteden sonra AD farelerinin böbreklerinde kanonik olmayan sinyal yolları değiştirildiERK, p38 ve JNK gibi MAPK'lar, kanonik olmayan TGF sinyalinin önemli bir parçasını oluşturur [22]. ERK'nin mRNA ifadesi değişmediböbreklerancak TAD örneklerinde bir azalma gösterdi (Şekil 2A). Bu kinazın protein ekspresyonu, mRNA ekspresyonu ile korelasyon içinde değildi ve güçlü bir azalma tespit edildi.böbreklerArtan fiziksel aktiviteden sonra orta derecede normalizasyona sahip AD fareleri (Şekil 2B). Aktif, fosforlanmış form, AD örneklerinde ilginç bir şekilde yükselmiş ve benzer bir azalma göstermiştir.böbreklerTAD fareleri (Şekil 2B). p38'in mRNA ifadesi, hiçbir numunede önemli ölçüde değişmedi (Şekil 2A). p38'in protein ifadesi güçlü bir şekilde arttıböbreklerkısmen fiziksel aktivite ile telafi edilen AD fareleri (Şekil 2B). İlginç bir şekilde, daha aktif fosforile edilmiş form, AD örneklerinde bir azalma göstermiştir.

TAD hayvanlarında normalize edildi (Şekil 2B). JNK'nin mRNA ifadesi hem AD hem de TAD numunelerinde azaldı (Şekil 2A). JNK'nin 2 izoformunun protein ekspresyonu western blot analizi ile tespit edildi. JNK1 ve JNK2 için gereksiz fonksiyonlar ortaya konmuştur [34] ve AD örneklerinde 57 kDa izoformunda ve 46 kDa izoformunda önemli bir azalma tespit edilmiştir (Şekil 2B). 57 kDa ve 46 kDa izoformları, fiziksel aktivite sonrası yükselme gösterdi.böbreklerTAD fareleri (Şekil 2B).

AD'de Ser/Thr fosfatazların değiştirilmiş ifadesi ve değiştirilmiş protein fosforilasyonuDeğişen Ser/Thr spesifik protein fosfataz ekspresyonu ve işlevi AD'de gösterilmiştir [35, 36]. PP2B'nin artan bir ifadesini tespit ettik.böbreklerAD farelerin, ancak fiziksel aktivite ile azaltıldı (Şekil 2A, B). Aksine, diğer ana hücresel Ser/Thr spesifik fosfataz, PP2A'nın ifadesi, güçlü bir azalma ile ortaya çıktı.böbreklerAD fareleri (Şekil 2A, B). TAD örneklerinde, PP2A katalitik alt biriminin mRNA ve protein ekspresyonu arttı (Şekil 2A, B). Ser/Thr kalıntıları üzerindeki protein fosforilasyonunun araştırılması, 55 kDa'da güçlü bir sinyal gösterdi.böbreklertau'nun moleküler ağırlığını temsil eden AD fareleri (Şekil 2C). APP'nin bölünmüş C-terminalinin moleküler ağırlığına karşılık gelen 10 kDa'da başka bir yükseltilmiş bant ortaya çıktı (Şekil 2C). Egzersiz sırasında bu proteinlerin her ikisinin fosforilasyonu azaldı (Şekil 2C).

TGF sinyali, hücre döngüsünü ve apoptozu etkilediHücre proliferasyonunun belirteçleri olarak p21 ve PCNA ekspresyon seviyeleri izlendi. TGFB aktivasyonunun p21 ekspresyonunu indüklediği bilinmektedir [37]. Ayrıca, TGFB1 aktivasyonu, değişmiş hücre proliferasyonu ile sonuçlanır [38]. Bu nedenle proliferatif hücre nükleer antijeni (PCNA) ekspresyonu araştırıldı. p21'in protein seviyesi, AD'de önemli ölçüde yükseldi, ancak TAD numunelerinde azaldı (Şekil 3A, B). PCNA farklı yanıt verdi: AD, protein ekspresyonunda bir azalmaya neden olurken, PCNA proteini egzersiz üzerine arttı (Şekil 3A, B). PCNA pozitif hücreleri tanımlamak için immünohistokimya yapıldı ve AD farelerinin böbreklerindeki tübüler hücrelerde immünoreaktivitenin azalmasıyla sonuçlandı. İlginç bir şekilde, TAD farelerinde tübüler hücrelerde normalleştirilmiş bir PCNA pozitifliği gösterildi. PCNA pozitif hücre tespit edilmediböbrekcisimcikler (Şekil 3C). TGF1 sinyali apoptozu etkileyebileceğinden [39], proapoptotik kaspaz3'ün aktif formu araştırıldı. WT numunelerinde hafif bir kaspaz3 mRNA ekspresyonu saptanmasına rağmen, bölünmüş, aktif capase3 gösterilmemiştir. Aksine, AD örneklerinde güçlü bir mRNA ve bölünmüş kaspaz3 ortaya çıkarken, artan fiziksel aktivite proapoptotik proteinin ekspresyonunu azalttı (Şekil 3A, B).

Böbrek fibrozu fiziksel aktivite ile aşağı regüle edildiÖnceki sonuçlar, AD hayvanlarının böbreklerinde olası fibrozu gösterir. İlk olarak, TGFB1 aktivasyonu ile düzenlenebilen MMP9 ekspresyonu araştırıldı [21]. MMP9'un mRNA'sı tüm numunelerde eksprese edildi, ancak sadece TAD farelerinin böbreklerinde önemli bir artış gösterdi. Matriks metalloproteinazın protein ekspresyonu, WT numunelerinde saptama sınırındaydı, ancak AD hayvanlarında önemli bir yükselme gösterdi. Şaşırtıcı bir şekilde, aktif fiziksel egzersiz, MMP9 ekspresyonunu önemli ölçüde arttırdı (Şekil 4A, B). Fibrotik süreçlerin diğer bileşeni, vücutta kollajen tip I'in artan birikimidir.böbrek[40]. WT örneklerinde, düşük mRNA ve kollajen tip I protein ekspresyonu tespit edildi, ancak AD hayvanlarında güçlü bir artış gösterildi. Aktif fiziksel hareket, kolajen tip I'in hem mRNA hem de protein ekspresyonunu normalleştirdi (Şekil 4A, B). Kollajen tip I normalde tübülleri çevreler ve interstisyumda da lokalizedir. Masson trikromunun rutin patohistolojik boyamasında mavi renk, tübüllerin çevresinde görülebilen herhangi bir kolajen türünün varlığını temsil eder.böbrekcisimcikler ve WT böbreklerinde interstisyumda az miktarda bulunur. AD örneklerinde interstisyumda ve bazı tübüllerde güçlü bir birikim görüldü. Fiziksel aktivite sonrası kolajen miktarı azaldı ve interstisyumda birikme saptanmadı (Şekil 4C). Birikmiş kolajeni belirlemek için kolajen tip I immünohistokimyası yapıldı. WT'deböbreklerMasson'un boyamasına benzer şekilde, tübüllerin etrafında sinyaller belirdi,böbrekcisimcikler ve zayıf bir interstisyel sinyal de görüldü. AD farelerinden alınan numunelerde, interstisyumda ve tübüler sistem çevresinde güçlü bir immünopozitiflik gösterilmiştir. Şaşırtıcı bir şekilde, interstisyel dokuda bir azalma görüldü, ancak TAD hayvanlarında tübül epitel hücrelerinin apikal kısmında önemli bir sinyal ortaya çıktı (Şekil 4D).

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK AĞRILARINI İYİLEŞTİRECEK

TARTIŞMA

AD oluşum süreci MSS'de geniş olarak tartışılsa da, değişiklikler ve olası periferik eşlik eden patolojiler ayrıntılı olarak araştırılmamıştır. En büyük hipotezimiz şuydu:böbrekfibrozis, AD tezahürünü ve A birikimini etkileyen olası bir süreçtir. Öte yandan, uzun süreli beden eğitimi, sistemik değişiklik TGFB sinyal yolu ile bir korelasyona sahip olabilecek AD üzerinde olumlu bir etkiye sahiptir. Periferik organların AD patogenezinde rol oynadığı gösterilmiştir, diğerleri arasında olduğu gibi, AD hastalarında değişmiş bir metabolik enzim aktivitesi tespit edilmiştir [41] ve Pankreasta [42] ve birikme gösterilmiştir.böbrek[30]. Çeşitli organları etkileyen bu sistemik hastalık, AD'nin erken teşhisini ve tedavi edilebilirliğini zorlaştırmaktadır. AD'nin CNS'den temizlenmesi kısmen astrositler ve mikroglia tarafından düzenlenir, ancak kan-beyin bariyerini geçtikten sonra bir kısmı periferde çıkarılabilir [43]. Bu periferik klirens, plazmadaki AD konsantrasyonunu azaltmak için olası ilaç hedeflerinden biri olarak kabul edilir [44]. Böbreklerin proksimal tübülleri tarafından küçük moleküllerin salgılanması hayati bir homeostatik işlevi temsil eder ve toksinlerin veya proteinlerin idrara salgılanmasında yer alabilir [45]. AD'nin idrarda salgılandığı ve bunamanın tanısal bir işareti olabileceği gösterilmiştir [46]; ek olarak, yaşlılarda böbrek fonksiyon bozukluğu demans riskini artırabilir [47] ve KBH hastalarında serum AD düzeylerinin anlamlı olarak daha yüksek olduğu bulunmuştur [10]. Bu veriler olası bir işlevi gösterir.böbrekçevredeki AD açıklığında. Fiziksel egzersizin uygun glomerüler morfolojiyi koruduğu ve tübüler sekresyonu koruduğu için böbrek fonksiyonu üzerinde olumlu etkileri olduğu gösterilmiştir [48]. Artan fiziksel aktivitenin böbreklerde TGFB sinyalizasyonunu azalttığı gösterilmiştir ve fiziksel egzersiz iyi bir antifibrotik strateji olabilir [32]. Toplamda, TGF aktivasyonu, çevredeki AD açıklığını koruyabilen fiziksel aktivite ile ilgili sinyalleşme ile doğrudan bir bağlantıya sahip olabilir. Bu nedenle, WT, AD ve uzun süreli eğitimli AD farelerinde TGFB sinyal yolunu araştırdık.

Mevcut çalışmada, AD farelerinin böbreklerinde TGFFRII ekspresyonunun arttığı ve TAD örneklerinde kısmen normalleştiği gösterilmiştir. Yükselmiş TGFBRII, AD'de TGFB sinyal yolağının artmış aktivasyonunu gösterir [49]. Azalan TGF RI ekspresyonu, TGF'nin TGFBRII'ye daha yüksek afinite ile bağlandığını ve AD'de homodimer oluşumunun muhtemel olduğunu göstermiştir [50]. Bu sonuçlara benzer şekilde, makrofajlarda TGFFRII homodimer oluşumu gösterilmiştir.böbrekfibrozis [51]. Öte yandan, uzun süreli eğitim, yüksek TGFB1 ekspresyonu ile stabilize edilebilen bir heterodimer reseptör kompleksi oluşumunu düşündüren TGFB reseptörlerinin ekspresyonunu eşitledi [50]. Ayrıca, Smad2 ve Smad3 ifadesi AD'de tartışmalı bir şekilde değiştirildi. Smad2'nin klasik olarak TGF reseptörleri tarafından aktive edildiği ve çekirdeğe yer değiştirdiği bilinirken, Smad3'ün ayrı bir işlevi vardır [52]. Smad3 aşağı regülasyonunun fibrozu etkilediği yayınlanmıştır [53]. TAD örneklerinde Smad transkripsiyon faktörlerinin normalleştirilmiş ifadesi şunları gösterir:

bu fiziksel aktivite, TGFB sinyalini yeniden dengeledi ve patobiyokimyasal aktivasyonunu azalttı. p38MAPK, JNK ve ERK içeren mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) ailesi, TGF sinyalizasyonu ile etkileşime sahiptir [54]. Böbrek fibrozunu indükleyen tübüler epitel hücrelerinde p38'in yüksek ekspresyonu gösterilmiştir ve bunun bloke edilmesi fibroz tedavisinin iyi bir hedefi olabilir [55]. AD farelerinde, fifibroz oluşumunu daha da destekleyen artan p38 protein ekspresyonu tespit edildi. Aksine, AD böbreklerinde p38 fosforilasyonu azalmıştır, bu da p38 MAPK'nın fibroz evresine bağlı aktivasyonunu gösterir [56]. Öte yandan, artan fiziksel aktivite, böbrekte bulunan hem p38'i hem de fosforile edilmiş formu kısmen normalleştirdi ve bu, p38-aracılı fibroz oluşumunda eğitimin dengeleyici bir işlevi olduğunu düşündürdü. p38 kinaza benzer şekilde, JNK'nin inhibisyonu fibroz oluşumunu baskılayabilir [57]. JNK aktivasyonunun böbreğin farklı bölümlerinde glomerüler filtrasyon ve interstisyel fibrotik süreçler gibi çeşitli işlevleri vardır [58]. Toplam böbrek lizatından elde edilen deneylerimizde protein özütü, AD gelişimi sırasında JNK'nin, AD'den etkilenen böbreklerde hücreye özgü izotip aktivasyonu ile tübüler ve glomerüler kısımlarda muhtemelen farklı bir işleve sahip olduğunu gösterir. TGFB1'in neden olduğu MMP aktivasyonu, p38 fonksiyonuna [59] bağlı olarak rapor edilirken, ERK aktivitesinin inhibisyonu interstisyel fibrozu azalttı [60]. Bu veriler, AD'deki böbrek fibrozisinin patogenezinde MAPK ailesi üyelerinin farklı işlevlerini güçlü bir şekilde desteklemektedir. AD farelerinin böbreklerinde düşük bir ERK ekspresyonu tespit ettik, bununla birlikte fosforile edilmiş aktif formunun miktarı önemli ölçüde yükseldi. Uzun süreli fiziksel eğitime katılan farelerin deney grubunda, normalize ERK ve fosfo-ERK ekspresyonu ve üzerinde faydalı bir etki tespit ettik.böbrek fonksiyonu.Bu gözlemler, AD'deki böbreklerin fibrotik dönüşümünde ERK'nin katkısını destekler ve fiziksel eğitimin AD farelerinin böbrek morfolojisi ve işlevi üzerinde şaşırtıcı derecede belirgin bir pozitif etkisini gösterir. Son zamanlarda, laboratuvarımız, gelişmekte olan kıkırdak hücrelerinin mekanik transdüksiyonunda ERK'nin katılımını kanıtlamıştır [61].

TGFBRII, Smad, JNK, p38 ve ERK fosforilasyonu, Ser/Thr fosfatazların olası bir aktivasyonunu öneren Ser kalıntılarında [62] meydana gelir. PP2B düzensizliği AD'de gösterilmiştir [35, 63]. Öte yandan, PP2B, tau'yu çeşitli fosforilasyon bölgelerinde defosforile edebilmesine rağmen, beyinde tau'nun fosforilasyonunu önemli ölçüde düzenlemez [35]. Diğer majör hücresel Ser/Thr fosfataz, PP2A da Ser kalıntıları üzerindeki proteinleri fosforile eder ve aktivitesi AD'de azalır ve PP2B'den daha yüksek afinite ile tau fosforilasyonunu düzenleyebilir [64]. CNS'ye benzer şekilde, AD farelerinin böbreklerinde azalmış bir PP2A, ancak artmış bir PP2B ekspresyonu gösterilmiştir. PP2A ekspresyonunun azalmasının bir sonucu olarak Ser kalıntıları üzerinde artan fosforilasyon, AD farelerinin böbreklerinde tahmin edildiği gibi tau proteininin veya APP'nin hiperfosforilasyonunu indükleyebilir. JNK ve p38'in fosforilasyonu doğrudan PP2B [65] tarafından düzenlenebilir, bu nedenle bu kinazların AD'deki azalan aktivasyonu, yüksek PP2B ekspresyonunun sonucu olabilir. Öte yandan, ERK kinaz fosforilasyonu baskın olarak PP2A aktivasyonu yoluyla gerçekleşebilir [66], ardından PP2A'nın azaltılmış ifadesi AD'de artmış bir ERK fosforilasyonuna yol açabilir. AD farelerinin uzun süreli eğitimi, PP2B ve PP2A ekspresyonunun normalleşmesine doğru hareket etti ve bu da MAPK enzimlerinin Ser/Thr fosforilasyon seviyesini normale yaklaştırıyor gibi görünüyordu. Mekanik yük, farklılaşan kondrositlerde de PP2B ve PP2A'nın katılımıyla tersinir fosforilasyon üzerinde dengeleyici bir etki yaptı [61].

Kanonik olmayan TGFB sinyal yolunun aktivasyonu, hücre çoğalmasını ve apoptozu düzenler. Sonuçlarımıza benzer şekilde, böbreğin tübüler sisteminde p21 pozitif hücreler gösterilmiştir [67] ve ayrıca AD'de artmış ekspresyonlarını da gösterdik. Bu yükselme, AD'de MAPK aktivasyonunun aracılık ettiği bir hücre döngüsü durması olduğunu gösterirken, p21, PCNA ile etkileşime girer ve hücre döngüsünün S-fazındaki hücreleri bloke eder [68]. AD farelerinin tübüler sisteminde p21 aktivasyonu ve muhtemelen buna bağlı olarak güçlü bir PCNA azalması tespit ettik. Önceki bulgularımıza benzer şekilde, artan fiziksel aktivite, tübüler sistem hücrelerindeki hücre döngüsünü normalleştirdi. Öte yandan, p21 ayrıca kaspaz aktivasyonu ve JNK ile bir bağlantıya sahiptir, ERK ayrıca kaspaz3 bölünmesini indükler [69, 70]. Kaspaz3 aktivasyonunun, A birikimi ve kaspaz aracılı ABPP bölünmesinin neden olduğu sinoptik bozukluklar yoluyla AD patogenezinde önemli bir rol oynadığı belirlenmiştir [71]. AD farelerinin böbreklerinde, yüksek apoptozu ve tübüler ve glomerüler hücrelerin fonksiyon kaybını gösteren yüksek bölünmüş kaspaz 3 ifadeleri saptadık. Bu süreçler, daha önce gösterdiğimiz gibi böbrek interstisyumunda AD birikimini teşvik edebilir [30].

CISTANCH BÖBREK/BÖBREK ENFEKSİYONUNU İYİLEŞTİRECEK

TGFB aracılı sinyalizasyonun, interstisyumda kollajen ekspresyonunu ve birikimini arttırdığı gösterilmiştir [40]. AD farelerinin böbreklerindeki bu sonuçlara göre, interstisyumda biriken önemli ölçüde yüksek kollajen tip I ekspresyonu gösterdik. Bu veriler, AD'deki değiştirilmiş kanonik ve kanonik olmayan TGFB sinyalizasyonunun böbrek fifibrozunda çok önemli bir rol oynadığını kuvvetle önerir [18, 72]. Aksine, uzun süreli eğitim, TGFB sinyalizasyonunu yeniden dengeleyerek en azından kısmen interstisyel kollajen tip I lokalizasyonunu azalttı. Azalan fifibrozis AD klirensini indükleyebilir veböbrekDaha önce gösterdiğimiz gibi birikim [30]. Bu hipotez, fiziksel eğitim olarak bulgularımız tarafından desteklendi, tübüler epitel hücrelerinde kollajen tip I'in birikmesiyle sonuçlandı, bu da TAD farelerinin böbreklerinde kollajen bozulma sürecini ima etti. MMP9, böbrekte TGFB sinyali ile aktive edilebilir [73] ve matris fibrillerinin bozulması ile sonuçlanır. MMP'lerin fibrozda hem inhibitör hem de uyarıcı rolleri olmasına rağmen, MMP9, TGFB aktivasyonunun aracılık ettiği profibrotik bir ajan olarak kabul edilir [74]. Aksine, MMP9'un böbrekte kollajen tip I yıkımında düzenleyici bir rol oynayabileceği gösterilmiştir [75]. AD farelerinin böbreklerinde, TGFB sinyalleme kaskadı tarafından kontrol edilen fibrotik süreçteki işlevini düşündüren yüksek bir MMP9 ekspresyonu gösterdik. Öte yandan, uzun süreli eğitimden sonra, kollajen tip I'in ekspresyonundaki ve tübüler görünümündeki güçlü azalmanın nedeni olabilecek daha fazla yükselme ölçüldü. Mekanik uyarıda, laboratuvarımız, primer kondrojenik kültürlerde MMP9 ekspresyonunun yükseldiğini göstermiştir. [76] ve mekanik kompresyonun MMP9 ekspresyonunu arttırdığı skar dokusu oluşumunda benzer sonuçlar yayınlanmıştır [77]. Akut böbrek hasarında, MMP9'un yükselmesi anti-apoptotik fonksiyona sahiptir ve proksimal tübüllerin S3 kısmını korur [78]. Ayrıca, akciğerlerde kesme stresi ile aktive olan TGFB sinyal yolu ve azalmış fifibroz oluşumu da tespit edilmiştir [79]. Ayrıca, akciğer epitel hücrelerindeki mekanik stres, MMP9'un aktivasyonu yoluyla ECM'nin yeniden şekillenmesini indükledi ve kollajen ekspresyonunu değiştirdi [80]. Bu nedenle, artan fiziksel aktivitenin, TGFB sinyalizasyonunu sadece lokal olarak değil aynı zamanda sistemik olarak da modüle ederek matris üretiminin yeniden modellenmesini indüklediği sonucuna varabiliriz. Çalışmamızın sınırlamaları, transgenik farelerin daha hızlı AD oluşumuna sahip olabilmesi ve böbrek fonksiyonunun ayrıntılı olarak araştırılmamasıdır. AD farelerinin fibrotik böbreklerinde sadece TGFB'nin neden olduğu matris üretiminin değiştiği veya sodyum ve potasyum dengesinin düzenlenmesinin ve AD klirensinin de uzun süreli eğitimde yer aldığı ayrıca araştırılmalıdır. Ek olarak, AD'de uzun süreli fiziksel antrenmanın böbrek fibrozunun azalmasına yol açtığını geliştirmek için idrarda tip I kolajen birikimi de takip edilebilir. Öte yandan, uzun süreli fiziksel antrenmanın kanonik ve kanonik olmayan TGFB sinyallemesi üzerinde sistemik bir etkiye sahip olduğunu in vivo kanıtladık. İn vivo olarak, fiziksel antrenmanın, hastalığın tezahürü üzerinde olumlu bir etkisi olan AD'de böbrek fifibrozu oluşumunu azalttığını gösterdik. Sonuç olarak, verilerimiz, TGFB sinyal yollarının aktivasyonunun, AD farelerinin böbreklerinin fibrotik dönüşümünde nedensel bir rol oynadığını göstermektedir. Bu durumda olumlu değişiklikler elde etmek için çok basit bir yaklaşım olarak, kanonik ve kanonik olmayan TGFB sinyal yollarının üyelerinin ekspresyonunu ve fosforilasyonunu normalleştirebildiği ve böbrek fifibrozunun iyileşmesiyle sonuçlandığı için uzun süreli fiziksel eğitim öneriyoruz. Ayrıca, fifibrozu inhibe eden fiziksel egzersiz, böbrek fonksiyonunu yeniden dengeleyebilir ve AD'de sistemik AD'nin yüksek klirensini indükleyebilir.