Terahertz Diyabetik ve Diyabetik Olmayan Kan Plazma ve Böbrek Doku Peletlerinin Termal Ayrışma Gaz Ürünlerinin Yüksek Çözünürlüklü Spektroskopisi
Mar 28, 2022
İletişim:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Soyut
Önem:Tıbbi teşhisteki modern trendlerden biri, hastalığın spesifik özellikleri olabilen metabolitlerin belirlenmesine izin veren bir yaklaşım olan metabolomiklere dayanmaktadır. Yüksek çözünürlüklü gaz spektroskopisi, biyolojik kökenli numunelerin gaz metabolit içeriğinin araştırılmasına olanak tanır. Pelet olarak hazırlanan diyabetik ve diyabetik olmayan biyolojik örneklerin terahertz (THz) yüksek çözünürlüklü spektroskopisi ile incelenmesine yönelik bir yöntemin detaylandırılmasını sunuyoruz.
Amaç:Çalışmanın ana fikri, diyabetik ve diyabetik olmayan kurutulmuş ürünlerin termal bozunma gaz ürünlerinin içeriğini incelemektir.kan plazmasıveböbrek dokularıTHz yüksek çözünürlüklü spektroskopi yöntemiyle diyabeti karakterize eden gaz belirteçleri setini ortaya çıkarmak için.
Yaklaşmak:Diyabetik ve diyabetik olmayanları incelemek için bir yaklaşım sunuyoruz.kan plazması(insan ve fareler) veböbrek dokuları(sıçanlar), THz frekans aralığının durağan olmayan etkisine dayalı yüksek çözünürlüklü spektroskopi kullanarak. Kan ve böbrek dokusu örneklerinin pelet olarak hazırlanması ve örneklerin buharlaştırılması yöntemleri geliştirilmiştir.
Sonuçlar:Kandan hazırlanan peletlerin ısıtılması sırasında buharların rotasyonel absorpsiyon spektrumlarının ölçümleri veböbrek dokusu118-178 GHz frekans aralığında gerçekleştirilmiştir. Numune buharlarının spektrumlarında görünen absorpsiyon çizgileri tespit edildi ve tanımlandı. Termal bozunma ürünlerinin moleküler içerikleri diyabetik olmayan ve diyabetik numuneler için farklılık göstermiştir; örneğin, ana belirteç, diyabetik kanda (insan ve sıçanlar) ve diyabetik kanda görünen asetondur.böbrek dokusu.
Sonuçlar: Makalemiz, klinik tıp için teşhis ve hastalıkların prognozu için biyolojik numunelerin metabolit içeriğini belirleme potansiyelini göstermektedir. © Yazarlar. SPIE tarafından Creative Commons Atıf 4.0 Aktarılmamış Lisansı altında yayınlanmıştır. Bu çalışmanın tamamen veya kısmen dağıtılması veya çoğaltılması, DOI'si dahil olmak üzere orijinal yayına tam olarak atıfta bulunulmasını gerektirir. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Anahtar Kelimeler: yüksek çözünürlüklü terahertz spektroskopisi; termal ayrışma; doku;kan plazması; diyabet; liyofilizasyon.
Anahtar Kelimeler:yüksek çözünürlüklü terahertz spektroskopisi; termal ayrışma; kan plazması; diyabet; liyofilizasyon, böbrek dokusu.
1. Giriş
Günümüzde sosyal açıdan önemli hastalıkların (diyabet, kanser hastalıkları vb.) erken evresini de içeren teşhis sorunu, dünyadaki bilim gruplarının büyük ilgisini çekmektedir.Çeşitli hastalıkların tanı ve tedavisinde yeni olanaklar açan yeni yaklaşımlardan biri de metabolomiktir. Metabolomik, biyolojik bir sistemin (hücre, organlar veya tüm organizma) nihai ve ara metabolik ürünlerini araştıran bir bilim alanıdır. Metabolomikler, hastalığa özgü özellikler olabilen ve bir hastalığın tanı ve prognozunda büyük rol oynayabilecek metabolitleri ortaya çıkarabilir. İnsan organizmasındaki son ve ara metabolik ürünleri içeren ve hastalık ve patolojilerle ilişkili metabolitlerin ortaya çıkarılmasında faydalı olan ortamlar, nefes, kan, idrar, tükürük vb.
İnsanların yaşam kalitesini tehdit eden sosyal açıdan önemli hastalıklardan biri de şeker hastalığıdır. Diabetes mellitus tip 2 önceden bir orta yaş hastalığıydı, ancak şimdi yetişkinlerde, gençlerde ve çocuklarda teşhis ediliyor. 18 yaşından büyük diyabet hastalarının yanı sıra 1 ila 13 yaş arası çocukların kan ve idrar örneklerinin metabolomik incelemelerinin sonuçları İnsan Metabolom Veritabanında (HMDB) sunulmaktadır.1 Esas olarak kan (izomerler dahil 21 kimyasal madde), idrar ( izomerler dahil 30 kimyasal madde) ve beyin omurilik sıvısı (1 kimyasal madde) incelenmiştir. Örneğin, (R)-3-hidroksibütirik asit, her üç sıvı türünde de tespit edildi. Her iki sıvıda da (kan ve idrar) bazı maddeler (asetoasetik asit, D-fruktoz ve D-glukoz) tespit edildi. Diyabetin daha karakteristik özelliği (aseton, CH3COCH3) sadece idrarda mevcuttu. HMDB'de sunulan araştırmaların sonuçları olan sıvı numuneler, çeşitli yöntemlerle araştırılmıştır: gaz kromatografisi;2 kütle spektrometrili gaz kromatografisi;3,4 kütle spektrometrili gaz-sıvı kromatografisi;5 yüksek çözünürlüklü nükleer spektroskopi proton manyetik rezonans;6 ve diyabet hastasının durumunu izlemek için özel cihazlar kullanan yöntemler, sürekli glikoz izleme sistemi.7
Kronik böbrek hastalığının gelişimi, diabetes mellitusun önemli bir komplikasyonudur. Taramada genel yaklaşım glikolize albüminin belirlenmesi olmasına rağmen, böbrek hasarı idrar albümininde klinik olarak anlamlı değişiklikler ortaya çıkmadan çok önce başlayabilir. Kronik böbrek hastalığının multifaktöriyel patogenezi göz önüne alındığında, tarama için çeşitli belirteçler düşünülmüştür.8,9 Bununla birlikte, böbrek biyopsisi olmadan tanısal değerleri şüpheli görünmektedir.
Spektroskopik yaklaşım, tıbbi teşhis için kullanılabilecek biyolojik örneklerin içeriği hakkında bilgi sağlayabilir. Terahertz (THz) frekans aralığı, canlı organizmaların gazlarını, sıvılarını ve dokularını incelemek için çok önemlidir. THz zaman alanı spektroskopisi, THz reflektometrisi ve biyoloji ve tıp için THz görüntüleme dahil olmak üzere THz frekans aralığı yöntemlerinin uygulamalarına ayrılmış bazı incelemeler vardır.10
THz zaman alan spektroskopisi, absorpsiyon katsayısının veya kırılma indeksinin, numunelerde veya bunların çeşitli konsantrasyonlarında bazı biyomoleküllerin (proteinler, şekerler, vb.) varlığına karşılık gelen bazı spektral özelliklere sahip olduğu spektrumların saptanmasına izin verir.11
Moleküler absorpsiyon spektroskopisi ve özellikle THz gaz spektroskopisi, çeşitli kökenlerden çok bileşenli gaz karışımlarının araştırılması için çok umut verici bir yaklaşımdır.12 Sıvı ve katı haldeki numuneler, buharlaştırma veya termal ayrışma yoluyla incelenebilir. Gaz numuneleri yoluyla radyasyon iletiminde gerçekleştirilen absorpsiyon spektrumlarındaki spektral çizgileri ile sosyal açıdan önemli hastalıkların (diyabet, kanser vb.) metabolit-belirteçleri ortaya çıkarılabilir.
Diyabet hastalarından (12 kişi) alınan ekshalasyon nefesi ve idrar numunelerindeki aseton seviyesi, etkili radyasyonun faz kayması anahtarlamalı bir terahertz aralığı spektrometresi kullanılarak ölçüldü. Almazov Ulusal Tıbbi Araştırma Merkezi ile işbirliği içinde deneyler yapıldı. Ölçümler, merkezi frekansları 150.537 ve 151.647 GHz olan aseton absorpsiyon hatlarında gerçekleştirilmiştir. Ölçümler ısıtılmadan gerçekleştirilmiştir. Diyabet hastalarının ekshalasyon nefesi ve idrar örneklerinin eş zamanlı analizi, idrardaki aseton seviyesinin nefes verilen nefestekinden çok daha yüksek olduğunu, bazı durumlarda daha yüksek olduğunu ortaya çıkardı.13,14
THz yüksek çözünürlüklü gaz spektroskopisi araştırmalarının sonuçlarıkan plazmasıhasta ve sıçanların (şartlı olarak sağlıklı ve diyabetli) yanı sıra sıçanlarınböbrek dokusu(sağlıklı ve şeker hastalığı olan) kurutularak pelet haline getirilerek sunulmaktadır. Dokular veyakan plazmasıHerhangi bir hazırlık yapılmadan canlı organizmaların varlığı, numune alındıktan hemen sonra araştırılmalıdır. Pelet olarak hazırlama, kan örneklemesi veya böbrek biyopsisinden sonra yeterince uzun bir süre sonra incelemeye izin verir.
2 Deney ve Metodoloji
2.1 Kan Plazma Peletleri ve Böbrek Peletleri Hazırlama Yöntemi
Almazov Ulusal Tıbbi Araştırma Merkezi Endokrinoloji Departmanında tip 2 diyabetli hastalardan ve şartlı olarak sağlıklı katılımcılardan venöz kan toplandı; merkez diyabet hastaları için tıbbi bakım sağlar. Üç hasta ve iki katılımcı erkekti, yaşları aynıydı (39-43 yaşında). Bu araştırmada kullanılan tüm deney protokolleri, hastalar ve katılımcılar ve Tıp Merkezi Kullanım Komisyonu tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Antikoagülan K3EDTA (Vacutest Kima, İtalya) içeren bir tüpte 8 ila 12 saat aç kaldıktan sonra sabah venöz kan alındı. Biyokimyasal parametrelerin analizi için plazma, bir laboratuvar santrifüjünde (Eppendorf 5702R, Almanya) ±4 derece sıcaklıkta 3000 rpm'de 15 dakika santrifüj edilerek elde edildi. biyokimyasal parametrelerin değerlerikan plazmasınumuneler ve referans aralıkları Tablo 1'de sunulmuştur (tam kanda glikolize hemoglobin düzeyi elde edilmiştir). Tablo 1 diyabetli bir hastanın numunelerindeki glukoz, trigliserit ve glikolize hemoglobin konsantrasyonunun sırasıyla 1.5, 2 ve 2.3 kat arttığını göstermektedir.
Çalışma ayrıca, Deneysel Tıp Enstitüsü Almazov Ulusal Tıbbi Araştırma Merkezi Hayvan Bakım ve Kullanım Komisyonu tarafından onaylanan deneysel çalışmaların protokolüne göre, 8 haftalık ve 180 ila 200 g ağırlığındaki Wistar erkek sıçanlarla gerçekleştirildi. Deney grubundaki hayvanlarda glikoz seviyesi, glikoz yüklemesinden 120 dakika sonra 21 mmol ∕ l idi. Kontrol grubu olarak intakt sıçanlar kullanıldı. Hayvanlara ötenazi uygulanmadan önce vena kava inferiordan venöz kan alındı. Ayrıca böbrek alındı. Kan örnekleri antikoagülan içeren tüplere alındı.
Test örnekleri -80 derecelik bir sıcaklıkta donduruldu (düşük sıcaklıklı buzdolabı DW-86L388A, Haier, Çin). Daha sonra Vaco 2 (ZirBus, Almanya) −50 derece sıcaklıkta ve 3 Pa basınçta dondurularak kurutularak liyofilize edildi. Yok edilmek. Kurutulmuş örnekler biyolojik kristallerden oluşan bir süngerdi. Sünger metal bir spatula ile tahrip edildi ve onlarca mikrometre boyutunda kristaller halinde ezildi. Numunelerin bileşimindeki proteinlerin öğütülmesi, istenmeyen yapışmalarına ve yuvarlak granüllerin oluşumuna yol açacağından, harç ve havan tokmağı kullanılması imkansızdı.
Liyofilize numune tozu tartıldı (analitik terazi OHAUS Discovery, İsviçre) ve daha sonra bir çelik pres kalıbına yerleştirildi. Belirli bir kalıplama basıncında laboratuvar presleri (Angkor, Rusya ve Specac, İngiltere) kullanılarak,kan plazmasıpeletler ve böbrek peletler elde edildi. Her bir pelet kristali, belirli bir oranda yağ (trigliseritler), proteinler (albümin) ve fibrinojen içerir - bunların tümü normal veya glikasyonludur (diyabetik vakada). Bundan sonra kontrol grubundan numunelerin peletleri "diyabetik olmayan pelet" olarak anılacaktır ve aşağıdakilerden numunelerin peletleridiyabetik grup bundan böyle "diyabetik pelet" olarak anılacaktır.
2.2 THz Yüksek Çözünürlüklü Spektroskopi Deneysel Kurulumu
Durağan olmayan etkilere dayalı yüksek çözünürlüklü THz spektroskopisi, gaz ve buhar çok bileşenli gaz karışımlarının bileşen bileşiminin analiz edilmesini sağlar. Spektrometreler, yalnızca Doppler etkisi ile sınırlı bir çözünürlük ile teorik sınıra yakın hassasiyet sağlar ve hızlı süreçleri kaydedebilir. Hassasiyet, gaz basıncında önemli bir düşüşle bile korunur ve bazı gazlar için tarama modunda yaklaşık 0.2 ppb'dir (örneğin, 572 GHz frekansına yakın absorpsiyon hattı ölçümlerinde amonyak). Ayrıca, bir gaz karışımının bileşen bileşiminin yüksek güvenilirlikle belirlenmesini sağlar.12 Peletlerin termal bozunma ürünlerine ilişkin bir çalışma, 118 ila 178 GHz aralığında THz durağan olmayan gaz spektroskopisi yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Spektrometre, geri dalga lambasının frekansının ve faz kaymasının otomatik kontrolü, zaman alanında kayıt, ortalama alma ve spektroskopik geçiş sinyalinin işlenmesi için faz kilitli bir döngü kullanır. Cihaz, zaman alanında bir sinyal kaydeder. Numunelerin buharı aşağıdaki prosedür kullanılarak analiz edildi. Peletler, vakumla pompalanan, kademeli olarak ısıtılan bir test tüpü (240 dereceye kadar) kullanılarak bir test tüpüne yerleştirildi ve numunenin nihai termal bozunma ürünleri karışımı ölçüm hücresine bırakıldı. Bir veri dosyası genellikle spektrometrenin seçilen veya toplam çalışma aralığının kayıtlarını içerir. Bu nedenle, maddeler numunenin toplam spektrumunda görünen absorpsiyon çizgileriyle tanımlanabilir ve bir karışımdaki konsantrasyonların dinamikleri birkaç veri dosyasının karşılaştırılmasıyla izlenebilir. Maddeler, açık kaynaklı MW, mmw ve THz veritabanlarında aranarak tanımlandı.15,16
3 Yüksek Çözünürlüklü Terahertz Spektrometre Kullanılarak Kan Plazma Buharları ve Böbrek Buharları Analizi
THz-TDS sistemlerimizle, 0.2 ila 1.4 THz,17 spektral aralığında pelet iletimini ölçtük, ancak biyomoleküllerin ve özellikle gaz halindeki bozunma ürünlerinin bilgilendirici bir yanıtı olduğunu biliyoruz (rotasyonel absorpsiyon spektrumları) bu frekanslarda ve daha düşük seviyelerde olduğundan, THz yüksek çözünürlüklü gaz spektrometresi üzerinde ek bir çalışma gerçekleştirdik. Diyabetik insanda maddelerin tespit edilen emilim çizgilerikan plazmasıdiyabetik olmayan insan maddeleriyle örtüşürkan plazması, aseton hariç. Spektrometrenin çalışma frekansı aralığında (118 ila 178 GHz) yer alan birçok aseton absorpsiyon çizgisi vardır. Genellikle, çok bileşenli gaz karışımında maddenin varlığının kesin olarak belirlenmesi için bir maddenin bir miktar absorpsiyon çizgisini saptamak fazlasıyla yeterlidir. Asetonun absorpsiyon çizgisi ile absorpsiyon spektrumunun parçalarının kaydedilmesine bir örnek Şekil 1'de gösterilmiştir. Bir karbonhidrat metabolizması bozukluğu olduğunda aseton kanda görünebilir. Literatürde belirtildiği gibi diyabetli hastaların kanında -OH-bütirat ve asetoasetat bulunur, ancak daha sonra bu maddeler aseton ve karbondioksite ayrışır.18 Karbondioksitin dipol momenti yoktur; bu nedenle, rotasyonel geçişleri yoktur. Artan içeriği, yalnızca örneğin IR aralığındaki titreşim spektrumunu inceleyerek tespit edilebilir.
Karbonil sülfür (OCS), kükürt dioksit (SO2), formik asit (HCOOH), izosiyanik asit (HNCO) ve amonyak (NH3) gibi plazma buharı maddeleri hem diyabetik hem de diyabetik olmayan insan numunelerinde tespit edildi. Bazı durumlarda, katalog verilerinde bir madde (örneğin izosiyanik asit) için birden fazla satıra karşılık gelen numunenin spektrumlarında tespit edilen bir deneysel satır vardır (bkz. Tablo 2).15,16
Bu, katalogların, çizgilerin birkaç yüz kHz mertebesinde sonlu bir genişliğe sahip olması nedeniyle, bu deneyde çözülmeyen maddelerin aşırı ince yapıları hakkında veri içermesi gerçeğiyle açıklanmaktadır. İncelenen maddelerin elde edilen absorpsiyon çizgileri, kılcal kanın buharlarının absorpsiyon spektrumları ile örtüşür vekan plazmasıdiyabetli hastaların ve şartlı olarak sağlıklı katılımcıların önceki çalışmamızda yayınlanmıştır.19 Tespit edilen gaz halindeki maddeler, amino asitlerin kimyasal dönüşümünün ürünleri olarak numune hazırlama sırasında oluşmuş olabilir. Bu bileşiklerin teşhis değeri olup olmadığı sorusu araştırma gerektirir. Diyabetolojide klinik uygulamada, bu maddelerin içeriklerinin analizi henüz kullanılmamaktadır.
Buharlarkan plazmasısağlıklı sıçanların %'si karbonil sülfür (OCS), metantiyol (CH3SH), butironitril (C3H7CN), asetaldehit (CH3CHO) ve formik asit (HCOOH) içeriyordu. örnekkan plazmasıdiyabetik sıçanların oranı, aseton varlığı ile farklılık göstermiştir. Propionitrilin (C2H5CN) absorpsiyon hatlarına ek olarak, metil format (CH3OCHO) tespit edildi.
Sağlıklı ve diyabetik sıçanların kurutulmuş peletlerinin buhar örnekleri.böbrek dokularıçalışıldı. buharlarıböbrek dokususağlıklı sıçanların bir kısmı karbonil sülfür (OCS), kükürt dioksit (SO2), formik asit (HCOOH), izosiyanik asit (HNCO), etil format (C2H5OCHO) ve propilen glikol (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3) içerir. Diyabetik sıçanın buhar içeriğiböbrek dokususağlıklı sıçandan sadece karbonil sülfürün (OCS) değil, aynı zamanda izotopolog OCS'sinin-34 varlığıyla da farklıydı. Asetaldehit (CH3CHO), metantiyol (CH3SH), etilen sülfür (C2H4S), metanol (CH3OH) ve glikolaldehit (CH2ðOHÞCHO) diyabetik sıçan peletinin buharlarında da tespit edildi.böbrek dokusu(bkz. Şekil 2 ve Şekil 3).
Metanthiol gibi kükürt bileşiklerinin varlığı, kan proteini bileşimindeki kükürt amino asitlerinin (metionin, sistein ve sistin) termal ayrışması ile belirlenebilir. Metionin, insan organizmalarında sentezlenmeyen esansiyel bir amino asittir. Gıdalardan elde edilir ve sistein biyosentezi için bir kükürt kaynağıdır. Kükürt amino asitleri yaklaşık 240 dereceye kadar ısıtıldığında, bu maddelerin kütle spektrumunda metantiyol ve etilen sülfür (metiyonin bozunması) tespit edildi.20
4. Sonuç
İnsan ve sıçanın moleküler içeriğikan plazmasıve sıçanböbrek dokusuTHz yüksek çözünürlüklü spektrometre kullanılarak numunelerin termal bozunması sırasında incelenmiştir. Biyolojik numunelerin pelet olarak hazırlanma yöntemi sunuldu. Bu yöntem, numunelerin saklanması ve taşınması imkanı verir. Yüksek çözünürlüklü gaz spektroskopisi, eser konsantrasyonlarda gaz bileşenleri içeren biyolojikler de dahil olmak üzere herhangi bir kaynaktan çok bileşenli gaz karışımlarının içeriğinin belirlenmesine olanak tanır. Şeker hastalarında aseton tespit edildikan plazmasıörnekler. Diyabetik ve sağlıklı içerik farkı hakkında bilgikan plazmasıerkek ve sıçan ve diyabetik ve sağlıklı sıçanböbrek dokularıbuharların absorpsiyon rotasyonel spektrumlarından elde edilmiştir. THz yüksek çözünürlüklü spektroskopinin kullanımı, kan buharı örneklerinin bileşen içeriğinin kalitatif bir analizini sağlar veböbrek dokularıpeletler. Hastaların durumuna bağlı olarak önemli diyabet gaz belirteçlerinin konsantrasyonlarının kantitatif tahminini gerçekleştirme olasılığıileri araştırmalarda incelenmelidir.
