Zerumbone, Zingiber Officinale Roscoe'nun Tropikal Zencefil Seskiterpeni, B16F10 Hücrelerinde -MSH'nin İndüklediği Melanogenezi Azaltır Bölüm 1

Soyut:Zingiberaceae familyasının aktif bir bileşeni olan Zerumbone'un (ZER), anti-enflamatuar, anti-alerjik, anti-mikrobiyal ve anti-kanser gibi çeşitli biyolojik aktiviteler sergilediği gösterilmiştir; ancak, anti-melanojenik özellikler açısından incelenmemiştir. Bu çalışmada, ZER ve Zingiber'in -melanosit uyarıcı hormon ( -MSH) ile uyarılan fare melanojenik B16F10 hücrelerinde melanin birikimini önemli ölçüde azaltan officinal (ZO) özütleri olduğunu gösterdik. Ayrıca, ZER'in melanin birikimini bastırdığı moleküler mekanizmayı aydınlatmak için, melanogenez ile ilişkili transkripsiyon faktörü, mikroftalmi ile ilişkili transkripsiyon faktörü (MITF) ve tirozinaz, tirozinaz ile ilişkili protein 1 gibi hedef genlerinin ifadesini analiz ettik ( -MSH tarafından uyarılan B16F10 hücrelerinde TYRP1) ve tirozinaz ile ilişkili protein 2 (TYRP2). Burada, ZER'in -MSH stimülasyonu üzerine melanojenik genlerin MITF aracılı ifadesini inhibe ettiğini bulduk. Ek olarak, farklı konsantrasyonlarda zerumbone ve ZO ile muamele edilen hücreler, MITF'nin bozunma mekanizmasında yer alan, artan hücre dışı sinyalle düzenlenen kinazlar 1 ve 2 (ERK1/2) fosforilasyonu gösterdi. U0126 kullanılarak ERK1/2'nin farmakolojik inhibisyonu, ZER'nin anti-melanojenik etkisini yeterince tersine çevirdi, bu da anti-melanojenik aktivitesi için ERK1/2'nin artan fosforilasyonunun gerekli olduğunu düşündürdü. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar ZER ve ZO ekstraktlarının anti-melanojenik etkilerinden dolayı cilt beyazlatıcı kozmetiklerde aktif bileşenler olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

İlgili araştırmalara göre cistanche, "ömrü uzatan mucizevi bitki" olarak bilinen yaygın bir bitkidir. Ana bileşenikistanositgibi çeşitli etkilere sahiptir.antioksidan,antienflamatuvarve bağışıklık fonksiyonunun teşviki. arasındaki mekanizmacistancheVecilt beyazlatmakcistanche'nin antioksidan etkisinde yatmaktadır.glikozitler. İnsan derisindeki melanin, tirozinin oksidasyonu ile üretilir.tirozinazve oksidasyon reaksiyonu oksijenin katılımını gerektirir, bu nedenle vücuttaki oksijensiz radikaller melanin üretimini etkileyen önemli bir faktör haline gelir. Cistanche, bir antioksidan olan ve vücuttaki serbest radikallerin oluşumunu azaltabilen cistanoside içerir, böylecemelanin üretiminin engellenmesi.

Cistanche Nasıl Kullanılır'a tıklayın

Daha fazla bilgi için:

david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501

anahtar kelimeler:zemberek; Zingiber memuru Roscoe; melanogenez; MITF; ERK1/2

1. Giriş

Epidermal melanositler tarafından melanin üretimi olan melanogenez, ultraviyole (UV) radyasyona maruz kalma üzerine keratinositlerden salgılanan -melanosit uyarıcı hormon ( -MSH) tarafından uyarılır [1,2]. Kök hücre faktörü (SCF), postnatal kutanöz melanogenezi sürdürmek için melanosit göçünü, proliferasyonunu ve farklılaşmasını sıkı bir şekilde kontrol eden başka bir melanojenik faktördür [3]. Melanojenik bir transkripsiyon faktörü olan mikroftalmi ile ilişkili transkripsiyon faktörü (MITF), melanokortin 1 reseptörü yoluyla -MSH uyarımı üzerine cAMP-PKA-CREB (siklik adenozin monofosfat-protein kinaz A-cAMP yanıt elemanı bağlayıcı protein) sinyal yolu aracılığıyla aktive edilir. (MC1R), epidermal melanositlerin sitoplazmik zarlarında [4]. Forskolin ve IBMX (3-izobütil-1-metilksantin) gibi çeşitli kimyasalların cAMP-PKA-CREB sinyal yolunu aktive ederek melanogenezin indüklenmesine yol açtığı bilinmektedir [5]. Birkaç çalışma, onkojenezin moleküler mekanizmasında yer alan hücre dışı düzenlenmiş kinazlar 1 ve 2'nin (ERK1/2) sürekli aktivasyonunun, Ser73'te MITF fosforilasyonunu ve ubikuitin bağımlı proteoliz yoluyla müteakip bozunmasını desteklediğini ortaya koymuştur [6,7 ]. Gerçekten de, seçici bir ERK1/2 yolağı inhibitörü olan U0126'nın, MITF ekspresyonunu ve tirozinaz aktivitesini arttırarak melanin üretimine yol açtığı bildirilmiştir [6]. Stabilize ve aktive edilmiş MITF, tirozinaz, tirozinaz ile ilişkili protein 1 (TYRP1) ve tirozinaz ile ilgili protein 2 (TYRP2) gibi melanojenik genlerin ekspresyonunu arttırır. Melanogenezin ilk adımı olan tirozinin 3,4-dihidroksifenilalanine (L-DOPA) dönüşümü, tirozinaz tarafından katalize edilir. Tirosinazla ilişkili proteinler (TRP'ler) daha fazla oksidasyon ve tautomerizasyon reaksiyonlarını katalize eder [8]. Melanin sentezinden sonra, olgun melanin, hücreleri UV radyasyonundan korumak için epidermal melanositlerden bazal keratinositlerin sitoplazmasına taşınır [2].

Anormal derecede artan melanogenez, cilt kanseri, kloazma ve çiller gibi çok sayıda cilt bozukluğuna neden olur [4]; bu nedenle, tirozinazın katalitik aktivitesini veya ERK1/2 veya melanojenik genlerin MITF aracılı transkripsiyonu dahil olmak üzere melanogenezdeki sinyal yollarının düzenleyicilerini hedefleyen küçük moleküller veya doğal ürünler, kozmetikte yararlanılacak aktif bileşenler olarak tanımlanmıştır. endüstri. Kojik asit, arbutin ve niasinamid gibi birkaç küçük molekül, anti-melanojenik aktivitelerinden dolayı kozmetik bileşenler olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. Bununla birlikte, raporlar, kojik asidin genotoksik aktivitesi nedeniyle sitotoksisite, dermatit, cilt kanseri ve hepatoselüler karsinom dahil olmak üzere birçok yan etkiye neden olduğunu göstermiştir [9]. Ayı üzümü bitkisinden izole edilen arbutin, hiperpigmentasyon bozukluğunu tedavi etmek için kullanılmasına rağmen, son zamanlarda çeşitli yan etkileri nedeniyle kozmetik bir bileşen olarak kullanımı kısıtlanmıştır [9]. Niasinamidin anti-melanojenik aktiviteye sahip olduğu ve bu aktivitenin melanositlerden çevre keratinositlere melanozom transferini inhibe ederek gerçekleştirildiği bildirilmiştir [10]. Bu nedenle kozmetik endüstrisinde genellikle cilt beyazlatıcı bir bileşik olarak kullanılmıştır. Çeşitli yan etkileri olan bilinen cilt beyazlatma ajanlarının sınırlamalarının üstesinden gelmek için, doğal kaynaklardan elde edilen güvenli cilt beyazlatma bileşenlerinin geliştirilmesi önemlidir. Örneğin, -thujaplicin, linderanolide B, 4-butyl resorsinol ve plumbagin, tirozinaz inhibitör etkileri nedeniyle anti-melanojenik bileşikler olarak tanımlanmıştır [4,11]. Nobiletin, withaferin A, sesamol ve chaetocin, melanogenez yolundaki sinyalleşme ara maddelerini modüle ederek anti-melanojenik özellikler sergiler [11].

Zerumbone (ZER), Zingiber zerumbet Smith ve Zingiber officinal Roscoe gibi Zingiberaceae familyasına ait bitkilerin uçucu uçucu yağlarından izole edilen doğal bir üründür [12]. Çeşitli çalışmalar, ZER'in antimikrobiyal, antioksidan, anti-diyabetik, antikanser, anti-enflamatuar, antialerjenik ve anti-anjiyojenik aktiviteler dahil olmak üzere geniş bir biyolojik aktivite yelpazesine sahip olduğunu göstermiştir [12]. İlginç bir şekilde, ZER'nin, nükleer faktör-E'nin aktivasyonu yoluyla reaktif oksijen türlerini (ROS) temizleme yeteneği sayesinde, cilt keratinositlerinde ultraviyole A (UVA) kaynaklı oksidatif hasara karşı koruyucu bir etki gösterdiği gösterilmiştir{{8} }ilgili faktör-2 (Nrf2) [1,13]. Bu, ZER'in cilt bakım kozmetiklerinde fonksiyonel bir katkı maddesi olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, ZER etkisinin anti-melanojenik özelliklerinin ayrıntılı mekanizması henüz çalışılmamıştır.

Bu çalışmada, ZER ve Zingiber officinal (ZO) ekstraktının -MSH ile uyarılan melanogenez üzerindeki inhibitör etkileri ve bunların altında yatan mekanizmalar incelenmiştir. Burada, ZER'nin, ERK1/2'nin fosforilasyonunu düzenleyerek ve melanojenik genlerin MITF aracılı ekspresyonunu inhibe ederek -MSH'nin neden olduğu melanogenezi önemli ölçüde baskıladığını gösteriyoruz.

2. Sonuçlar

2.1. Zerumbone (ZER), B16F10 Fare Melanom Hücrelerinde -MSH'nin İndüklediği Melanogenezi Bastırır

Zerumbone'un (ZER) anti-melanojenik etkisini incelemek için başlangıçta sitotoksisitesini hem B16F10 hem de HaCaT hücrelerinde değerlendirdik. ZER'in kimyasal yapısı Şekil 1A'da gösterilmiştir. ZER'in 20 µM'nin üzerindeki konsantrasyonlarda güçlü sitotoksik etki gösterdiği, 20 µM'nin altındaki konsantrasyonlarda ise ZER'in her iki hücre hattında da sitotoksik etki göstermediği gözlendi (Şekil 1B). Daha sonra, B16F10 hücrelerinde -melanosit uyarıcı hormon ( -MSH) kaynaklı melanin birikimi ve salgılanması üzerinde ZER'nin inhibe edici etkilerini araştırdık. ZER'in, -MSH kaynaklı hücre içi melanin birikimini ve bunun kültür ortamına salgılanmasını güçlü bir şekilde baskıladığı gösterildi (Şekil 1C, D). Ayrıca, ZER'in melanogenezi cilt beyazlatıcı kozmetiklerin iyi bilinen aktif bileşenleri olan 1 mM arbutin veya 0.2 mM kojik asitten daha etkili bir şekilde zayıflattığını bulduk (Şekil 1D). ZER'in insan hücrelerinde melanogenezi baskılamak için yeterli olup olmadığını açıklamak için melanin üreten G361 insan melanom hücrelerini kullandık. Şekil 1E'de gösterildiği gibi ZER, kök hücre faktörü (SCF) kaynaklı hücre dışı ve hücre içi melanin içeriğini önemli ölçüde azaltır. Bu sonuçlar, ZER'nin melanojenik fare B16F10 ve insan G361 hücrelerinde anti-melanojenik aktivitesini doğrulamaktadır.

2.2. Zerumbone, G361 İnsan Melanom Hücrelerinde Melanogenesis Transkripsiyon Faktörü, MITF ve Hedef Genlerinin Gen İfadesini Bastırır 

Endotelin-1 ve SCF sinyalinin, insan melanositlerinde ve çeşitli melanom alt tiplerinde melanogenezde temel roller oynadığı bildirilmiştir [3,14–16]. Bu çalışmada, ZER'in fare B16F10 ve insan G361 melanom hücrelerinde melanojenik uyaranlar, -MSH ve SCF üzerine melanogenezi baskıladığını bulduk (Şekil 1).

Bu nedenle, G361 insan melanom hücrelerinde SCF uyarımı üzerine melanogenezle ilişkili genlerin ve proteinlerin ekspresyon seviyelerindeki değişiklikleri ölçtük. ZER'in, SCF stimülasyonundan sırasıyla 2-4 saat ve 24-48 saat sonra SCF kaynaklı MITF ve tirozinaz protein ekspresyonunu zayıflattığını bulduk (Şekil 2A). Ek olarak, MITF, tirozinaz ve tirozinaz ile ilgili protein 1 (TYRP1) gibi melanogenez ile ilgili genlerin gen ekspresyonu, ZER ile işlenmiş G361 hücrelerinde baskılanmıştır (Şekil 2B, C). Bu sonuçlar, SCF stimülasyonu üzerine melanogenezle ilişkili genlerin ekspresyonu için en yüksek zamanı ortaya çıkardı; maksimal MITF mRNA indüksiyonu 1-2 saat içinde gözlendi ve tirozinaz ve TYRP1'in mRNA seviyelerinin SCF stimülasyonundan 24-48 saat sonra maksimuma ulaştığı gözlendi.

2.3. Zerumbone, Fare B16F10 Hücrelerinde Melanojenik Genleri ve Enzimlerin Ekspresyonunu Bastırır

ZER'in melanogenezi baskıladığı moleküler mekanizmayı araştırmak için, melanogenez transkripsiyon faktörü MITF'in gen ekspresyonunu ve tirozinaz ile ilişkili protein 1 (TYRP1), tirozinaz ve tirozinaz ile ilgili protein 2 (TYRP2) gibi hedef genlerini ölçtük. ZER'in yokluğunda veya varlığında. SCF ve -MSH stimülasyonu üzerine melanogenezle ilişkili genlerin ekspresyonunun zirve zamanı, sırasıyla insan G361 (Şekil 2) ve fare B16F10 melanom hücreleri [4] için bilindiğinden, MITF, tirozinaz, TYRP1 ve TYRP2 ekspresyonunu daha da ölçtük. -MSH ile 2 saat veya 48 saat inkübasyondan sonra ZER ile muamele edilmiş fare B16F10 melanom hücrelerinde. Şekil 3A, ZER'nin B16F10 hücrelerinde -MSH kaynaklı MITF, TYRP1, TYRP2 ve tirozinaz ekspresyonunu azaltmak için yeterli olduğunu göstermektedir. Benzer şekilde MITF, tirozinaz ve TYRP2 protein ekspresyon seviyeleri ZER tedavisi sonrasında azaldı. CREB'nin protein kinaz A (PKA) aracılı fosforilasyonu, -MSH stimülasyonu üzerine transkripsiyon seviyesinde MITF'yi artıran ana sinyal yoludur [4]. Bu nedenle, burada CREB'nin ZER tarafından fosforilasyonunun azalmasının MITF'in baskılanmasına aracılık edip edemeyeceğini analiz ettik. -MSH kaynaklı CREB fosforilasyonunun ZER tedavisinden etkilenmediğini bulduk, bu da ZER'in -MSH kaynaklı MITF ifadesini PKA-CREB sinyal yolu ekseninden bağımsız olarak baskıladığını düşündürdü (Şekil 3B). Tirosinaz, melanin sentezini düzenleyen hız sınırlayıcı bir enzim olduğundan [2,4,11], hücre içi tirozinaz protein seviyelerini ve arbutin, kojik asit ve ZER tedavisi üzerindeki enzimatik aktivitesini ayrıca analiz ettik. Şekil 3C, ZER'nin B16F10 hücrelerinde -MSH kaynaklı tirozinaz protein seviyelerini yeterince azalttığını göstermektedir. Ek olarak, Şekil 3D, 10 uM ZER'in L-DOPA oksidasyonunu tirozinaz inhibitörleri, arbutin ve kojik asitten daha etkili bir şekilde bastırdığını ortaya koyar; . Bu sonuçlar, ZER'nin, melanogenez ile ilişkili bir transkripsiyon faktörü olan MITF'nin gen ekspresyonunu ve bunun hedef genlerini baskılayarak -MSH aracılı melanogenezi zayıflattığını göstermektedir.

2.4. Zerumbone'un Anti-Melanojenik Etkisi ERK1/2'nin Fosforilasyonu Yoluyladır

Protein kinaz B'nin (AKT) ve hücre dışı sinyalle düzenlenen kinazların (ERK1/2) büyüme faktörleri veya melanojenik uyaranlar tarafından aktivasyonunun, MITF ve hedef genlerinin ekspresyonunun azalması yoluyla melanogenezi baskıladığı bilinmektedir [11]. ERK1/2 sinyal yolağına yanıt olarak Ser73 ve Ser409'da MITF'in fosforilasyonu, proteazoma bağlı bozulmasını teşvik eder [17,18]. Bu nedenle, ZER'nin B16F10 fare ve G361 insan melanom hücrelerinde ERK1/2 fosforilasyonunu düzenleyip düzenlemediğini araştırdık. ZER tedavisinde zamana ve doza bağlı bir şekilde ERK1/2'nin (p-ERK1/2) fosforilasyonu arttı, ancak toplam ERK1/2 (T-ERK1/2) gözlenmedi (Şekil 4A, B). İlginç bir şekilde, ERK1/2'nin fosforilasyonunun fare B16F10 ve insan G361 melanom hücrelerinde (Şekil 4A) ZER tedavisinden 10–30 dakika ve 1–2 saat sonra hızla arttığı gözlendi. Ancak, AKT ve MEK'in fosforilasyonu ZER tedavisi sırasında gözlenmedi, bu da ZER kaynaklı ERK1/2 fosforilasyonunun MITF'yi baskılayabileceğini düşündürür (Şekil 4B). ERK1/2 fosforilasyonu, MITF'in [17,18] fosforilasyonunu ve proteasomal degradasyonunu teşvik ettiğinden, proteazom inhibitörünün, MITF'nin ZER tarafından indirgenmesini önleyip önlemediğini araştırdık. ZER tarafından MITF'in bastırılması, MG132'nin varlığında gözlenmedi, bu da ZER'in proteasomal bozunma yoluyla MITF ifadesini azalttığını doğruladı (Şekil 4C). Daha sonra, ZER'nin MITF'yi ERK1/2'nin hedef kalıntısı olan Ser73'te fosforile edip etmediğini araştırdık. Fosforile MITF'yi tespit etmek için hücreler -MSH ve MG132'ye maruz bırakıldı. Burada fosforile MITF'nin (Ser73) -MSH ve MG132 varlığında ZER tarafından önemli ölçüde arttığını bulduk (Şekil 4D). Seçici bir mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) inhibitörü [19] olan U0126, ZER kaynaklı MITF fosforilasyonunu ortadan kaldırdı (Şekil 4D). Ayrıca, tüm hücre lizatlarındaki (WCL) toplam MITF protein seviyeleri, MG132'nin varlığında ZER ve U0126 tarafından değiştirilmedi (Şekil 4D). Bu sonuçlar, ERK1/2-aracılı MITF (Ser73) fosforilasyonu ve proteazomal bozunmanın, MITF'nin ZER aracılı baskılanmasında kritik bir mekanizma olduğunu gösterir. Ek olarak, Şekil 4E, U0126'nın ZER ile işlenmiş hücrelerde azaltılmış MITF protein seviyelerini önemli ölçüde geri kazandırdığını göstermektedir. Tutarlı bir şekilde, ZER tarafından azalan hücre içi melanin içeriği, U0126 tarafından yaklaşık yüzde 40'a geri yüklendi (Şekil 4F), bu da ZER'nin anti-melanojenik etkisi için ERK1/2 aktivasyonunun gerekli olduğunu düşündürüyor.

2.5. Zingiber Offificinale (ZO) Ekstraktlarının Anti-Melanojenik Etkisi

ZER, Zingiber zerumbet ve Zingiber officinal gibi Zingiberaceae familyasının çeşitli bitki türlerinden elde edilen bir fitokimyasaldır [12]. Bu nedenle, başlangıçta B16F10 ve HaCaT hücrelerinde ZO ekstraktının yokluğunda veya varlığında hücre canlılığını ölçtük. Şekil 5A, hücre canlılığının ZO ekstrakt işlemi ile değiştirilmediğini göstermektedir. Zingiber officinal (ZO) özütünün anti-melanojenik etkilerini ayrıca analiz ettik. MITF ve hedef melanojenik genlerinin ekspresyonu, aktifleştirilmiş ERK1/2 sinyal yolu (Şekil 2 ve 3) yoluyla ZER tarafından azaltıldığı için, ZO ekstraktının -MSH kaynaklı MITF'yi ve B16F10 hücrelerinde hedef melanojenik protein ekspresyonunu baskılayıp baskılamadığını kontrol ettik. ZER'in anti-melanojenik etkisine benzer şekilde, -MSH kaynaklı MITF, tirozinaz ve TYRP2, ZO ekstresi tarafından doza bağımlı bir şekilde önemli ölçüde azaltılmıştır (Şekil 5B). İlginç bir şekilde, ERK1/2 fosforilasyonu ZO ekstraktı ile tedavi edilen hücrelerde de arttı (Şekil 5B). MITF'nin ve tirozinaz, TYRP1 ve TYRP2 gibi hedef genlerinin ifadesi, 5 μg/μL ZO ekstraktı tedavisi (Şekil 5C) üzerine önemli ölçüde azaldı. Ayrıca, hem hücre dışı hem de hücre içi melanin içeriği, 5 ug/uL ZO ekstraktı tedavisi (Şekil 5D) üzerine önemli ölçüde yaklaşık yüzde 40'a düşürüldü. Ek olarak, ZO özü (Şekil 5E) ile tedavi edilen hücrelerde azalmış tirozinaz aktivitesi gözlendi. Bu sonuçlar, Zingiber officinal (ZO) ekstraktının, MITF aracılı melanojenik gen ekspresyonunu zayıflatarak melanogenezi baskıladığını göstermektedir.

Daha fazla bilgi için: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501