Konjenital Kalp Hastalığında Nöroproteksiyonun Güncel Durumu Bölüm 2

Mikroskobik görüntüler daha sonra ImageJ yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD, ABD) kullanılarak görüntü hesaplamasına tabi tutuldu. Hsp60'ın sinyali "x" ile çarpıldı.

Hsp60 insan vücudunda önemli biyolojik rol oynayan önemli bir protein molekülüdür. Son yıllarda yapılan araştırmalar Hsp60'ın varlığının insan hafızasıyla yakından ilişkili olduğunu göstermiştir.

Hsp60, esas olarak proteinin katlanması, açılması, stabilizasyonu ve bozulmasında rol oynayan moleküler bir şaperon proteinidir. Bu süreçler insan vücudunun normal metabolizması ve hücresel işlevi için çok önemlidir. Hsp60 aynı zamanda antioksidan, antiinflamatuar ve immünomodülatör etkilere de sahip olup, insan sağlığının korunmasında ve bağışıklık sisteminin dengesinin sağlanmasında büyük rol oynamaktadır.

Araştırma, Hsp60'ın hafıza oluşumu ve bakımında çok önemli bir rol oynadığını buldu. Öğrenme ve hafıza sürecinde beyin hücreleri çok sayıda Hsp60 molekülü üretir. Bu moleküller, öğrenme ve hafızanın düzgün bir şekilde ilerlemesini sağlamak için hücreleri dış ortamın müdahalelerinden ve hasarlarından koruyabilir. Ayrıca Hsp60, beyin hücrelerinin sinyal iletimini ve nöronların gelişimini değiştirerek insan düşüncesini ve davranışını da etkileyebilir ve biliş ve stres direnci üzerinde olumlu bir etkiye sahiptir.

Hsp60'ın rolü insan vücudu üzerinde olumlu etkiler göstermiş olsa da, insanların Hsp60'ın hem fazlalığının hem de eksikliğinin insan sağlığı üzerinde olumsuz etkileri olabileceğinin farkına varması gerekir. Bu nedenle, Hsp60'ın insan sağlığındaki konumunu ve rolünü daha iyi anlamak için Hsp60'ın insan vücudunun çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullarındaki mekanizmasını aktif olarak araştırmalı ve incelemeliyiz. Belleği geliştirmemiz gerektiği görülebilir ve Cistanche Deserticola hafızayı önemli ölçüde geliştirebilir, çünkü Cistanche Deserticola'nın antioksidan, antiinflamatuar ve yaşlanma karşıtı etkileri vardır, bu da beyindeki oksidasyonu ve inflamatuar reaksiyonları azaltmaya yardımcı olabilir, böylece beyni korur. sinir sisteminin sağlığı. Ek olarak, Cistanche Deserticola sinir hücrelerinin büyümesini ve onarımını da destekleyerek sinir ağlarının bağlantısını ve işlevini geliştirebilir. Bu etkiler hafızayı, öğrenme yeteneğini ve düşünme hızını geliştirmeye yardımcı olabilir ve ayrıca bilişsel işlev bozukluklarının ve nörodejeneratif hastalıkların gelişimini de önleyebilir.

Kısa süreli hafızayı geliştirmek için Bil'e tıklayın

"X" değeri şu şekilde belirlendi: Kontrol grubundaki mitokondriyal DNA sinyalinden "x" katlanmış Hsp60 sinyalinin çıkarılması, mitokondriyal DNA değerini sıfırdan küçük veya sıfıra eşit hale getirdi. Histon H2B'nin sinyali "y" ile çarpıldı.

"y" değeri şu şekilde belirlendi: kontrol grubundaki nükleer DNA sinyalinden "y" katlanmış histon-H2B sinyalinin çıkarılması, nükleer DNA değerini sıfıra eşit veya daha düşük hale getirdi. Çarpma nedeniyle arka plan sinyali yükselirse, çoğaltılan görüntünün kontrastı tüm örneklerde aynı koşullar için ayarlanabilir.

DsDNA boyama görüntüsünden, çoğaltılmış Hsp60 ve histon H2B'nin düzeltilmiş görüntüsü hariç, sonraki analiz için kullanıldı. "Eşik Ayarlama" işlevi kullanılarak bu görüntüler ikili hale getirildi. Boyutu 2 ila 20 µm2(circularity0,1–1,0) arasında değişen dsDNA puncta'yı seçtik ve bunlar "Partikülleri Analiz Et-Analiz Et" fonksiyonu kullanılarak sayıldı.

2.3. Elektron mikroskobu

Transfeksiyondan bir gün önce, HeLa hücreleri 600 hücre/μL yoğunlukta kaplandı. İlgili genlerin ekspresyonu, Lipofectamine RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifinde (ThermoFisher Scientific) Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak HeLa hücrelerinde susturuldu. üreticinin talimatlarına göre (10 nM'lik nihai RNA konsantrasyonuyla).

SiRNA yıkımından dört gün sonra hücreler fiksasyona tabi tutuldu. Hücre kültürü numuneleri, 0,1 M fosfat tamponu, pH 7,4, 37 °C'de %2 PFA ve %2 glutaraldehid ile sabitlendi, ardından 4'lü bir ortama yerleştirildi. ◦C buzdolabında 30 dk. Numuneler, 0.1 M fosfat tamponu içindeki %2 glutaraldehid içinde gece boyunca 4 ◦C'de sabitlendi. Numuneler üç kez 0,1 M fosfat tamponu ile 30 dakika boyunca yıkandı ve 4 ◦C'de 1 saat boyunca 0,1 M fosfat tamponu içerisinde %2 osmiyumtetroksit ile sonradan sabitlendi.

Numuneler, dehidre edilmiş, derecelendirilmiş etanol çözeltileri ile reçineye (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokyo, Japonya) aktarıldı ve 48 saat boyunca 60 ◦C'de polimerize edildi. Polimerize reçineler, bir ultramikrotom (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya) kullanılarak bir elmas bıçakla ultra ince 70-nm kesitler halinde kesildi ve daha sonra bakır ızgaralar üzerine monte edildi.

Kesitler oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %2 uranil asetat ile boyandı ve damıtılmış su ile yıkandı, ardından oda sıcaklığında 3 dakika boyunca bir kurşun boyama çözeltisi (Sigma-Aldrich, Tokyo, Japonya) ile ikincil boyama yapıldı.

Izgaralar bir transmisyon elektron mikroskobu (JEM-1400Plus, JEOL Ltd) altında gözlemlendi., Tokyo, Japonya) 80 kV (zebra balığı beyni) veya 100 kV (hücre) hızlanma voltajında ​​ve görüntüler bir yük bağlantılı cihaz (CCD) kamera (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) kullanılarak kaydedildi. .

2.4. İmmünoelektron Mikroskobu

Altın disklerdeki numuneler sıvı propan içerisinde -175 ◦C sıcaklıkta donduruldu. Numuneler dondurulduktan sonra, 24 saat boyunca -80 ◦C'de etanol içerisinde %1 tanik asit ve %2 damıtılmış su ile dondurularak ikame edildi.

Numuneler daha sonra 4 saat boyunca -20 ◦C'de tutuldu, ardından 1 saat boyunca 4 ◦C'de inkübasyon yapıldı. Daha sonra numuneler susuz etanolde 3 kez 30 dakika süreyle dehidre edildi. her seferinde 50:50 etanol ve reçine karışımı (LR beyaz: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) ile 4°C'de 1 saat süreyle infiltrasyon yapıldı. Örnekler taze %100 reçineye aktarılarak 4 ◦C'de 30 dakika inkübe edildi ve bu işlem üç kez tekrarlandı.

Numuneler taze %100 reçineye aktarıldı ve 50 ◦CO/N'de polimerize edildi. Polimerize reçineler, bir ultramikrotom (Ultracut UCT; Leica) kullanılarak bir elmas bıçakla 90 nm'de ultra ince kesitlere ayrıldı ve kesitler, nikel ızgaraları üzerine yerleştirildi. Izgaralar, 4 °CCO/N'de %1 BSA/PBS içinde anti-dsDNA antikoru (35I9 DNA)(1/800, Abcam, Kat# ab27156, RRID: AB_470907) ile inkübe edildi, ardından üç durulama yapıldı. Her biri 1 dakika boyunca %1 BSA/PBS.

Bunlar daha sonra oda sıcaklığında 2 saat boyunca {{0}} nm altın parçacıklarına (Keçi anti-Fare IgG poliklonal antikoru) konjüge edilmiş ikincil antikorla inkübe edildi. PBS ile durulandıktan sonra ızgaralar %2 glutaraldehit 0.1 M kakodilat tamponuna yerleştirildi.

Daha sonra ızgaralar kurutuldu ve ardından 15 dakika boyunca %2 uranil asetat ile ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında kurşun leke çözeltisi (Sigma-Aldrich) ile boyandı. Izgaralar, bir transmisyon elektron mikroskobu (JEM-1400) aracılığıyla gözlendi. artı; JEOLLtd.) 100 kV hızlanma voltajında. Dijital görüntüler bir CCD kamera (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) ile elde edildi.

3. Sonuçlar

3.1. Azalan TFAM veya GBA, Ektopik Mitokondriyal DNA'da Artışa Neden Olur

İlk olarak, TFAM proteininin siRNA tarafından yıkıldığı HeLa hücrelerinde mitokondriden türetilmiş sitoplazmik DNA'nın saptanmasına ilişkin bir örnek gösterdik (Şekil 1A). TFAM önemli bir mitokondriyal transkripsiyon faktörüdür ve aynı zamanda mitokondriyal DNA replikasyonu ve onarımında da işlev görür [20] .

Bu gendeki dizi polimorfizmlerinin Parkinson hastalığı ile ilişkili olduğu bildirilmektedir [21,22]. 3 günlük TFAM protein yıkımından sonra, HeLa hücrelerinin sitoplazmasında çok sayıda çift sarmallı DNA noktası tespit edildi.

Histonlar sitoplazmada nükleer kökenli DNA için pozitif belirteçlerdir ve sitoplazmada mitokondriyal DNA ve mitokondriyal kökenli DNA için negatif belirteçlerdir [23]. Bu noktalar histonlarla aynı yerde lokalize değildi; bu da bunların nükleerden türetilmiş DNA olmadığını düşündürmektedir. Ayrıca, bu sitoplazmik, ektopik DNA noktalarından bazıları, mitokondriyal matrisin bir işaretçisi olan Hsp60 ile birlikte lokalize olmadı, bu da bunların mitokondrinin dışında bulunduğunu gösterir (Şekil 1B, C).

Elektron mikroskobu ayrıca ektopik DNA'nın mitokondriden sızdığını da gösterdi (Şekil 2A, B). Özetle, TFAM yıkımı nedeniyle sitoplazmadaki ektopik DNA noktalarındaki artış, mitokondriden sızan mitokondriyal DNA'dan kaynaklanıyordu. İkinci olarak, GBA proteininin siRNA tarafından yıkıldığı HeLa hücrelerinde mitokondriden türetilmiş sitoplazmik DNA'nın tespitinin başka bir örneğini gösterdik. (Şekil 1A).

GBA, Gaucher hastalığına neden olan gendir, ancak GBA'nın heterozigot mutasyonu aynı zamanda Parkinson hastalığı için de bir risk faktörüdür [24]. 3 günlük GBA protein yıkımının ardından HeLa hücrelerinin sitoplazmasında çok sayıda çift sarmallı DNA noktası tespit edildi. Bazı DNA noktaları histonlarla aynı yerde bulunuyordu, bu da onların nükleer kökenli DNA olduklarını akla getiriyordu.

Diğer DNA noktalarının histonlarla aynı yerde lokalize olmaması onların nükleerden türetilmiş DNA değil, mitokondriden türetilmiş DNA olduğunu akla getiriyor (Şekil 1D). Özetle, GBA yıkımı nedeniyle sitoplazmadaki ektopik DNA noktalarındaki artış, en azından kısmen mitokondriden sızan mitokondriyal DNA'ya bağlıydı.

For more information:1950477648nn@gmail.com